wp.pl
wp.pl
Najpopularniejszy w Polsce portal o finansach i biznesie
Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 1613343 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 1613343 T3


EP 1613343 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 11.03.2004 04719724.9 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) (19) PL (11) PL/EP (13) (51) 1613343 T3 Int.Cl. A61K 38/28 (2006.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 07.12.2016 Europejski Biuletyn Patentowy 2016/49 EP 1613343 B1 Tytuł wynalazku: Koniugaty polipeptyd insuliny - oligomer, koniugaty polipeptyd proinsuliny-oligomer i sposoby ich syntetyzowania (30) (43) Pierwszeństwo: 14.03.2003 US 389499 Zgłoszenie ogłoszono: 11.01.2006 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/02 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.05.2017 Wiadomości Urzędu Patentowego 2017/05 (73) Uprawniony z patentu: Biocon Limited, Bangalore, IN PL/EP 1613343 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: NNOCHIRI N. EKWURIBE, Cary, US BALASINGAM RADHAKRISHNAN, Chapel Hill, US RICHARD SOLTERO, Holly Springs, US MONICA PUSKAS, Spring Hope, US DITI SANGAL, Raleigh, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Tadeusz Rejman KANCELARIA PATENTOWA REJMAN S.C. ul. Hubska 96/100 50-502 Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). EP 1 613 343 B1 Opis Dziedzina Wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy koniugatów insuliny i sposobów syntetyzowania takich koniugatów. Tło Wynalazku [0002] Polipeptyd insuliny jest głównym hormonem odpowiedzialnym za kontrolę transportu, wykorzystanie i magazynowanie glukozy w organizmie. Komórki wysp trzustkowych wydzielają jednołańcuchowy prekursor insuliny znany jako proinsulina. Proteoliza insuliny skutkuje usunięciem pewnych podstawowych aminokwasów w łańcuchu proinsuliny z przyłączeniem peptydu (peptydu C) dając biologicznie aktywny polipeptyd insuliny. [0003] Cząsteczka insuliny została wysoce zakonserwowana na drodze ewolucji i ogólnie składa się z dwóch łańcuchów aminokwasowych połączonych mostkami disiarczkowymi. W naturalnym stanie, u człowieka, dwułańcuchowa cząsteczka insuliny (masa cząsteczkowa 5,800 Daltonów), łańcuch A składa się z 21 reszt aminokwasowych i ma na końcu aminowym glicynę i łańcuch B ma 30 reszt aminokwasowych i na końcu aminowym fenyloalaninę. [0004] Insulina może istnieć jako monomer lub może agregować w dimer lub heksamer utworzony z trzech dimerów. Biologiczna aktywność tj. zdolność do wiązania do receptorów i pobudzania biologicznych czynności insuliny, istnieje w monomerze. [0005] Cukrzyca jest biologicznym zaburzeniem obejmującym nieprawidłowy metabolizm węglowodanów. Cukrzyca wynika z niewystarczającego wytwarzania lub zmniejszonej wrażliwości na insulinę. U osób z cukrzycą prawidłowa zdolność do wykorzystania glukozy jest zahamowania, prowadząc do podwyższonych poziomów cukru we krwi (hiperglikemia). Gdy glukoza gromadzi się we krwi, nadmierne poziomy cukru są wydzielane z moczem (glikozuria). Inne objawy cukrzycy obejmują zwiększoną objętość i częstotliwość oddawania moczu, pragnienie, swędzenie, głód, utratę masy ciała i osłabienie. [0006] Istnieją dwie odmiany cukrzycy, insulino-zależna cukrzyca Typu I lub IDDM. IDDM była dawniej nazywane ?cukrzycą młodzieńczą?. W IDDM insulina nie jest wydzielana przez trzustkę i musi być dostarczona z zewnętrznego 1 EP 1 613 343 B1 źródła. Cukrzyca Typu II lub dorosłych może zwykle być kontrolowana za pomocą diety, chociaż w pewnych zaawansowanych przypadkach może być konieczne podanie insuliny. [0007] Nieleczona cukrzyca prowadzi do ketozy, nagromadzenia ketonów we krwi, które są produktami rozpadu tłuszczów. Po ketozie występuje nagromadzenie kwasu we krwi (kwasica), mdłości i wymioty. Gdy toksyczne produkty rozłożonych węglowodanów i metabolizmu tłuszczów dalej nagromadzają się, pacjent zapada w śpiączkę cukrzycową, która prowadzi do śmierci. Zanim wyizolowano insulinę w latach 1920-tych, większość pacjentów umierała w ciągu krótkiego czasu od wystąpienia choroby. [0008] Zastosowanie insuliny jako leczenia dla cukrzyków sięga roku 1922, gdy Banting i in. ("Pancreatic Extracts in the Treatment of Diabetes Mellitus," Can. Med. Assoc. J., 12:141-146 (1922)) wykazali, że czynny wyciąg z trzustki wykazuje terapeutyczne działania u psów z cukrzycą. W tym samym roku, leczenie pacjenta z cukrzycą za pomocą wyciągów trzustkowych zaskutkowało zasadniczym, ratującym życie klinicznym ulepszeniem. [0009] Jeszcze do niedawna do leczenia cukrzycy u ludzi stosowane były prawie wyłącznie insulina wołowa i świńska. Jednak obecnie znane są liczne odmiany insuliny pomiędzy gatunkami. Każda odmiana różni się od naturalnej ludzkiej insuliny w występowaniu podstawienia (eń) aminokwasowych w jednej lub więcej pozycjach w łańcuchu A i/lub B. Pomimo tych różnic większość ssaczych insulin ma porównywalną biologiczną aktywność. Pojawienie się technologii rekombinacji umożliwiło wytwarzanie ludzkiej insuliny na skalę komercyjną (np, insulina Humulin? komercyjnie dostępna u Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN) lub genetycznie zaprojektowanej insuliny o aktywności biologicznej porównywalnej do naturalnej ludzkiej insuliny. [0010] Leczenie cukrzycy zwykle wymaga regularnych wstrzyknięć insuliny. Ze względu na niewygodę związaną z wstrzykiwaniem insuliny podjęto ogromny wysiłek, aby ulepszyć podanie i bioasymilację insuliny. [0011] Poczyniono próby, aby dostarczyć insulinę drogą doustną. Problemy związane z doustnym podaniem insuliny, aby osiągnąć euglikemię u pacjentów z cukrzycą są dobrze udokumentowane w literaturze farmaceutycznej i 2 EP 1 613 343 B1 medycznej. Enzymy trawienne w przewodzie pokarmowym szybko rozkładają insulinę, skutkując biologicznie nieaktywnymi produktami rozkładu. Na przykład w żołądku, doustnie podana insulina zostaje poddana enzymatycznej proteolizie i kwasowej degradacji. Porównywalny proteolityczny rozkład insuliny występuje w jelicie. W świetle przewodu pokarmowego insulina jest atakowana przez różne enzymy, w tym enzymy żołądkowe i trzustkowe, egzo- i endopeptydazy i peptydazy rąbka szczoteczkowego. Nawet jeśli insulina przetrwa ten enzymatyczny atak, biologiczne bariery, które muszą zostać przecięte zanim insulina będzie mogła dotrzeć do swoich receptorów in vivo mogą ograniczyć jej biodostępność po doustnym podaniu insuliny. Na przykład insulina może posiadać słabą przenikalność przez błony, co ogranicza jej zdolność do przechodzenia ze światła jelita do strumienia krwi. [0012] Poczyniono pewne starania, aby zapewnić doustną postać insuliny dostarczając koniugaty insulina-oligomer. Ludzka insulina i wiele blisko związanych insulin, które są stosowane leczniczo zawierają trzy reszty aminokwasowe przenoszące wolne pierwszorzędowe grupy aminowe. Wszystkie trzy pierwszorzędowe grupy aminowe, głównie N-końcowe (grupy alfa aminowe) łańcuchów A i B ( GlyA1 i PheB1) grupa epsilon-aminowa LysB29, mogą być zmodyfikowane przez sprzężenie z oligomerami. W zależności od warunków reakcji, N-acylacja niezabezpieczonej insuliny prowadzi do złożonej mieszaniny mono-, di- i trikoniugatów (np. mono-skoniugowana insulina w GlyA1, mono-skoniugowana insulina w PheB1, mono-skoniugowana insulina w LysB29, di-skoniugowana insulina w GlyA1 i PheB1, di-skoniugowana insulina w GlyA1 i LysB29, mono-skoniugowana insulina w PheB1 i LysB29, i tri-skoniugowana insulina w GlyA1, PheB1, i LysB29). Gdy pożądany jest określony koniugat, na przykład mono-skoniugowana insulina w LysB29, może być uciążliwe i/lub drogie, aby rozdzielić (oczyścić) taką złożoną mieszaninę koniugatów w celu otrzymania pożądanego koniugatu . [0013] W rezultacie podjęto różne wysiłki, aby wybiórczo zsyntetyzować pożądany koniugat insuliny. Na przykład Muranishi i Kiso, w japońskim Zgłoszeniu Patentowym 1-254,699, zaproponowali pięcio-etapową syntezę do przygotowania pochodnych kwasów tłuszczowych i insuliny. Grupy A1- i B13 EP 1 613 343 B1 aminowe insuliny są zabezpieczone (lub zablokowane) za pomocą azydku pmetoksybenzoksykarbonylu (pMZ). Po acylacji estrem kwasu tłuszczowego, grupy zabezpieczające (blokujące) są usuwane, aby dostarczyć insulinę monoacylowaną kwasem tłuszczowym w Lys(B29). Jako kolejny przykład Amerykański Patent Nr 5,750,497 wg Havelund i in. proponuje traktowanie ludzkiej insuliny odczynnikiem Boc (np. diwęglanem di-tert-butylu), aby utworzyć (A1,B1)-diBoc ludzką insulinę, tj. ludzką insulinę, w której N-końce obu łańcuchów A i B są zabezpieczone grupą Boc. Po opcjonalnym oczyszczeniu, np. za pomocą HPLC, lipofilowa grupa acylowa jest wprowadzana do ?aminowej grupy LysB29 przez umożliwienie produktowi na reakcję z estrem Nhydroksysukcynoimidowym o wzorze X-OSu, gdzie X oznacza lipofilową grupę acylową, która ma zostać wprowadzona. W końcowym etapie kwas trifluorooctowy jest stosowany do usunięcia grup Boc i produkt, ludzka N ?BZ9-X insulina, jest izolowana. [0014] Różne inne wysiłki podjęto, aby preferencyjnie zsyntetyzować pożądany koniugat insuliny dostarczając mieszaninę koniugatów, w której pożądany koniugat insuliny jest preferowanym koniugatem. Na przykład Amerykański Patent Nr 5,646,242 wg Baker i in. proponuje reakcję, która jest przeprowadzana bez zastosowania aminowych grup zabezpieczających. Bakier proponuje reakcję aktywowanego estru tłuszczowego z ?-aminową grupą insuliny w zasadowych warunkach w polarnym rozpuszczalniku. Acylacja grupy ?-aminowej zależy od zasadowości reakcji. W pH wyższym niż 9.0, reakcja preferencyjnie acyluje grupę ?-aminową B29-lizyny w porównaniu do grup ?-aminowych. Przykłady 1 do 4 podają wydajności reakcji mono-skoniugowanej insuliny jako procent początkowej ilości insuliny między 67.1 % a 75.5%. W Przykładzie 5, Baker proponuje acylację ludzkiej proinsuliny za pomocą palmitynianu N- sukcynoimidylu. Dokładne stosunki ?-amino acylowanych rodzajów do ?-amino acylowanych rodzajów nie zostały obliczone. Suma wszystkich ?-amino acylowanych rodzajów w chromatogramie stanowiła 87-90% całkowitej powierzchni, podczas gdy suma wszystkich związanych substancji (które przypuszczalnie obejmowałyby jakiekolwiek ?-amino acylowane rodzaje) stanowiła <7% całkowitej powierzchni, dla jakiegokolwiek danego punktu w 4 EP 1 613 343 B1 czasie. [0015] WO 02/065985 wg Ekwuribe i in. ujawnia syntezę insuliny sprzężonej z B29Lys-heksylo-PEG7-oligomerem (HIM2) wychodząc od rekombinowanej proinsuliny bez procesu transpeptydacji. [0016] Niniejszy wynalazek pokonuje wcześniejsze ograniczenia w stanie techniki przez dostarczenie sposobów polegających na miejscowo- specyficznym syntetyzowaniu koniugatów insulina-oligomer które są mniej uciążliwe i/lub bardziej opłacalne niż konwencjonalne sposoby. Streszczenie Wynalazku [0017] W porównaniu do konwencjonalnych schematów opisanych powyżej, przykłady według niniejszego wynalazku dostarczają schemat wytwarzania komercyjnie mniej drogi i/lub o wyższej wydajności do wytwarzania koniugatów insulina-oligomer, gdzie pożądane jest sprzężenie specyficzne miejscowo (np. gdzie jest pożądane dostarczenie mono-koniugatu insuliny mającego oligomer sprzężony z B-29 Lys cząsteczki insuliny). Inaczej niż konwencjonalne schematy, które proponują wybiórcze sprzężenie insuliny przez zablokowanie N-końca insuliny za pomocą związków takich jak azydek p- metoksybenzoksykarbonylu (Muranishi i Kiso) lub przez próbę kontrolowania warunków reakcji w celu zredukowania, ale nie wyeliminowania sprzężenia na N-końcu insuliny (Baker), przykłady wykonania według niniejszego wynalazku proponują sprzężenie oligomeru do B-29 Lys sztucznej proinsuliny (np. proinsulina sprzężona w N-końcu swojego łańcucha B z peptydem wiodącym). [0018] Obecny peptyd C i peptyd wiodący (jeśli jest obecny) jest następnie odcinany od koniugatu proinsulina-oligomer dostarczając insulinę monoskoniugowaną w B-29 Lys z oligomerem. Przykłady wykonania według niniejszego wynalazku mogą zapewnić wysoką miejscową specyficzność dla modyfikacji B-29 Lys. Sposoby zgodnie z przykładami wykonania według niniejszego wynalazku wykorzystujące polipeptydy proinsuliny mogą dostarczyć zmodyfikowany produkt o wysokiej konwersji B-29, na przykład z wydajnościami taki wysokimi jak 80% lub większymi, w porównaniu do tych otrzymanych za pomocą konwencjonalnych szklaków insulinowych. [0019] Zgodnie z pewnymi przykładami wykonania, wynalazek dostarcza 5 EP 1 613 343 B1 sposób syntetyzowania koniugatu polipeptyd insuliny ? oligomer, który obejmuje zetknięcie sztucznego polipeptydu proinsuliny ujawnionego w zastrzeżeniu 1 z oligomerem zawierającym hydrofilową cząstkę i lipofilową cząstkę w warunkach wystarczających do sprzężenia oligomeru z polipeptydem proinsuliny w Lys29 łańcucha B polipeptydu proinsuliny i dostarcza koniugat polipeptyd proinsulinyoligoomer, gdzie polipeptydem warunki proinsuliny wystarczające obejmują do sprzężenia acylację za oligomeru pomocą z estru hydroksysukcynoimidowego do Lys29 łańcucha B insuliny, i gdzie hydrofilowa cząstka zawiera cząstkę glikolu polialkilenowego oraz odcięcie peptydu wiodącego i nie-insulinowych polipeptydów od koniugatu polipeptyd proinsulinyoligomer za pomocą enzymu rozcinającego dostarczając koniugat polipeptyd insuliny-oligomer. Krótki Opis Rysunków [0020] Figura 1 przedstawia przykłady wykonania sposobu syntezy do przygotowania insuliny modyfikowanej w B-29 Lys przy zastosowaniu proinsuliny posiadającej peptyd wiodący. Figura 2 przedstawia profil HPLC sprzężenia proinsuliny II; Figura 3 przedstawia widmo masowe oczyszczonego monokoniugatu proinsuliny II; Figura 4 przedstawia widmo masowe oczyszczonego dikoniugatu proinsuliny II; Figura 5 przedstawia profil HPLC wytwarzania monokoniugatu Insulinaheksylo-PEG7; Figura 6 przedstawia widmo masowe produktu rozcięcia za pomocą trypsyny monokoniugatu proinsuliny II; Figura 7 przedstawia profil HPLC rozcięcia (Arg31)Insulina-heksylo-PEG7 za pomocą karboksypeptydazy B. Figura 8 przedstawia widmo masowe produktu rozcięcia za pomocą karboksypeptydazy acylowanego w B-29 koniugatu (Arg31)-Insulina-heksyloPEG7; Figura 9 przedstawia profil HPLC wytwarzania Insulina-heksylo-PEG7 (polirozproszony) z monokoniugatu Proinsuliny II rozciętego przez koktajl enzymów karboksypeptydazy B i trypsyny. 6 EP 1 613 343 B1 Figura 10 przedstawia widmo masowe Insulina-heksylo-PEGn (polirozproszony) przez proinsulinę II; Figura 11 przedstawia profil HPLC wytwarzania acylowanego w B-29 Insulinaheksylo-PEG7 przez proinsulinę I; Figura 12 przedstawia widmo masowe acylowanego w B-29 Insulina-heksyloPEG7 przez proinsulinę I; Figura 13 przedstawia widmo masowe insuliny (produkt uboczny) otrzymanej z mieszaniny koniugatu proinsuliny I; Figura 14 przedstawia profil HPLC monokoniugatu A proinsuliny I, monokoniugatu B proinsuliny I i dikoniugatu proinsuliny I. Figura 15 przedstawia profil HPLC wytwarzania monokoniugatu Insulinaheksylo-PEG7 z reakcji dikoniugatu proinsuliny I z koktajlem enzymów karboksypeptydazy B i trypsyny; Figura 16 przedstawia profil HPLC wytwarzania insuliny (produkt uboczny) z reakcji monokoniugatu A proinsuliny I z koktajlem enzymów karboksypeptydazy B i trypsyny; Figury 17a i 17b przedstawiają chromatogramy HPLC z mapowania peptydów PEG7 HIM2 wytworzonego z insuliny i PEG7 HIM2 wytworzonego z proinsuliny; Figury 18a i 18b przedstawiają profile biopotencji MBGA koniugatów oligomerowych według niniejszego wynalazku wytworzonych z insuliny; Figury 19a i 19b przedstawiają profile biopotencji MBGA koniugatów oligomerowych według niniejszego wynalazku wytworzonych z proinsuliny; Figura 20 przedstawia strukturę aktywowanego monoheksadecyloeteru heksaetylenoglikolowego (aktywowany oligomer heksaedecylo-PEG6); Figura 21 przedstawia widmo masowe Monokoniugatu B Proinsuliny II i HeksadecyloPEG6; Figura 22 przedstawia widmo masowe Monokoniugatu A Proinsuliny II i HeksadecyloPEG6; Figura 23 przedstawia widmo masowe Dikoniugatu Proinsuliny II i HeksadecyloPEG6; Figura 24 przedstawia chromatogram HPLC reakcji sprzężenia aktywowanego heksadecyloPEG6 z proinsuliną-II; 7 EP 1 613 343 B1 Figura 25 przedstawia widmo masowe Es dla insuliny sprzężonej z LysB29heksadecylo-PEG6-oligomerem; Figura 26 przedstawia chromatogram HPLC reakcji z koktajlem enzymów mieszaniny proinsuliny II sprzężonej z heksadecylo-PEG6; Figura 27 przedstawia struktury aktywowanego monoheksadecyloeteru oktaetylenoglikolowego (C16-PEG8) i aktywowanego monoheksadecyloeteru tetraetylenoglikolowego (C16-PEG4); Figura 28 przedstawia widmo masowe MALDI koniugatu LysB29-Heksylo-PEG7oligomer z rekacji Koktajlu Enzymów z Heksylo-PEG7-Oligomerowymi koniugatami Naturalnej Proinsuliny; Figura 29 przedstawia Widmo Masowe MALDI PheB1, LysB29 Di (Heksylo-PEG7Oligomerowego) Koniugatu z Reakcji Koktajlu Enzymów z Heksylo-PEG7Oligomerowymi Koniugatami Naturalnej Proinsuliny; Figura 30 przedstawia Widmo Masowe MALDI Ludzkiej insuliny wyizolowanej z reakcji Koktajlu Enzymów z Monokoniugatem Proinsuliny II i Heksylo-PEG7Oligomerem (Mono Proinsulina); Figura 31 przedstawia Oligomerowego Widmo koniugatu Masowe insuliny z MALDI reakcji Lys29-Heksylo-PEG7- Koktajlu Enzymów z Monokoniugatu Proinsuliny II z Heksylo-PEG7-Oligomerem (Mono Proinsulina II); Figura 32 przedstawia Widmo Masowe MALDI Lys29-Heksylo-PEG7- Oligomerowego koniugatu insuliny z reakcji Koktajlu Enzymów z Dikoniugatem Proinsuliny II i Heksylo-PEG7-Oligomerem (Di Proinsulina II); Figura 33 przedstawia sprzężenie z jednołańcuchowym prekursorem DesThr; Figura 34 przedstawia konstrukt 1 niepoddany transpeptydacji 1 niepoddany transpeptydacji jednołańcuchowego prekursora insuliny; Figura 35 przedstawia konstrukt jednołańcuchowego prekursora insuliny z peptydem wiodącym; Figura 36 przedstawia bezpośredni szlak do modyfikowanego w B-29 Lys koniugatu insuliny z jednołańcuchowego prekursora-3 insuliny bez transpeptydacji; i Figura 37 przedstawia bezpośredni szlak do modyfikowanego w B-29 Lys 8 EP 1 613 343 B1 koniugatu insuliny z jednołańcuchowego prekursora insuliny bez transpeptydacji przez koktajl enzymów. Szczegółowy Opis Wynalazku [0021] Niniejszy wynalazek zostanie teraz opisany bardziej szczegółowo z odniesieniem do załączonych rysunków, w których przedstawione są różne przykłady wykonania wynalazku. [0022] Wszystkie skróty aminokwasów stosowane w tym ujawnieniu są zaakceptowane przez Urząd Patentów i Znaków Towarowych Stanów Zjednoczonych Ameryki jak przedstawiono w 37 C.F.R. § 1.822(b). [0023] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?pomiędzy?, gdy stosowany jest w celu opisania różnych zakresów powinien być interpretowany jako obejmujący punkty końcowe opisanych zakresów. [0024] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?zasadniczo monorozproszony? jest stosowany w celu opisania mieszaniny związków, gdzie co najmniej 95 procent związków w mieszaninie ma tą samą masę cząsteczkową. [0025] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?monorozproszony? jest stosowany w celu opisania mieszaniny związków, gdzie około 100 procent związków w mieszaninie ma tą samą masę cząsteczkową. [0026] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu ?polipeptyd insuliny? oznacza polipeptyd posiadający co najmniej część biologicznej aktywności insuliny (np. zdolność do oddziaływania na organizm przez główny mechanizm działania insuliny). Na przykład polipeptyd insuliny może być polipeptydem takim jak insulina posiadająca łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B sprzężony z łańcuchem polipeptydowym A za pomocą wiązań disiarczkowych. W różnych przykładach wykonania niniejszego wynalazku polipeptyd insuliny może posiadać większość biologicznej aktywności insuliny i może posiadać zasadniczo całą aktywność biologiczną insuliny i w pewnych przykładach wykonania posiada całą aktywność biologiczną insuliny. W pewnych przykładach wykonania niniejszego wynalazku, polipeptyd insuliny może posiadać zwiększoną aktywność biologiczną insuliny. Zwiększona aktywność w odniesieniu do insuliny występuje, na przykład, gdy podanie wywołuje działanie 9 EP 1 613 343 B1 obniżające poziom glukozy, które jest silniejsze niż działanie obniżające poziom glukozy wywołane przez odpowiadającą ilość insuliny. [0027] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?polipeptyd proinsuliny? oznacza polipeptyd insuliny, który jest sprzężony z jednym lub więcej polipeptydami nie-insulinowymi (np. peptydami wiodącymi i/lub łączącymi lub peptydami C) za pomocą wiązania (-ań) peptydowego, które są możliwe do rozcięcia in vitro lub in vivo. Na przykład polipeptyd proinsuliny może obejmować polipeptyd insuliny takiej jak insulina mająca łańcuch polipeptydowy A sprzężony z łańcuchem polipeptydowym B za pomocą wiązań takich jak wiązania disiarczkowe i peptyd łączący sprzężony z C-końcem łańcucha polipeptydowego B i sprzężony z N-końcem łańcucha polipeptydowego A za pomocą wiązań peptydowych, które są możliwe do rozcięcia in vitro i/lub in vivo. Jako kolejny przykład, polipeptyd proinsuliny może obejmować polipeptyd insuliny takiej jak insulina mająca łańcuch polipeptydowy A sprzężony z łańcuchem polipeptydowym B za pomocą wiązań takich jak wiązania disiarczkowe, peptyd łączący sprzężony z C-końcem łańcucha polipeptydowego B i sprzężony z N-końcem łańcucha polipeptydowego A za pomocą wiązań peptydowych, które są zdolne do rozcięcia in vitro i/lub in vivo i peptyd wiodący sprzężony z N-końcem łańcucha polipeptydowego B. Przykładowe polipeptydy proinsuliny obejmują, ale nie wyłącznie, proinsulinę, analogi proinsuliny, fragmenty proinsuliny, fragmenty analogu proinsuliny lub jakiekolwiek z proinsuliny, analogów proinsuliny, fragmentów proinsuliny, fragmentów analogu proinsuliny mających peptyd wiodący; preproinsulinę, analogi preproinsuliny, fragmenty preproinsuliny, analogi fragmentu preproinsuliny, miniproinsulinę i białka fuzyjne. [0028] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?insulina? obejmuje, ale nie wyłącznie, insulinę z któregokolwiek z lub więcej następujących gatunków: ludzką, krowy, świńską, owczą, konia, psa, kurczaka, kaczki lub wieloryba jak również którychkolwiek innych gatunków, które wiadomo teraz lub zidentyfikowano później że wytwarzają insulinę. Insulina według tego wynalazku może być dostarczona za pomocą naturalnych, syntetycznych lub genetycznie zaprojektowanych (np. rekombinowanych) źródeł. W różnych przykładach 10 EP 1 613 343 B1 wykonania niniejszego wynalazku, insulina może być ludzką insuliną. [0029] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu ?jednołańcuchowy prekursor insuliny? ?SCIP? obejmuje prekursora polipeptydu insuliny, u którego nie występuje peptyd C. SCIP może mieć łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B, gdzie N- lub C-koniec łańcucha A jest sprzężony z C- lub Nkońcem łańcucha B przez peptyd łączący mający między dolną granicą -10, -9, -8, - 7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 i górną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 reszt aminokwasowych. SCIP może także zawierać sekwencję wiodącą. [0030] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?analog insuliny? obejmuje insulinę, gdzie jeden lub więcej aminokwasów zostało zastąpionych jednocześnie pozostawiając część lub całą aktywność insuliny. Analog jest opisany przez odnotowanie zastąpienia aminokwasów z pozycją zastąpienia w postaci indeksu górnego po opisie insuliny. Na przykład " ProB29 insulina, ludzka" oznacza, że lizyna, która zwykle występuje w pozycji B29 cząsteczki ludzkiej insuliny została zastąpiona proliną. Analog insuliny według tego wynalazku może także obejmować polipeptyd insuliny mający więcej aminokwasów niż liczba aminokwasów występujących w natywnej insulinie. Przykłady takich analogów mogą obejmować, ale nie wyłącznie, insulinę- ArgB31 ArgB31 utworzoną jak opisano w Przykładzie 14 niniejszego zgłoszeniu, po rozcięciu trypsyną peptydu C od proinsuliny, ale przed rozcięciem karboksypeptydazą), insulinę-ArgA0, która powstanie w wyniku odcięcia peptydu wiodącego od łańcucha A i insulinę-XaaB0, gdzie Xaa oznacza jakikolwiek aminokwas, który może powstać na przykład w wyniku zastosowania nienatywnego peptydu C, który nie był rozcięty. Analog insuliny według tego wynalazku także obejmuje polipeptyd insuliny mający mniej aminokwasów niż liczba aminokwasów występujących w natywnej insulinie ze względu na delecję aminokwasów i/lub polipeptydu insuliny mających więcej niż liczba aminokwasów występujących w natywnej insulinie ze względu na insercję dodatkowych aminokwasów do łańcucha aminokwasowego polipeptydu insuliny. Analogi insuliny według tego wynalazku mogą także zawierać jakiekolwiek połączenie analogów insuliny opisanych dla tego wynalazku. 11 EP 1 613 343 B1 [0031] Analogi insuliny można otrzymać za pomocą różnych sposobów, co będzie zrozumiałe dla znawców z dziedziny. Na przykład pewne aminokwasy mogą być podstawione na inne aminokwasy w strukturze insuliny bez dostrzegalnej utraty interakcyjnej zdolności wiązania ze strukturami takimi jak na przykład regiony przeciwciał wiążące antygen lub miejsca wiążące na cząsteczkach substratu. Jako że interakcyjna zdolność i charakter insuliny określa jej biologiczną funkcjonalną aktywność, pewne podstawienia sekwencji aminokwasowej mogą zostać wykonane w sekwencji aminokwasów i pomimo tego pozostawiają polipeptyd o podobnych właściwościach. [0032] W wykonywaniu takich podstawień może być rozważany wskaźnik hydropatyczny aminokwasów. Znaczenie wskaźnika hydropatycznego aminokwasu w potwierdzeniu interakcyjnego biologicznego oddziaływania na polipeptyd jest zwykle rozumiane w dziedzinie. Jest przyjęte, że odpowiedni hydropatyczny charakter aminokwasu przyczynia się do drugorzędowej struktury otrzymanego polipeptydu, która z kolei określa oddziaływanie białka z innymi cząsteczkami, na przykład enzymami, substratami, receptorami, DNA, przeciwciałami, antygenami i tym podobnymi. Każdemu aminokwasowi przypisano wskaźnik hydropatyczny na podstawie jego hydrofobowości i ładunku w następujący sposób: izoleucyna (+4.5); walina (+4.2); leucyna (+3.8); fenyloalanina (+2.8); cysteina/cystyna (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicyna (-0.4); treonina (-0.7); seryna (-0.8); tryptofan (-0.9); tyrozyna (-1.3); prolina (-1.6); histydyna (-3.2); glutaminian (-3.5); glutamina (-3.5); asparaginian (-3.5); asparagina (-3.5); lizyna (-3.9); i arginina (-4.5). Będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, że pewne aminokwasy mogą być podstawione przez inne aminokwasy mające podobny hydropatyczny wskaźnik lub wynik i wciąż skutkują powstaniem polipeptydu o podobnej biologicznej aktywności, tj. wciąż otrzymywany jest polipeptyd o równoważnej biologicznej funkcjonalności. W dokonywaniu takich zmian, preferowane są podstawienia aminokwasów, których wskaźniki hydropatyczne są w granicach ?2, szczególnie preferowane są te, które są w granicach ?1, a nawet bardziej szczególnie preferowane są te w granicach ?0.5. [0033] Jest także zrozumiałe w dziedzinie, że podstawienie podobnych 12 EP 1 613 343 B1 aminokwasów może być wykonane skutecznie na podstawie hydrofilowości. Amerykański Patent 4,554,101, zapewnia, że największa miejscowa średnia hydrofilowość białka, co określono za pomocą hydrofilowości przylegających do niego aminokwasów, koreluje z biologiczną właściwością białka. Zgodnie z tym co szczegółowo przedstawiono w Amerykańskim Patencie 4,554,101, następujące wartości hydrofilowości przypisano resztom aminokwasowym: arginina (+3.0); lizyna (?3.0); asparaginian (+3.0 ? 1); glutaminian (+3.0 ? 1); zeina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicyna (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ? 1); alanina (-0.5); histydyna (-0.5); cysteina (-1.0); metionina (1.3); walina (-1.5); leucyna (-1.8); izoleucyna (-1.8); tyrozyna (-2.3); fenyloalanina (-2.5); tryptofan (-3.4). Jest zrozumiałe przez znawców z dziedziny, że aminokwas może być podstawiony na inny mający podobną wartość hydrofilowości i wciąż może być otrzymany biologicznie równoważny, a w szczególności, immunologicznie równoważny polipeptyd. W takich zmianach, preferowane jest podstawienie aminokwasów, których wartości hydrofilowości są w granicach ?2, szczególnie preferowane są te w granicach ?1, a nawet bardziej szczególnie preferowane są te w granicach ?0.5. [0034] Jak przedstawiono powyżej, podstawienia/insercje aminokwasów są zatem zwykle oparte na odpowiednim podobieństwie podstawników w łańcuchu bocznym aminokwasu na przykład ich hydrofobowości, hydrofilowości, ładunku, rozmiarze i tym podobnych. Przykładowe podstawienia (np. aminokwasy, które mogą zostać zamienione bez istotnej zmiany aktywności biologicznej polipeptydu), które uwzględniają różne z następujących właściwości są dobrze znane fachowcom z dziedziny i obejmują na przykład argininę i lizynę; glutaminian i asparaginian; serynę i treoninę; glutaminę i asparaginę; i walinę, leucynę i izoleucynę. [0035] Będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, że analogi insuliny mogą być przygotowane za pomocą różnych poznanych technik syntezy peptydów w tym, ale nie wyłącznie klasycznych sposobów (rozdział), sposobów z fazą stałą, półsyntetycznych sposobów i sposobów z rekombinowanym DNA. [0036] Przykłady analogów ludzkiej insuliny obejmują, ale nie wyłącznie, insulinę GlyA21, ludzką; insulinę GlyA21 GlnB3, ludzką; insulinę AlaA21, ludzką; 13 EP 1 613 343 B1 insulinę AlaA21 GlnB3, ludzką; insulinę GlnB3, ludzką; insulinę GlnB30, ludzką; insulinę GlyA21 GluB30, ludzką; insulinę GlyA21 GlnB3 GluB30, ludzką; insulinę GlnB3 GluB30, ludzką; insulinę AspB28, ludzką; insulinę LysB28, ludzką; insulinę LeuB28, ludzką; insulinę ValB28, ludzką; insulinę AlaB28, ludzką; insulinę AspB28 ProB29, ludzką; insulinę LysB28 ProB29, ludzką; insulinę LeuB28 ProB29, ludzką; insulinę ValB28 ProB29, ludzką; insulinę AlaB28 ProB29, ludzką, jak również jakikolwiek analog insuliny obecnie znany lub później zidentyfikowany. Analog insuliny może także zawierać cząsteczkę insuliny zawierającą łańcuch B z dodanymi dodatkowymi lizynami. [0037] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?fragment insuliny? obejmuje segment sekwencji aminokwasowej znajdujący się w insulinie, który zachowuje część lub całą aktywność insuliny. Fragmenty insuliny są oznaczone za pomocą ustalonej(-ych) pozycji w sekwencji aminokwasowej a następnie opis aminokwasu. Na przykład fragment ?ludzkiej insuliny B25-B30? będzie sześcio aminokwasową sekwencją odpowiadającą pozycjom B25, B26, B27, B28, B29 i B30 w sekwencji aminokwasowej ludzkiej insuliny. [0038] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?analog fragmentu insuliny? obejmuje segment sekwencji aminokwasowej znajdujący się w cząsteczce insuliny, gdzie jeden lub więcej aminokwasów w segmencie zostało zastąpionych, wstawionych i/lub usuniętych, i/lub jeden lub więcej egzogennych aminokwasów zostało wstawionych, zachowując część lub całą aktywność insuliny. [0039] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?proinsulina? obejmuje proinsulinę z jakiegokolwiek jednego lub więcej następujących gatunków: ludzką, krowy, świni, owcy, konia, psa, kurczaka, kaczki lub wieloryba, jak również jakichkolwiek innych gatunków, które obecnie wiadomo lub później zidentyfikowano że wytwarzają proinsulinę. Proinsulina według tego wynalazku może zostać dostarczona z naturalnych, syntetycznych lub genetycznie zaprojektowanych źródeł. Ogólnie proinsulina zawiera insulinę mającą peptyd C łączący N-koniec łańcucha A insuliny z C-końcem łańcucha B insuliny. Proinsulina może być ludzką proinsuliną. [0040] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?analog proinsuliny? obejmuje 14 EP 1 613 343 B1 proinsulinę, gdzie jeden lub więcej aminokwasów w proinsulinie zostało zastąpionych, wprowadzonych i/lub usuniętych i/lub jeden lub więcej egzogennych aminokwasów zostało wprowadzonych jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów insuliny zachowując część lub całą aktywność insulinowej części proinsuliny. Analogi proinsuliny z zastąpieniami są opisane przez oznaczenie zastąpienia aminokwasów za pomocą pozycji zastąpienia w postaci indeksu górnego a następnie opis proinsuliny. Na przykład " proinsulina ProB29, ludzka" oznacza, że lizyna zwykle znajdująca się w pozycji B29 cząsteczki ludzkiej proinsuliny została zastąpiona proliną. [0041] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?fragment proinsuliny? obejmuje segment sekwencji aminokwasowej znajdujący się w proinsulinie, który zachowuje część lub całą aktywność biologiczną insuliny, analogu insuliny lub części fragmentu insuliny fragmentu proinsuliny. Fragmenty proinsuliny są oznaczone za pomocą ustalonej(-ych) pozycji w sekwencji aminokwasowej a następnie opis aminokwasu. Na przykład fragment ? ludzkiej B25-B35 proinsuliny" będzie oznaczał jedenasto ? aminokwasową sekwencję odpowiadającą pozycjom B25, B26, B27, B28, B29, B30, B31, B32, B33, B34 i B35 w sekwencji aminokwasowej ludzkiej proinsuliny. [0042] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?analog fragmentu proinsuliny? obejmuje segment sekwencji aminokwasowej znajdujący się w cząsteczce proinsuliny, gdzie jeden lub więcej aminokwasów w segmencie zostało zastąpionych, wprowadzonych i/lub usuniętych, i/lub jeden lub więcej egzogennych aminokwasów zostało wprowadzonych, jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów insuliny zachowując część lub całą aktywność insuliny, analogu insuliny, fragmentu insuliny lub części analogu fragmentu insuliny fragmentu proinsuliny. [0043] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?preproinsulina? obejmuje preproinsulinę z jakiegokolwiek jednego lub więcej następujących gatunków: ludzką, krowy, świni, owcy, konia, psa, kurczaka, kaczki lub wieloryba, jak również jakichkolwiek innych gatunków, które obecnie wiadomo lub później zidentyfikowano że wytwarzają preproinsulinę. Preproinsulina według tego wynalazku może zostać dostarczona z naturalnych, syntetycznych lub 15 EP 1 613 343 B1 genetycznie zaprojektowanych źródeł. Ogólnie preproinsulina jest jednołańcuchowym polipeptydem (np. polipeptydem posiadającym sekwencję wiodącą sprzężoną z N-końcem łańcucha B insuliny i posiadającym C-koniec łańcucha B sprzężony z N-końcem łańcucha A za pomocą peptydu łączącego) w którym łańcuch A jest sprzężony z łańcuchem B na przykład za pomocą wiązań disiarczkowych. Preproinsulina może być ludzką preproinsuliną. [0044] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?analog preproinsuliny? obejmuje preproinsulinę, gdzie jeden lub więcej aminokwasów w preproinsulinie zostało zastąpionych, wprowadzonych i/lub usuniętych i/lub jeden lub więcej egzogennych aminokwasów zostało wprowadzonych jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów insuliny zachowując część lub całą aktywność insuliny lub części analogu insuliny analogu preproinsuliny. Analog preproinsuliny z zastąpieniami jest opisany przez oznaczenie zastąpienia aminokwasów za pomocą pozycji zastąpienia w postaci indeksu górnego a następnie opis insuliny. [0045] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?fragment preproinsuliny? obejmuje segment sekwencji aminokwasowej znajdujący się w preproinsulinie, który zachowuje część lub całą aktywność biologiczną insuliny lub części fragmentu insuliny fragmentu preproinsuliny. Fragmenty preproinsuliny są oznaczone za pomocą ustalonej(-ych) pozycji w sekwencji aminokwasowej a następnie opis aminokwasu. [0046] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?analog fragmentu preproinsuliny? obejmuje segment sekwencji aminokwasowej znajdujący się w cząsteczce preproinsuliny, gdzie jeden lub więcej aminokwasów w segmencie zostało zastąpionych, wprowadzonych i/lub usuniętych, i/lub jeden lub więcej egzogennych aminokwasów zostało wprowadzonych, jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów insuliny zachowując część lub całą aktywność insuliny, analogu insuliny, fragmentu insuliny lub części analogu fragmentu insuliny analogu fragmentu preproinsuliny. [0047] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?miniproinsulina? odnosi się do jednołańcuchowego propolipeptydu insuliny mającego łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B, gdzie N- lub C-koniec łańcucha A 16 EP 1 613 343 B1 jest sprzężony z C- lub N-końcem łańcucha B za pomocą peptydu łączącego mającego między dolną granicą -10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 a górną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 reszt aminokwasowych, i gdzie łańcuch polipeptydowy A jest sprzężony z łańcuchem polipeptydowym B za pomocą wiązań takich jak wiązania disiarczkowe. Miniproinsuliny mogą być różnymi miniproinsulinami co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, tych opisanych w Amerykańskim Patencie Nr 5,157,021 według Balschmidt i in. i Amerykańskim Patencie Nr 5,202,415 według Jonassen i in. [0048] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin "peptyd C" oznacza peptyd mający sekwencję aminokwasową peptydu C proinsuliny jednego z następujących gatunków: człowieka, małpy, krowy, świni, owcy, konia, psa, kurczaka, kaczki lub wieloryba, dostarczony z naturalnych, syntetycznych lub genetycznie zaprojektowanych źródeł. Peptyd C może być ludzkim peptydem C. [0049] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?analog peptydu C? oznacza peptyd C, gdzie jeden lub więcej aminokwasów w peptydzie C zostało zastąpionych, wstawionych i/lub usuniętych, i/lub jeden lub więcej egzogennych aminokwasów zostało wprowadzonych jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów insuliny zachowując część lub całą biologiczną aktywność peptydu C. Analog peptydu C może zawierać segment pentapeptydowy na C-końcu peptydu C i/lub segment nonapeptydowy znajdujące się w pozycjach 11-19 peptydu C. Gdy analog peptydu C zawiera segment pentapeptydowy, segment pentapeptydowy może być na C-końcu analogu peptydu C. Analog peptydu C może zawierać segment tetrapeptydowy na C-końcu peptydu C i/lub segment nonapeptydowy znajdujące się w pozycjach 11-19 peptydu C. Gdy analog peptydu C zawiera segment tetrapeptydowy, segment tetrapeptydowy może być na C-końcu analogu peptydu C. Segment nonapeptydowy znajdujący się w pozycjach 11-19 peptydu C jak opisano powyżej może być segmentem nonapeptydowym znajdującym się w pozycjach 11-19 ludzkiego peptydu C. [0050] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?fragment peptydu C? oznacza segment sekwencji aminokwasowej peptydu C, który zachowuje 17 EP 1 613 343 B1 część, zasadniczo całą lub całą biologiczną aktywność peptydu C. Fragment peptydu C może zawierać segment pentapeptydowy na C-końcu peptydu C i/lub segment nonapeptydowy znajdujące się w pozycjach 11-19 peptydu C. Gdy fragment peptydu C zawiera segment pentapeptydowy, segment pentapeptydowy może być na C-końcu fragmentu peptydu C. Fragment peptydu C może także zawierać segment tetrapeptydowy na C-końcu peptydu C i/lub segment nonapeptydowy znajdujące się w pozycjach 11-19 peptydu C. Gdy fragment peptydu C zawiera segment tetrapeptydowy, segment tetrapeptydowy może być na C-końcu fragmentu peptydu C. Fragment peptydu C może składać się z peptydu wybranego z grupy składającej się z segmentu pentapeptydowego C-końca peptydu C, segmentu nonapeptydowego znajdującego się w pozycjach 11-19 peptydu C i segmentu tetrapeptydowego C-końca peptydu C. Segment nonapeptydowy znajdujący się w pozycjach 1119 peptydu C opisanego powyżej może być segmentem nonapeptydowym znajdującym się w pozycjach 11-19 ludzkiego peptydu C. [0051] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu ?analog fragmentu peptydu C? oznacza segment sekwencji aminokwasowej peptydu C, gdzie jeden lub więcej aminokwasów w segmencie zostało zastąpionych, wstawionych i/lub usuniętych, i/lub jeden lub więcej egzogennych aminokwasów zostało wprowadzonych jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów insuliny zachowując część, zasadniczo całą lub całą biologiczną aktywność insuliny. Analog fragmentu peptydu C może zawierać segment pentapeptydowy na Ckońcu peptydu C i/lub segment nonapeptydowy znajdujący się w pozycjach 1119 peptydu C. Gdy analog fragmentu peptydu C zawiera segment pentapeptydowy, segment pentapeptydowy może być na C-końcu analogu fragmentu peptydu C. Analog fragmentu peptydu C może zawierać segment tetrapeptydowy na C-końcu peptydu C i/lub segment nonapeptydowy znajdujący się w pozycjach 11-19 peptydu C. Gdy analog fragmentu peptydu C zawiera segment tetrapeptydowy, segment tetrapeptydowy może być na Ckońcu analogu fragmentu peptydu C. Segment nonapeptydowy znajdujący się w pozycjach 11-19 peptydu C opisanego powyżej może być segmentem nonapeptydowym znajdującym się w pozycjach 11-19 ludzkiego peptydu C. 18 EP 1 613 343 B1 [0052] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?polipeptyd peptydu C? oznacza polipeptyd mający terapeutyczną użyteczność i biologiczną aktywność podobne do terapeutycznej użyteczności i biologicznej funkcjonalności dla peptydów C i/lub fragmentów peptydu C opisanych w Wahren i in., "Role of Cpeptide in Human Physiology," Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 278: E759E768 (2000) i/lub Forst i in., "New Aspects on Biological Activity of C-peptide in IDDM Patients," Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 106: 270-276 (1998). [0053] Na przykład polipeptydy peptydu C mają terapeutyczną użyteczność, która obejmuje, ale nie wyłącznie, zmniejszoną hiperfiltrację kłębuszkową, zwiększone zużycie glukozy przez cały organizm i/lub mięśnie szkieletowe, polepszone działanie nerwów autonomicznych, i/lub redystrybucję przepływu krwi przez mikronaczynia skóry. Polipeptydy peptydu C wykazują biologiczną aktywność, która obejmuje, ale nie wyłącznie, zdolność do pobudzania aktywności Na+-K+-ATPazy, zdolność do pobudzania aktywności śródbłonkowej syntazy tlenku azotu i/lub zdolność do specyficznego wiązania do powierzchni komórkowej (np. do receptora powierzchniowego sprzężonego z białkiem G) z następną aktywacją zależnych od Ca2+-wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych. Polipeptydy peptydu C mogą mieć stałą asocjacji stałą dla wiązania do komórek śródbłonka, komórek kanalików nerkowych i fibroblastów wynoszącą ~3x109 M-1. Polipeptydami peptydu C mogą być peptydy C, analogi peptydu C, fragmenty peptydu C lub analogi fragmentu peptydu C. [0054] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu ?polipeptyd pro-peptydu-C? oznacza polipeptyd peptydu C sprzężony z jednym lub więcej peptydami, które są możliwe do rozcięcia dostarczając polipeptyd peptydu C. [0055] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu ?łańcuch polipeptydowy A? oznacza polipeptyd, który jest zasadniczo biologicznie równoważny łańcuchowi A cząsteczki insuliny. Na przykład polipeptydowym łańcuchem A mogą być analogi łańcucha A, jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów insuliny, fragmenty łańcucha A lub fragmenty analogu łańcucha A. [0056] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin "polipeptydowy łańcuch B? oznacza polipeptyd, który jest zasadniczo biologicznie równoważny łańcuchowi B cząsteczki insuliny. Na przykład polipeptydowym łańcuchem B mogą być 19 EP 1 613 343 B1 analogi łańcucha B, jak opisano powyżej w odniesieniu do analogów insuliny, fragmenty łańcucha B lub fragmenty analogu łańcucha B. [0057] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?peptyd lub polipeptyd? oznacza sekwencję aminokwasową składającą się z co najmniej reszt aminokwasowych. [0058] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu ?amfifilowo zrównoważony? oznacza zdolność zasadniczego rozpuszczenia w wodzie i zdolność do penetracji błon biologicznych. [0059] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?glikol polialkilenowy? dotyczy prostych lub rozgałęzionych polimerów glikolu polialkilenowego takich jak glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy i glikol polibutylenowy i obejmują monoalkiloeter glikolu polialkilenowego. Termin ?podjednostka glikolu polialkilenowego? dotyczy pojedynczej jednostki glikolu polialkilenowego. Na przykład podjednostką glikolu polietylenowego będzie -O-CH 2-CH2-O-. [0060] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?lipofilowy? oznacza zdolność do rozpuszczania w tłuszczach i/lub zdolność do penetrowania, oddziaływania z i/lub przechodzenia przez błony biologiczne i termin ?lipofilowa cząstka? lub ?lipofil? oznacza cząstkę, która jest lipofilowa i/lub która, gdy zostanie przyłączona do innej chemicznej jednostki zwiększa lipofilowość takiej chemicznej jednostki. Przykłady cząstek lipofilowych obejmują, ale nie wyłącznie, alkile, kwasy tłuszczowe, estry kwasów tłuszczowych, cholesteryl, adamantyl i podobne. [0061] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?niższy alkil? dotyczy podstawionych lub niepodstawionych cząstek alkilowych mających od jednego do pięciu atomów węgla. [0062] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu termin ?wyższy alkil? dotyczy podstawionych lub niepodstawionych cząstek alkilowych mających sześć lub więcej atomów węgla. [0063] Niniejsze zgłoszenie także dostarcza sposoby syntetyzowania koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer, które obejmują zetknięcie polipeptydu proinsuliny zawierającego polipeptyd insuliny sprzężony z jednym lub więcej peptydami za pomocą wiązania (-ań) peptydowego możliwego do rozcięcia dając polipeptyd 20 EP 1 613 343 B1 insuliny z oligomerem w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny i dostarczając koniugat polipeptyd proinsuliny-oligomer, i odcięcie jednego lub więcej peptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer dostarczając koniugat polipeptyd insuliny-oligomer. Na przykład koniugaty insulina-oligomer mogą być zsyntetyzowane jak opisano w Przykładach dostarczonych poniżej. Przykład wykonania przebiegu syntezy jest dostarczony na Figurze 1. [0064] Polipeptydem proinsuliny może być analog proinsuliny mający peptyd wiodący. Analog proinsuliny mający peptyd wiodący jest dostępny na przykład u Itoham Foods, Inc. of Ibaraki Pref, Japonia. Peptyd wiodący i peptyd C analogu proinsuliny są każdy pozbawiony reszt lizyny. Polipeptydem proinsuliny może być polipeptyd proinsuliny, który jest dostępny na przykład u Biobras of Belo Horizonte, Brazylia. Polipeptyd proinsuliny ma peptyd wiodący sprzężony z Nkońcem łańcucha B proinsuliny. Peptyd wiodący jest pozbawiony reszt lizyny. [0065] Polipeptyd insuliny może mieć łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B. Łańcuch polipeptydowy A może być pozbawiony reszt lizyny. Łańcuch polipeptydowy B może zawierać pojedynczą resztę lizyny. Łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B mogą być połączone poprzecznie i mogą być połączone poprzecznie przy zastosowaniu jednego lub więcej wiązań disiarczkowych. W pewnych przykładach wykonania łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B zawierają reszty cysteiny, z który jedna lub więcej są sprzężone przy zastosowaniu jednego lub więcej wiązań disiarczkowych do połączenia poprzecznego łańcucha polipeptydowego A z łańcuchem polipeptydowym B. Polipeptydem insuliny może być insulina, analog insuliny, fragment insuliny lub fragment analogu insuliny. [0066] Jeden lub więcej peptydów sprzężonych z polipeptydem insuliny może zawierać peptyd łączący sprzężony na pierwszym końcu z C-końcem polipeptydowego łańcucha B i na drugim końcu z N-końcem polipeptydowego łańcucha A. Ogólnie, sekwencja aminokwasowa peptydu łączącego nie jest najważniejsza i peptydem łączącym mogą być różne peptydy łączące co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, polipeptydy peptydu C, peptydy C i peptydy łączące w miniproinsulinach. Peptyd łączący 21 EP 1 613 343 B1 może być pozbawiony reszt lizyny. Te przykłady wykonania mogą wykorzystywać mniej oligomeryczne odczynniki przez zmniejszenie liczby możliwych miejsc sprzężenia na cząsteczce polipeptydu proinsuliny. [0067] Jeden lub więcej peptydów sprzężonych z polipeptydem insuliny może zawierać peptyd wiodący, który jest sprzężony z N-końcem łańcucha polipeptydowego B. Ogólnie, sekwencja aminokwasowa peptydu wiodącego nie jest najważniejsza. W pewnych przykładach wykonania peptyd wiodący jest pozbawiony reszt lizyny. Te przykłady wykonania mogą zmniejszyć ilość zastosowanego oligomerycznego odczynnika przez ograniczenie liczby miejsc sprzężenia na cząsteczce polipeptydu proinsuliny. [0068] Jeden lub więcej peptydów sprzężonych z polipeptydem insuliny może zawierać oba peptyd łączący jak opisano powyżej i peptyd wiodący jak opisano powyżej. Jeden lub więcej peptydów może składać się zasadniczo z peptydu łączącego i peptydu wiodącego lub może składać się z peptydu łączącego i peptydu wiodącego. [0069] Wiązania peptydowe są wiązaniami, które mogą być rozcięte na różne sposoby co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Wiązania peptydowe mogą być wiązaniami, które mogą być enzymatycznie rozcięte za pomocą enzymów w tym, ale nie wyłącznie, trypsyny, karboksypeptydazy B, trombiny, pepsyny i chymotrypsyny. Wiązania peptydowe, które mogą być rozcięte enzymatycznie będą zrozumiałe przez znawców z dziedziny i obejmują, ale nie wyłącznie, Arg-Arg, Thr-Arg, Ala-Arg, Thr-Arg-Arg, Thr-Lys, Arg-Gly, i Arg-Phe. [0070] Oligomerem mogą być różne oligomery co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Ogólnie oligomerem może być jakikolwiek oligomer, który może być sprzężony z polipeptydem co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Na przykład, oligomerem może być polirozproszony oligomer jak opisano w Amerykańskim Patencie Nr 4,179,337 Davis i in.; Amerykańskim Patencie Nr 5,567,422 Greenwald; Amerykańskim Patencie Nr 5,359,030 Ekwuribe; Amerykańskim Patencie Nr 5,438,040 Ekwuribe, Amerykańskim Patencie Nr 5,681,811 Ekwuribe, i Amerykańskim Patencie Nr 6,309,633 Ekwuribe i in. W kolejnym przykładzie oligomerem może być nie22 EP 1 613 343 B1 polirozproszony oligomer jak opisano w Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Nr Seryjnym 09/873,731 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Methods of Synthesizing Substantially Monodispersed Mixtures of Polymers Having Polyethylene Glycol Mixtures"; Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Nr Seryjnym 09/873,797 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Mixtures of Drug-Oligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol, Uses Thereof, and Methods of Making Same"; i Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Nr Seryjnym 09/873,899 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Mixtures of Insulin DrugOligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol, Uses Thereof, and Methods of Making Same,". [0071] Oligomer może zawierać, składać się zasadniczo z lub składać się z hydrofilowej cząstki co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, glikoli polialkilenowych takich jak glikol polietylenowy lub glikol polipropylenowy, polioksyetylenowanych polioli, ich kopolimerów i ich blokowych kopolimerów, pod warunkiem, że zachowana jest hydrofilowość blokowych kopolimerów. Hydrofilową cząstką może być cząstka glikolu polialkilenowego. Glikol polialkilenowy ma co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6 lub 7 podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 lub więcej podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może także mieć pomiędzy dolną granicą 2, 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 podjednostek glikolu polialkilenowego, i/lub pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć pomiędzy dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 podjednostek glikolu polialkilenowego i w pewnych przykładach wykonania cząstka glikolu polialkilenowego ma 7 podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego oligomeru może być cząstką glikolu polialkilenowego niższego 23 EP 1 613 343 B1 alkilu taką jak cząstka glikolu polietylenowego, cząstką glikolu polipropylenowego lub cząstką glikolu polibutylenowego. Gdy cząstką glikolu polialkilenowego jest cząstka glikolu polipropylenowego, cząstka może mieć jednorodną (tj. nie przypadkową) strukturę. Przykładowa cząstka glikolu polipropylenowego mająca jednorodną strukturę jest następująca: Ta jednorodna struktura glikolu polipropylenowego może być opisana jako mająca tylko jeden atom węgla podstawiony metylem przylegający do każdego atomu tlenu w łańcuchu glikolu polipropylenowego. Takie jednorodne cząstki glikolu polipropylenowego mogą wykazywać zarówno właściwości lipofilowe jak i hydrofilowe. [0072] Oligomer może zawierać jedną lub więcej innych cząstek co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, dodatkowe hydrofilowe cząstki, lipofilowe cząstki, cząstki rozdzielające, cząstki łącznika i cząstki terminujące. Różne cząstki w oligomerze są kowalencyjnie sprzężone z innymi albo za pomocą wiązań ulegających hydrolizie albo nie ulegających hydrolizie. [0073] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej dodatkowych hydrofilowych cząstek (tj. cząstek oprócz cząstki glikolu polialkilenowego) w tym, ale nie wyłącznie, cukry, glikole polialkilenowe i kopolimery poliaminy/PEG. Przylegające cząstki glikolu polialkilenowego będą uważane za tę samą cząstkę jeśli są sprzężone za pomocą wiązań eterowych. Na przykład, cząstka ????????-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4jest pojedynczą cząstką glikolu polietylenowego mającą sześć podjednostek glikolu polietylenowego. Jeśli ta cząstka była jedyną hydrofilową cząstką w oligomerze, oligomer nie będzie zawierał dodatkowej cząstki hydrofilowej. Przylegające cząstki glikolu polietylenowego będą uważane za różne cząstki 24 EP 1 613 343 B1 jeśli są sprzężone za pomocą wiązania innego niż wiązanie eterowe. Na przykład cząstka jest cząstką glikolu polietylenowego mającego cztery podjednostki glikolu polietylenowego i dodatkową cząstkę hydrofilową mającą dwie podjednostki glikolu polietylenowego. Oligomery zgodnie z pewnymi przykładami wykonania według niniejszego wynalazku mogą zawierać cząstkę glikolu polialkilenowego i żadnych dodatkowych cząstek hydrofilowych. [0074] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej lipofilowych cząstek co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Lipofilowa cząstka ma co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, lub 6 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może także mieć pomiędzy dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub atomów węgla i/lub między dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może mieć pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9, lub 10 atomów węgla i w pewnych przykładach wykonania lipofilowa cząstka ma 6 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może być, ale nie wyłącznie, cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego alkilu, cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego, cząstką cholesterolu i adamantanu. Przykładowe cząstki alkilowe obejmują, ale nie wyłącznie, cząstki nasyconego, liniowego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl, oktadecyl, nonadecyl i eikozyl; cząstki nasyconego, rozgałęzionego alkilu takiego jak izopropyl, secbutyl, tert-butyl, 2-metylobutyl, tert-pentyl, 2-metylo-pentyl, 3-metylopentyl, 2etyloheksyl, 2-propylopentyl; i cząstki nienasyconego alkilu otrzymane z 25 EP 1 613 343 B1 powyższych cząstek nasyconego alkilu w tym, ale nie wyłącznie, winyl, allil, 1butenyl, 2-butenyl, etynyl, 1-propynyl, i 2-propynyl. Przykładowe cząstki kwasu tłuszczowego obejmują, ale nie wyłącznie, cząstki nienasyconego kwasu tłuszczowego takie jak laurylo-oleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, oleinian, elaidynian, eikozapentaenian i erukanian, linolan, dokozaheksaenian; i linolenian, cząstki arachidonian, nasyconego kwasu tłuszczowego takie jak octan, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0075] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej cząsteczek rozdzielających co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Cząstki rozdzielający mogą na przykład być zastosowane do rozdzielenia hydrofilowej cząstki od cząstki lipofilowej, do rozdzielenia lipofilowej cząstki lub hydrofilowej cząstki od polipeptydu proinsuliny, do rozdzielenia hydrofilowej cząstki lub lipofilowej cząstki od drugiej hydrofilowej lub lipofilowej cząstki lub do rozdzielenia hydrofilowej cząstki lub lipofilowej cząstki od cząstki łącznika. Cząstki rozdzielające mogą być, ale nie wyłącznie cząstkami cukru, cholesterolu i gliceryny. Cząstki cukru mogą być różnymi cząstkami cukru co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, cząstkami monosacharydu i cząstkami disacharydu. Cząstki monosacharydu mogą mieć między 4 a 6 atomów węgla. [0076] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej cząstek łącznika, które są stosowane do sprzężenia oligomeru z polipeptydem proinsuliny co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Cząstkami łącznika mogą być, ale nie wyłącznie, cząstki alkilu i kwasu tłuszczowego. Cząstką łącznika alkilowego może być cząstka nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl, oktadecyl, nonadecyl, eikozyl, izopropyl, sec-butyl, tert-butyl, 2-metylobutyl, tert-pentyl, 2metylo-pentyl, 3-metylopentyl, 2-etyloheksyl, 2-propylopentyl, winyl, allil, 1butenyl, 2-butenyl, etynyl, 1-propynyl, i 2-propynyl. Cząstką alkoksylową mogą być różne cząstki alkoksylowe w tym, ale nie wyłącznie metoksyl, etoksyl, 26 EP 1 613 343 B1 propoksyl, butoksyl, nonyloksyl, tetradecyloksyl, pentyloksyl, decyloksyl, heksyloksyl, undecyloksyl, pentadecyloksyl, heptyloksyl, dodecyloksyl, heksadecyloksyl, oktyloksyl, tridecyloksyl, oktadecyloksyl, nonadecyloksyl, eikozyloksyl, izopropoksyl, sec-butoksyl, tert-butoksyl, 2metylobutoksyl, tert-pentyloksyl, 2-metylo-pentyloksyl, 3-metylopentyloksyl, 2etyloheksyloksyl, 2-propylopentyloksyl, winyloksyl, alliloksyl, 1-butenyloksyl, 2butenyloksyl, etynyloksyl, 1-propynyloksyl, i 2-propynyloksyl. Cząstka łącznika alkilowego może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla i może mieć między 1, 2, 3, 4 lub 5 a 8, 9, 10, 11 lub 12 atomów węgla. Cząstka łącznika kwasu tłuszczowego może być cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, laurylooleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, oleinian, elaidynian, erukanian, linolan, linolenian, arachidonian, eikozapentaenian, dokozaheksaenian; octan, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. Cząstka łącznika kwasu tłuszczowego może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla a także może mieć pomiędzy 1, 2, 3, 4, lub 5 a 8, 10, 12, 14 lub 16 atomów węgla. [0077] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej cząstek terminujących na jednym lub więcej końcach oligomeru, które nie są sprzężone z polipeptydem insuliny. Cząstką terminującą może być cząstka alkilu lub alkoksylu. Cząstka alkilu lub alkoksylu może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla. Cząstka alkilowa lub alkoksylowa może także mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14 atomów węgla, i/lub między dolną granicą 1, 2, 3, 4 lub 5 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 atomów węgla. W pewnych przykładach 27 EP 1 613 343 B1 wykonania cząstka alkilowa lub alkoksylowa może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3 lub 4 a górną granicą 5, 6 lub 7 atomów węgla. Cząstka alkilowa może być cząstką liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tertbutylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylo-pentylu, 3-metylopentylu, 2etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkoksylu mogą być różne cząstki alkoksylowe w tym, ale nie wyłącznie, metoksyl, etoksyl, propoksyl, butoksyl, pentyloksyl, heksyloksyl, heptyloksyl, oktyloksyl, nonyloksyl, decyloksyl, undecyloksyl, dodecyloksyl, tridecyloksyl, tetradecyloksyl, pentadecyloksyl, heksadecyloksyl, oktadecyloksyl, nonadecyloksyl, eikozyloksyl, izopropoksyl, sec-butoksyl, tert-butoksyl, 2-metylobutoksyl, pentyloksyl, 3-metylopentyloksyl, winyloksyl, alliloksyl, tert-pentyloksyl, 2-etyloheksyloksyl, 1-butenyloksyl, 2-metylo- 2-propylopentyloksyl, 2-butenyloksyl, etynyloksyl, 1- propynyloksyl, i 2-propynyloksyl. Cząstką terminującą może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tertbutyl, pentyl, lub tert-pentyl, lub cząstka niższego alkoksylu takiego jak metoksyl, etoksyl, propoksyl, izopropoksyl, butoksyl, sec-butoksyl, tert-butoksyl, pentyloksyl, lub tert-pentyloksyl. W pewnych przykładach wykonania cząstką terminującą jest metyl lub metoksyl. W związku z tym, że cząstką terminującą może być cząstka alkilu lub alkoksylu musi być zrozumiałe, że cząstką terminującą mogą być różne cząstki, co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, cząstki cukrów, cholesterolu, alkoholi, kwasów tłuszczowych i mPEG. [0078] Oligomer może zawierać strukturę o Wzorze I: ????????A-Lj-Gk-R-G'm-R'-G"n-T?????(I) gdzie 28 EP 1 613 343 B1 A oznacza cząstkę możliwą do zaktywowania; L oznacza cząstkę łącznika; G, G' i G" są oddzielnie wybranymi cząstkami rozdzielającymi; R oznacza cząstkę lipofilową i R' oznacza cząstkę glikolu polialkilenowego lub R' oznacza cząstkę lipofilową i R oznacza cząstkę glikolu polialkilenowego (tylko jedno z R lub R? musi być obecne i zwykle, gdy R? jest nieobecne, G?? także będzie nieobecne i R jest nieobecne, G także jest nieobecne); T oznacza cząstkę terminującą; i j, k, m i n oznaczają oddzielnie 0 lub 1. [0079] Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6 lub 7 podjednostek glikolu polialkilenowgo. Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 lub więcej podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może także mieć między dolną granicą 2, 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 podjednostek glikolu polialkilenowego, i/lub pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego. W pewnych przykładach wykonania cząstka glikolu polialkilenowego ma pomiędzy dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 podjednostek glikolu polialkilenowego i cząstka glikolu polialkilenowego może mieć 7 podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego oligomeru może być cząstka glikolu polialkilenowego niższego alkilu taka jak cząstka glikolu polietylenowego, cząstka glikolu polipropylenowego lub cząstka glikolu polibutylenowego. Gdy cząstką glikolu polialkilenowego jest cząstka glikolu polipropylenowego, cząstka może mieć jednorodną (tj. nie przypadkową) strukturę. Przykładowa cząstka glikolu polipropylenowego ma następującą jednorodną strukturę: 29 EP 1 613 343 B1 [0080] Ta jednorodna struktura glikolu polipropylenowego może być opisana jako mająca tylko jeden atom węgla podstawiony metylem przylegający do każdego atomu tlenu w łańcuchu glikolu polipropylenowego. Takie jednorodne cząstki glikolu polipropylenowego mogą wykazywać zarówno właściwości lipofilowe jak i hydrofilowe. [0081] Lipofilowa cząstka może być lipofilową cząstką co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Lipofilowa cząstka ma co najmniej 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 atomów węgla. Lipofilowa cząstka ma pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może także mieć między dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub atomów węgla i/lub może mieć między dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8 lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może mieć między dolną granicą 3, 4, 5, 6 lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9 lub 10 atomów węgla i lipofilowa cząstka może mieć 6 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może być, ale nie wyłącznie, cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego alkilu, cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego, cząstką cholesterolu i adamantanu. Przykładowe cząstki alkilowe obejmują, ale nie wyłącznie, cząstki nasyconego, liniowego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl, oktadecyl, nonadecyl i eikozyl; cząstki nasyconego, rozgałęzionego alkilu takiego jak izopropyl, secbutyl, tert-butyl, 2-metylobutyl, tert-pentyl, 2-metylo-pentyl, 3-metylopentyl, 2etyloheksyl, 2-propylopentyl; i cząstki nienasyconego alkilu otrzymane z powyższych cząstek nasyconego alkilu w tym, ale nie wyłącznie, winyl, allil, 1butenyl, 2-butenyl, etynyl, 1-propynyl, i 2-propynyl. Przykładowe cząstki kwasu tłuszczowego obejmują, ale nie wyłącznie, cząstki nienasyconego kwasu tłuszczowego takie jak laurylo-oleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, oleinian, elaidynian, eikozapentaenian i erukanian, linolan, dokozaheksaenian; i linolenian, cząstki arachidonian, nasyconego kwasu 30 EP 1 613 343 B1 tłuszczowego takie jak octan, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0082] Cząstki rozdzielające, G, G' i G" mogą być cząstkami rozdzielającymi co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Cząstkami rozdzielającymi mogą być, ale nie wyłącznie, cząstki cukru cząstki cholesterolu i gliceryny. Cząstki cukru mogą być różnymi cząstkami cukru co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, cząstkami monosacharydowymi i cząstkami disacharydowymi. Cząstki monosacharydowe mogą mieć między 4 a 6 atomów węgla. Oligomery według pewnych przykładów wykonania nie zawierają cząstek rozdzielających (tj. k, m i n oznaczają 0). [0083] Cząstka L może być zastosowana do sprzężenia oligomeru z lekiem (np. insuliną) co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Cząstkami łącznika mogą być, ale nie wyłącznie, cząstki alkilu i kwasu tłuszczowego. Cząstką łącznika alkilowego może być cząstka nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylopentylu, 3-metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkoksylową mogą być różne cząstki alkoksylowe w tym, ale nie wyłącznie metoksyl, etoksyl, propoksyl, butoksyl, nonyloksyl, tetradecyloksyl, pentyloksyl, decyloksyl, heksyloksyl, undecyloksyl, pentadecyloksyl, heptyloksyl, dodecyloksyl, heksadecyloksyl, oktyloksyl, tridecyloksyl, oktadecyloksyl, nonadecyloksyl, eikozyloksyl, izopropoksyl, sec-butoksyl, tert-butoksyl, 2metylobutoksyl, tert-pentyloksyl, 2-metylo-pentyloksyl, 3-metylopentyloksyl, 2etyloheksyloksyl, 2-propylopentyloksyl, winyloksyl, alliloksyl, 1-butenyloksyl, 2butenyloksyl, etynyloksyl, 1-propynyloksyl, i 2-propynyloksyl. Cząstka łącznika alkilowego może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów 31 EP 1 613 343 B1 węgla i może mieć między 1, 2, 3, 4 lub 5 a 8, 9, 10, 11 lub 12 atomów węgla. Cząstka łącznika kwasu tłuszczowego może być cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, laurylooleinian, mirystylo-oleinian, palmityko-oleinian, oleinian, elaidynian, erukanian, linolan, linolenian, arachidonian, eikozapentaenian, dokozaheksaenian; octan, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. Cząstka łącznika kwasu tłuszczowego może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla a także może mieć pomiędzy 1, 2, 3, 4, lub 5 a 8, 10, 12, 14 lub 16 atomów węgla. [0084] Cząstką terminującą T może być cząstka alkilu lub alkoksylu. Cząstka alkilu lub alkoksylu może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla. Cząstka alkilowa lub alkoksylowa może także mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14 atomów węgla, i/lub między dolną granicą 1, 2, 3, 4 lub a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 atomów węgla. W pewnych przykładach wykonania cząstka alkilowa lub alkoksylowa może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3 lub 4 a górną granicą 5, 6 lub 7 atomów węgla. Cząstka alkilowa może być cząstką liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tertpentylu, 2-metylo-pentylu, 3-metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Przykładowymi cząstkami alkoksylu mogą być różne cząstki alkoksylowe w tym, ale nie wyłącznie, metoksyl, etoksyl, propoksyl, butoksyl, pentyloksyl, heksyloksyl, heptyloksyl, oktyloksyl, nonyloksyl, decyloksyl, undecyloksyl, 32 EP 1 613 343 B1 dodecyloksyl, tridecyloksyl, tetradecyloksyl, pentadecyloksyl, heksadecyloksyl, oktadecyloksyl, nonadecyloksyl, eikozyloksyl, izopropoksyl, sec-butoksyl, tertbutoksyl, 2-metylobutoksyl, metylopentyloksyl, tert-pentyloksyl, 2-etyloheksyloksyl, 2-metylo-pentyloksyl, 2-propylopentyloksyl, 3- winyloksyl, alliloksyl, 1-butenyloksyl, 2-butenyloksyl, etynyloksyl, 1-propynyloksyl, i 2propynyloksyl. Cząstką terminującą może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, lub tertpentyl, lub cząstka niższego alkoksylu takiego jak metoksyl, etoksyl, propoksyl, izopropoksyl, butoksyl, sec-butoksyl, tert-butoksyl, pentyloksyl, lub tertpentyloksyl. W pewnych przykładach wykonania cząstką terminującą jest metyl lub metoksyl. W związku z tym, że cząstką terminującą może być cząstka alkilu lub alkoksylu musi być zrozumiałe, że cząstką terminującą mogą być różne cząstki, co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, cząstki cukrów, cholesterolu, alkoholi, kwasów tłuszczowych i mPEG. [0085] Możliwą do aktywacji cząstką A może być cząstka, która pozwala na sprzężenie oligomeru ze środkiem aktywującym tworząc zaktywowany oligomer zdolny do sprzężenia z polipeptydem proinsuliny. Możliwą do aktywacji cząstką mogą być różne możliwe do aktywacji cząstki co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, -C(O)-OH, C(S)-OH, -C(S)-SH, -OH, -SH, i NH2. [0086] Oligomer może zawierać strukturę o Wzorze II: ????????A-X(CH2)mY(C2H4O)nR?????(II) gdzie: A oznacza -C(O)-OH, C(S)-OH, -C(S)-SH, -OH, -SH, lub NH2; X oznacza atom tlenu lub wiązanie kowalencyjne z zastrzeżeniem że X nie oznacza atomu tlenu, gdy A oznacza ?OH; Y oznacza cząstkę wiążącą ester, eter, karbaminian, węglan lub amid i może oznaczać cząstkę wiążącą eter; m jest między dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 33 EP 1 613 343 B1 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30, i może być między dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub 22, a także może być między dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14, i/lub między dolną granicą 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9, lub 10; n jest między dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10,11,12,13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, lub 50, i może być między dolną granicą 2, 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20, a także może być między dolną granicą 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego, i/lub pomiędzy dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 podjednostek glikolu polialkilenowego i w pewnych przykładach wykonania wynosi 7; m i n oba nie oznaczają 0; i R oznacza cząstkę alkilową, cząstkę cukru, cholesterolu, adamantanu, cząstkę alkoholu lub cząstkę kwasu tłuszczowego. Cząstką alkilową mogą być cząstki liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylo-pentylu, 3metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkilową może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, lub tert-pentyl. Cząstką alkilową może także być C1 do C3 alkil. Cząstką alkilową w pewnych przykładach wykonania jest metyl. Cząstką kwasu tłuszczowego może być cząstka nasyconego lub nienasyconego liniowego lub rozgałęzionego kwasu 34 EP 1 613 343 B1 tłuszczowego co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, laurylo-oleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, oleinian, elaidynian, eikozapentaenian, erukanian, linolan, dokozaheksaenian; linolenian, octan, arachidonian, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0087] Oligomer może zawierać strukturę o Wzorze III: ????????A-(CH2)m(OC2H4)nOR?????(III) gdzie: A oznacza -C(O)-OH, C(S)-OH, -C(S)-SH, -OH, -SH, lub NH2; m jest pomiędzy dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 i może być między dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub 22, a także może być pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14, i/lub pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9, lub 10; n jest pomiędzy dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, lub 50, i może być między dolną granicą 2, 3, 4, 5, lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20, a także może być między dolną granicą 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego, i/lub pomiędzy dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 podjednostek glikolu polialkilenowego a w pewnych przykładach wykonania wynosi 7; m i n oba nie oznaczają 0; i R oznacza cząstkę alkilową, cząstkę cukru, cholesterolu, adamantanu, cząstkę alkoholu lub cząstkę kwasu tłuszczowego. Cząstką alkilową mogą być cząstki liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub 35 EP 1 613 343 B1 nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylo-pentylu, 3metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkilową może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, lub tert-pentyl. Cząstką alkilową może także być C1 do C3 alkil. Cząstką alkilową w pewnych przykładach wykonania jest metyl. Cząstką kwasu tłuszczowego może być cząstka nasyconego lub nienasyconego liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, laurylo-oleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, oleinian, elaidynian, eikozapentaenian, erukanian, linolan, dokozaheksaenian; linolenian, octan, arachidonian, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0088] Oligomer może zawierać Struktuę o Wzorze IV: gdzie: m jest między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30, i może być między dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub 22, a także może być pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14, i/lub pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9, lub 10; 36 EP 1 613 343 B1 n jest pomiędzy dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, lub 50, i może być między dolną granicą 2, 3, 4, 5, lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20, a także może być między dolną granicą 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego, i/lub pomiędzy dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 podjednostek glikolu polialkilenowego a w pewnych przykładach wykonania wynosi 7; R oznacza cząstkę alkilową, cząstkę cukru, cholesterolu, adamantanu, cząstkę alkoholu lub cząstkę kwasu tłuszczowego. Cząstką alkilową mogą być cząstki liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylo-pentylu, 3metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkilową może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, lub tert-pentyl. Cząstką alkilową może także być C1 do C3 alkil. Cząstką alkilową w pewnych przykładach wykonania jest metyl. Cząstką kwasu tłuszczowego może być cząstka nasyconego lub nienasyconego liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, laurylo-oleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, oleinian, elaidynian, eikozapentaenian, erukanian, linolan, dokozaheksaenian; linolenian, octan, arachidonian, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0089] Oligomer może zawierać strukturę o Wzorze V: 37 EP 1 613 343 B1 [0090] Oligomer może być kowalencyjnie sprzężony z polipeptydem insuliny w postaci insuliny będącej lekiem. Na przykład oligomer może zawierać strukturę Va: gdzie insulina będąca lekiem jest polipeptydem insuliny jak opisano w niniejszym zgłoszeniu. Gdy insulina w postaci leku jest ludzką insuliną i koniugat o Wzorze Va składa się z pojedynczego oligomeru sprzężonego z Lizyną w pozycji B29 ludzkiej insuliny, koniugat insulina-oligomer jest określany jako HIM2. [0091] Oligomer może być sprzężony z polipeptydem insuliny przy zastosowaniu wiązania ulegającego hydrolizie (np. wiązania estrowego lub węglanowego). Możliwe do zhydrolizowania sprzężenie może dostarczyć koniugat polipeptyd insuliny-oligomer, który działa jak prolek. W pewnych przykładach, na przykład gdzie koniugat polipeptyd insuliny-oligomer jest biologicznie nieaktywny (np. koniugat nie posiada zdolności do oddziaływania na organizm przez główny mechanizm działania polipeptydu insuliny), możliwe do zhydrolizowania sprzężenie może zapewnić działanie przedłużonego lub kontrolowanego uwalniania, zapewniając biologicznie aktywny peptyd insuliny przez określony czas, gdy jeden lub więcej oligomerów zostanie odciętych od ich odpowiednich biologicznie nieaktywnych koniugatów polipeptyd insulinyoligomer zapewniając biologicznie aktywny polipeptyd insuliny. W pewnych przykładach wykonania, oligomer może być odcięty od polipeptydu proinsuliny lub polipeptydu insuliny dając insulinę. Możliwe do zhydrolizowania wiązanie może być zawarte w oligomerze, aby uzyskać prolek, który daje sprzężoną 38 EP 1 613 343 B1 aktywną cząstkę. [0092] Oligomer zastosowaniu może być wiązania nie sprzężony z polipeptydem ulegającego hydrolizie insuliny (np. przy wiązania karbaminianowego, amidowego lub eterowego). Zastosowanie wiązania nie ulegającego hydrolizie może być preferowane, gdy jest pożądane umożliwienie biologicznie aktywnemu koniugatowi polipeptyd insuliny-oligomer na krążenie we krwi przez wydłużony okres czas, korzystnie co najmniej 2 godziny. Gdy oligomer jest sprzężony z polipeptydem insuliny przy zastosowaniu cząstki wiążącej, która zawiera cząstkę karbonylu, taką jak cząstka wiążąca ester, karbaminian, węglan lub amid, otrzymany koniugat polipeptyd insuliny-oligomer jest koniugatem polipeptyd insuliny-acylo-oligomer. [0093] Oligomery opisane powyżej są komercyjnie dostępne lub mogą być zsyntetyzowane za pomocą różnych sposobów co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Na przykład polirozproszone oligomery mogą być zsyntetyzowane za pomocą sposobów dostarczonych w jednym lub więcej z następujących odniesień: Amerykańskim Patencie Nr 4,179,337 Davis i in.; Amerykańskim Patencie Nr 5,567,422 Greenwald; Amerykańskim Patencie Nr 5,359,030 Ekwuribe; Amerykańskim Patencie Nr 5,438,040 Ekwuribe, Amerykańskim Patencie Nr 5,681,811 Ekwuribe, Amerykańskim Patencie Nr 6,309,633 Ekwuribe i in. Nie-polirozproszone (np., zasadniczo monorozproszone i monorozproszone) oligomery mogą być zsyntetyzowane za pomocą sposobów dostarczonych w jednym lub więcej następujących odniesieniach: Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Nr Seryjnym 09/873,731 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Methods of Synthesizing Substantially Monodispersed Mixtures of Polymers Having Polyethylene Glycol Mixtures"; Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Nr Seryjnym 09/873,797 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Mixtures of Drug-Oligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol, Uses Thereof, and Methods of Making Same"; i Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Nr Seryjnym 09/873,899 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Mixtures of Insulin Drug-Oligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol, Uses Thereof, and Methods of 39 EP 1 613 343 B1 Making Same". Oligomery mogą być zasadniczo monorozproszone a także mogą być monorozproszone. Przykładowe sposoby do syntezy monorozproszonych oligomerów są dostarczone w Przykładach dostarczonych w niniejszym zgłoszeniu. [0094] Zetknięcie polipeptydu proinsuliny z oligomerem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer może być przeprowadzone przy zastosowaniu różnych warunków co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Zetknięcie polipeptydu proinsuliny z oligomerem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptydu proinsulinyoligomeru obejmuje zetknięcie oligomeru ze środkiem aktywującym w warunkach odpowiednich do dostarczenia aktywowanego oligomeru; i zetknięcie aktywowanego oligomeru z polipeptydem proinsuliny w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptydu proinsuliny. Aktywowany oligomer może być utworzony ex situ lub in situ. [0095] Środkiem aktywującym mogą być różne środki aktywujące zdolne do aktywowania jednego lub więcej oligomerów opisanych powyżej tak że oligomer jest zdolny do reagowania z nukleofilowymi hydroksylowymi grupami funkcyjnymi i/lub aminowymi grupami funkcyjnymi w polipeptydzie proinsuliny co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, Nhydroksysukcynoimid, chloromrówczan p-nitrofenylu, 1,3- dicykloheksylokarbodiimid i hydroksybenzotriazyd. [0096] Znawca z dziedziny zrozumie warunki odpowiednie do sprzęgania środka aktywującego z oligomerem, aby dostarczyć aktywowany oligomer. Na przykład znawca COMPREHENSIVE z dziedziny ORGANIC może odnieść się TRANSFORMATIONS. do A R.C. Larock, GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS (2-gie Wydanie, Nowy Jork, WileyVCH, 1999) [0097] Warunki odpowiednie do sprzężenia aktywowanego oligomeru z polipeptydem proinsuliny będą zrozumiałe dla znawcy z dziedziny. Na przykład polipeptyd proinsuliny może być rozpuszczony w dipolarnym aprotonowym rozpuszczalniku takim jak dimetylosulfotlenek, dostarczając roztwór polipeptydu proinsuliny. Środek buforujący taki jak trietyloamina może zostać dodany do 40 EP 1 613 343 B1 roztworu polipeptydu proinsuliny. Aktywowany oligomer rozpuszczony w bezwodnym rozpuszczalniku takim jak acetonitryl może następnie być dodany do roztworu polipeptydu proinsuliny. Znawca z dziedziny może także odnieść się do R.C. Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS. A GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS (2-gie Wydanie, Nowy Jork, Wiley-VCH, 1999). Stosunek molowy aktywowanego oligomeru do polipeptydu proinsuliny może być większy niż około 1:1, większy niż około 2:1, większy niż około 3:1, większy niż około 4:1, i/lub większy niż około 5:1. [0098] Więcej niż jeden oligomer (tj. wiele oligomerów) może być sprzężonych z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny. Alternatywnie oligomer (y) może być sprzężony z częścią polipeptydu nie-insulinowego polipeptydu proinsuliny na przykład w celu ułatwienia oczyszczenia sprzężonej insuliny. Wiele oligomerów może być takich samych. Jednak należy zrozumieć, że wiele oligomerów może różnić się od siebie lub alternatywnie, niektóre z wielu oligomerów mogą być takie same a niektóre mogą być inne. Gdy wiele oligomerów jest sprzężonych z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny, jeden lub więcej z oligomerów może być sprzężonych z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny za pomocą wiązań ulegających hydrolizie i jeden lub więcej oligomerów może być sprzężonych z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny za pomocą wiązań nie ulegających hydrolizie. Alternatywnie, wszystkie wiązania sprzęgające wiele oligomerów z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny może ulegać hydrolizie ale mieć różne stopnie hydrolizowalności tak, że na przykład jeden lub więcej oligomerów jest szybko usuwane z polipeptydu insuliny lub części polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny za pomocą hydrolizy w organizmie i jeden lub więcej oligomerów jest powoli usuwanych z polipeptydu insuliny lub części polipeptydu insuliny przez hydrolizę w organizmie. [0099] Oligomer może być sprzężony z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny i opcjonalnie z częścią polipeptydu nie-insulinowego polipeptydu proinsuliny w różnych nukleofilowych resztach części polipeptydu insuliny i/lub części polipeptydu nie-insulinowego, w tym, ale nie wyłącznie, nukleofilowych hydroksylowych grupach funkcyjnych i/lub aminowych grupach funkcyjnych. 41 EP 1 613 343 B1 Nukleofilową hydroksylową grupę funkcyjną można znaleźć na przykład w resztach seryny i/lub tyrozyny i nukleofilową aminową grupę funkcyjną może znaleźć na przykład w resztach histydyny i/lub lizyny, i/lub na jednym lub więcej N-końcach polipeptydu. Gdy oligomer jest sprzężony z jednym lub więcej Nkońcami polipeptydu proinsuliny, sprzężenie może dać drugorzędową aminę. Gdy polipeptyd proinsuliny ma peptyd wiodący sprzężony z N-końcem polipeptydowego łańcucha B, N-końce cząsteczki insuliny mogą być zabezpieczone przed sprzężeniem (np. acylacją). Gdy polipeptydem proinsuliny jest ludzka proinsulina mająca peptyd wiodący sprzężony z N-końcem łańcucha B, na przykład, oligomer może być sprzężony z trzema aminowymi grupami funkcyjnymi proinsuliny: N-końcem peptydu wiodącego, aminową grupą funkcyjną reszty Lys w peptydzie C, aminową grupą funkcyjną LysB29. Po rozcięciu peptydu wiodącego i peptydu C, odkryto, że oligomer jest miejscowoswoiście sprzężony z LysB29 insuliny dostarczając pojedynczy koniugat insuliny, mono-skoniugowaną insulinę z oligomerem w LysB29. [0100] Odcięcie jednego lub więcej peptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer dostarczając koniugat polipeptyd insuliny-oligomer może być przeprowadzone za pomocą różnych procesów co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. W pewnych przykładach wykonania odcięcie jednego lub więcej peptydów od koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer obejmuje zetknięcie koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer z jednym lub więcej enzymami, które są zdolne do rozcięcia wiązania (-ań) pomiędzy jednym lub więcej peptydami od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer. Jak opisano w różnych odniesieniach, na przykład Kemmler i in. "Studies on the Conversion of Proinsulin to Insulin," J. Biol. Chem., 246: 6786-6791 (1971), znawca z dziedziny zrozumie jak wybrać odpowiednie enzymy biorąc pod uwagę określone wiązanie (-ania) peptydowe, które ma być rozcięte i jak zapewnić warunki odpowiednie do odcięcia jednego lub więcej peptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer. Jeden lub więcej enzymów może na przykład obejmować różne enzymy, w tym, ale nie wyłącznie, trypsynę, chymotrypsynę, karboksypeptydazę B i ich mieszaniny. W pewnych przykładach wykonania, jednym lub więcej enzymami są trypsyna, karboksypeptydaza B i ich 42 EP 1 613 343 B1 mieszaniny. [0101] Peptyd łączący może mieć końcową resztę aminokwasową na pierwszym końcu. Odcięcie peptydu łączącego od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer może obejmować zetknięcie koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer z pierwszym enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu końcowa reszta aminokwasowa-polipeptyd insulinyoligomer i zetknięcie koniugatu końcowa reszta aminokwasowa-polipeptyd insuliny-oligomer z drugim enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer. Zetknięcie koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer z pierwszym enzymem i zetknięcie koniugatu polipeptyd insuliny o końcowej reszcie aminokwasowej-oligomer z drugim enzymem może wystąpić zasadniczo jednocześnie, na przykład gdy pierwszy enzym i drugi enzym są dostarczone w postaci mieszaniny albo koktajlu. W pewnych przykładach wykonania pierwszym enzymem może być trypsyna a drugim enzymem może być karboksypeptydaza B. Końcową resztą aminokwasową może być jakakolwiek z różnych reszt taka jak reszta argininy lub reszta glu, z których ta ostatnia może być rozcięta za pomocą glu-Cpeptydazy. Na przykład końcową resztą aminokwasową może być reszta argininy, gdy polipeptydem insuliny jest insulina i peptydem łączącym jest ludzki peptyd C. [0102] Odcięcie jednego lub więcej peptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer dostarcza produkt koniugat polipeptyd insuliny-oligomer, który składa się z pojedynczego koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer (tj. zasadniczo pozbawionego dodatkowych koniugatów polipeptyd insulinyoligomer). Produkt koniugat polipeptyd insuliny-oligomer może także składać się z pojedynczego monokoniugatu polipeptyd insuliny-oligomer. Na przykład w przykładach wykonania opisanych powyżej, w których polipeptyd proinsuliny zawiera polipeptyd insuliny mający łańcuch polipeptydowy A pozbawiony reszt lizyny i łańcuch polipeptydowy B zawierający pojedynczą resztę lizyny, produkt koniugat polipeptyd insuliny-oligomer może składać się z pojedynczego monokoniugatu polipeptyd insuliny-oligomer, gdzie oligomer jest sprzężony z resztą lizyny łańcucha polipeptydowego B. W kolejnym przykładzie, gdy 43 EP 1 613 343 B1 polipeptydem proinsuliny jest proinsulina z peptydem wiodącym, odcięcie peptydu C i peptydu wiodącego od koniugatu proinsulina-oligomer dostarcza monokoniugat insulina-oligomer, gdzie insulina jest mono-skoniugowana w LysB29. [0103] Przykłady wykonania sposobów do syntetyzy koniugatów polipeptyd insuliny-oligomer opisane powyżej mogą skutkować wydajnością koniugatów i/lub dikoniugatów polipeptyd insuliny-oligomer, która jest większa niż 75, 76, 77, 78, lub 79 procent. W pewnych przykładach wykonania wydajność jest większa niż 80, 81, 82, 83, 84, lub 85 procent. W pewnych innych przykładach wykonania wydajność jest większa niż 86, 87, 88, 89, lub 90 procent. W jeszcze innych przykładach wykonania wydajność jest większa niż 91, 92, 93, 94 lub 95 procent. Gdy koniugat polipeptyd proinsuliny-oligomer jest dostarczony przez zetknięcie aktywowanego oligomeru z koniugatem polipeptyd proinsulinyoligomer, nadmiar aktywowanych oligomerów może zostać wykorzystany w osiągnięciu wyższych wydajności. Na przykład wydajności opisane w niniejszym zgłoszeniu mogą zostać otrzymane w różnych przykładach wykonania przez zastosowanie stosunku molowego aktywowanego oligomeru do polipeptydu proinsuliny większego niż około 2:1, większego niż około 3:1, większego niż około 4:1, i/lub większego niż około 5:1. W niektórych przykładach wykonania, wydajności większe niż 91, 92, 93, 94 lub 95 procent są otrzymywane przy zastosowaniu molowego stosunku aktywowanego oligomeru do polipeptydu proinsuliny większego niż około 4:1, i w niektórych przykładach wykonania większego niż około 5:1. [0104] Dostarczone są sposoby do syntezy koniugatu polipeptyd proinsulinyoligomer, które obejmują zetknięcie polipeptydu proinsuliny zawierającego polipeptyd insuliny sprzężony z jednym lub więcej peptydami za pomocą wiązania (-ań) peptydowego możliwego do rozcięcia dając polipeptyd insuliny z oligomerem w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny i dostarczając koniugat polipeptyd proinsuliny-oligomer. Na przykład koniugaty proinsulina-oligomer mogą zostać zsyntetyzowane jak opisano w Przykładach dostarczonych poniżej. Przykład wykonania szlaku syntezy jest dostarczony na Figurze 1. 44 EP 1 613 343 B1 [0105] Polipeptydem proinsuliny mogą być różne polipeptydy proinsuliny zawierające polipeptyd insuliny sprzężony z jednym lub więcej peptydami za pomocą wiązania (-ań) peptydowego możliwego do rozcięcia dając polipeptyd insuliny co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, proinsulina, analogi proinsuliny, fragmenty proinsuliny, analogi fragmentu proinsuliny, miniproinsulina, SCIP lub białka fuzyjne. Polipeptydem proinsuliny może być analog proinsuliny mający peptyd wiodący. Analog proinsuliny mający peptyd wiodący może zostać otrzymany na przykład od from Itoham Foods, Inc. of Ibaraki Pref, Japonia. Peptyd wiodący i peptyd C analogu proinsuliny są każdy pozbawiony reszt lizyny. Polipeptydem proinsuliny może być polipeptyd proinsuliny, który może zostać otrzymany na przykład od Biobras of Belo Horizonte, Brazylia. Polipeptyd proinsuliny ma peptyd wiodący sprzężony z N-końcem łańcucha B proinsuliny. Peptyd wiodący jest pozbawiony reszt lizyny. [0106] Polipeptyd insuliny może mieć łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B. Łańcuch polipeptydowy A może być pozbawiony reszt lizyny. Łańcuch polipeptydowy B może zawierać pojedynczą resztę lizyny. Łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B mogą być wzajemnie połączone i mogą być wzajemnie połączone przy zastosowaniu jednego lub więcej wiązań disiarczkowych. Łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B każdy może zawierać reszty cysteiny, z których jedna lub więcej jest sprzężonych przy zastosowaniu jednego lub więcej wiązań disiarczkowych do wzajemnego połączenia łańcucha polipeptydowego A z łańcuchem polipeptydowym B. Polipeptydem insuliny może być insulina, analog insuliny, fragment insuliny lub fragment analogu insuliny. [0107] Jeden lub więcej peptydów sprzężonych z polipeptydem insuliny może zawierać peptyd łączący sprzężony w pierwszym końcu z C-końcem łańcucha polipeptydowego B i w drugim końcu z N-końcem łańcucha polipeptydowego A. Ogólnie, sekwencja aminokwasowa peptydu łączącego nie jest najważniejsza i peptydem łączącym mogą być różne peptydy łączące co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, polipeptydy peptydu C, peptydy C i peptydy łączące w miniproinsulinach. Peptyd łączący może być 45 EP 1 613 343 B1 pozbawiony reszt lizyny. Te przykłady wykonania mogą wykorzystać mniej oligomerycznych odczynników przez zmniejszenie liczby możliwych miejsc sprzężenia na cząsteczce polipeptydu proinsuliny. [0108] Dostarczony jest sposób syntezy koniugatu polipeptyd peptydu Coligomer, który obejmuje zetknięcie polipeptydu pro-peptydu C zawierającego polipeptyd peptydu C sprzężony z jednym lub więcej peptydami za pomocą wiązania (-ań) peptydowego, które jest możliwe do rozcięcia dając polipeptyd peptydu C z oligomerem w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z częścią polipeptydu peptydu C polipeptydu pro-peptydu C i dostarczając koniugat polipeptyd pro-peptydu C oraz odcięcie jednego lub więcej peptydów od koniugatu polipeptyd pro-peptydu C-oligomer dostarczając koniugat polipeptyd peptydu C-oligomer. [0109] Polipeptydem pro-peptydu C mogą być różne polipeptydy pro-peptydu C co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Polipeptydem pro-peptydu C może być polipeptyd proinsuliny a w pewnych przykładach wykonania polipeptydem pro-peptydu-C jest insulina. [0110] Polipeptydem peptydu C mogą być różne polipeptydy peptydu C co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. W pewnych przykładach wykonania polipeptydem peptydu C jest peptyd C. [0111] Jednym lub więcej peptydami sprzężonymi z polipeptydem peptydu C mogą być różne peptydy co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Jeden lub więcej peptydów może zawierać polipeptyd insuliny i/lub jednym lub więcej polipeptydami może być polipeptyd insuliny. Polipeptyd insuliny może być pozbawiony reszt lizyny, które mogą zmniejszyć ilość oligomerycznych odczynników wykorzystanych do sprzężenia polipeptydu pro-peptydu-C. Jednym lub więcej peptydami może także być insulina lub insulina sprzężona na N-końcu łańcucha B z peptydem wiodącym. [0112] Wiązania peptydowe są wiązaniami, które mogą być rozcięte na różne sposoby co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Wiązania peptydowe mogą być wiązaniami, które mogą być enzymatycznie rozcięte za pomocą enzymów w tym, ale nie wyłącznie, trypsyny, karboksypeptydazy B, trombiny, pepsyny i chymotrypsyny. Wiązania peptydowe, które mogą być 46 EP 1 613 343 B1 enzymatycznie rozcięte będą zrozumiałe przez znawców z dziedziny i obejmują, ale nie wyłącznie Arg-Arg, Thr-Arg, Ala-Arg, Thr-Arg-Arg, Thr-Lys, Arg-Gly i Arg-Phe. [0113] Oligomerem mogą być różne oligomery co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Ogólnie oligomerem może być jakikolwiek oligomer możliwy do sprzężenia z polipeptydem co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Na przykład oligomerem może być polirozproszony oligomer jak opisano w Amerykańskim Patencie Nr 4,179,337 Davis i in.; Amerykańskim Patencie Nr 5,567,422 Greenwald; Amerykańskim Patencie Nr 5,359,030 Ekwuribe; Amerykańskim Patencie Nr 5,438,040 Ekwuribe, Amerykańskim Patencie Nr 5,681,811 Ekwuribe, i Amerykańskim Patencie Nr 6,309,633 Ekwuribe i in. W kolejnym przykładzie oligomerem może być nie- polirozproszony oligomer jak opisano w Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Numerze Seryjnym 09/873,731 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Methods of Synthesizing Substantially Monodispersed Mixtures of Polymers Having Polyethylene Glycol Mixtures"; Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Numerze Seryjnym 09/873,797 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Mixtures of Drug-Oligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol, Uses Thereof, and Methods of Making Same"; i Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Numerze Seryjnym 09/873,899 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Mixtures of Insulin Drug-Oligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol, Uses Thereof, and Methods of Making Same." [0114] Oligomer może zawierać, składać się zasadniczo z lub składać się z hydrofilowej cząstki co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, glikoli polialkilenowych takich jak glikol polietylenowy lub glikol polipropylenowy, polioksyetylenowanych polioli, ich kopolimerów i ich blokowych kopolimerów, pod warunkiem, że zachowana jest hydrofilowość blokowych kopolimerów. Cząstką hydrofilową może być cząstka glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6 lub 7 podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 47 EP 1 613 343 B1 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 lub więcej podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może także mieć między dolną granicą 2, 3, 4, 5, lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 podjednostek glikolu polialkilenowego, i/lub pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może także mieć między dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 podjednostek glikolu polialkilenowego i w pewnych przykładach wykonania cząstka glikolu polialkilenowego ma 7 podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego oligomeru może być cząstką glikolu polialkilenowego niższego alkilu taką jak cząstka glikolu polietylenowego, cząstka glikolu polipropylenowego lub cząstka glikolu polibutylenowego. Gdy cząstką glikolu polialkilenowego jest cząstka glikolu polipropylenowego, cząstka może mieć jednorodną (tj. nie przypadkową) strukturę. Przykładowa cząstka glikolu polipropylenowego ma następującą jednorodną strukturę: Ta jednorodna struktura glikolu polipropylenowego może być opisana jako mająca tylko jeden atom węgla podstawiony metylem przylegający do każdego atomu tlenu w łańcuchu glikolu polipropylenowego. Takie jednorodne cząstki glikolu polipropylenowego mogą wykazywać zarówno właściwości lipofilowe jak i hydrofilowe. [0115] Oligomer może zawierać jedną lub więcej innych cząstek co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, dodatkowe cząstki hydrofilowe, cząstki lipofilowe, cząstki rozdzielające, cząstki łącznika i cząstki terminujące. Różne cząstki w oligomerze są kowalencyjnie sprzężone z innymi albo za pomocą wiązań ulegających albo nie ulegających hydrolizie. [0116] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej dodatkowych cząstek hydrofilowych (tj. cząstek oprócz cząstki glikolu polialkilenowego) w 48 EP 1 613 343 B1 tym, ale nie wyłącznie, cukry, glikole polialkilenowe i kopolimery poliamina/PEG. Przylegające cząstki glikolu polialkilenowego będą uważane za tę samą cząstkę jeśli są sprzężone za pomocą wiązań eterowych. Na przykład cząstka ????????-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4jest pojedynczą cząstką glikolu polietylenowego mającą sześć podjednostek glikolu polietylenowego. Jeśli ta cząstka była jedyną hydrofilową cząstką w oligomerze, oligomer nie będzie zawierał dodatkowej cząstki hydrofilowej. Przylegające cząstki glikolu polietylenowego są uważane za różne cząstki jeśli są sprzężone za pomocą wiązania innego niż wiązanie eterowe. Na przykład cząstka jest cząstką glikolu polietylenowego mającą cztery podjednostki glikolu polietylenowego i dodatkową hydrofilową cząstkę mającą dwie podjednostki glikolu polietylenowego. Oligomery zgodnie z różnymi przykładami wykonania niniejszego wynalazku zawierają cząstkę glikolu polialkilenowego i żadnych dodatkowych cząstek hydrofilowych. [0117] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej lipofilowych cząstek co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Lipofilowa cząstka ma co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, lub 6 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może także mieć między dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub atomów węgla, i/lub między dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8 lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może także mieć pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6 lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9 lub 10 atomów węgla i w pewnych przykładach wykonania lipofilowa cząstka ma 6 atomów 49 EP 1 613 343 B1 węgla. Lipofilowa cząstka może być cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego alkilu, cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego, cząstką cholesterolu i adamantanu. Przykładowe cząstki alkilowe obejmują, ale nie wyłącznie, cząstki nasyconego, liniowego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl, oktadecyl, nonadecyl and eikozyl; cząstki nasyconego, rozgałęzionego alkilu takiego jak izopropyl, sec-butyl, tert-butyl, 2-metylobutyl, tert-pentyl, 2-metylo-pentyl, 3-metylopentyl, 2-etyloheksyl, 2-propylopentyl; i cząstki nienasyconego alkilu otrzymane z powyższych cząstek nasyconego alkilu w tym, ale nie wyłącznie, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1propynylu, i 2-propynylu. Przykładowe cząstki kwasu tłuszczowego obejmują, ale nie wyłącznie cząstki nienasyconego kwasu tłuszczowego takie jak laurylooleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, oleinian, elaidynian, erukanian, linolan, linolenian, arachidonian, eikozapentaenian, dokozaheksaenian; octan, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0118] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej cząstek rozdzielających co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Cząstki rozdzielające mogą na przykład być zastosowane do rozdzielenia hydrofilowej cząstki od lipofilowej cząstki, do rozdzielenia lipofilowej cząstki lub hydrofilowej cząstki od polipeptydu peptydu C, do rozdzielenia pierwszej hydrofilowej lub lipofilowej cząstki od drugiej hydrofilowej lub lipofilowej cząstki lub do rozdzielenia hydrofilowej cząstki lub lipofilowej cząstki od cząstki łącznika. Cząstkami rozdzielającymi mogą być, ale nie wyłącznie cząstki cukru, cholesterolu i gliceryny. Cząstkami cukru mogą być różne cząstki cukru co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, cząstki monosacharydu i cząstki disacharydu. Cząstki monosacharydu mogą mieć między 4 a 6 atomów węgla. [0119] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej cząstek łącznika, które są stosowane do sprzężenia oligomeru z polipeptydem peptydu C co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Cząstkami łącznika mogą być, 50 EP 1 613 343 B1 ale nie wyłącznie cząstki alkilu i kwasu tłuszczowego. Cząstką łącznika alkilowego może być cząstka nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tertbutylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylo-pentylu, 3-metylopentylu, 2etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkoksylu mogą być różne cząstki alkoksylu, w tym ale nie wyłącznie, metoksylu, etoksylu, propoksylu, butoksylu, pentyloksylu, heksyloksylu, heptyloksylu, oktyloksylu, nonyloksylu, decyloksylu, undecyloksylu, dodecyloksylu, tridecyloksylu, tetradecyloksylu, pentadecyloksylu, heksadecyloksylu, oktadecyloksylu, nonadecyloksylu, eikozyloksylu, izopropoksylu, sec-butoksylu, tert-butoksylu, 2-metylobutoksylu, tert-pentyloksylu, 2-metylo-pentyloksylu, etyloheksyloksylu, butenyloksylu, 2-propylopentyloksylu, 2-butenyloksylu, 3-metylopentyloksylu, winyloksylu, etynyloksylu, 2- alliloksylu, 1-propynyloksylu, i 12- propynyloksylu. Cząstka łącznika alkilowego może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla a także może mieć między 1, 2, 3, 4, lub 5 a 8, 9, 10, 11, lub 12 atomów węgla. Cząstka łącznika kwasu tłuszczowego może być cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego, co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, laurylo-oleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, arachidonian, oleinian, elaidynian, eikozapentaenian, erukanian, linolan, linolenian, dokozaheksaenian; octan, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. Cząstka łącznika kwasu tłuszczowego może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla a także może mieć między 1, 2, 3, 4 lub 5 a 8, 10, 51 EP 1 613 343 B1 12, 14 lub 16 atomów węgla. [0120] Oligomer może dodatkowo zawierać jedną lub więcej cząstek terminujących na jednym lub więcej końcach oligomeru, które nie są sprzężone z polipeptydem peptydu C. Cząstką terminującą może być cząstka alkilu lub alkoksylu. Cząstka alkilu lub alkoksylu może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla. Cząstka alkilu lub alkoksylu może także mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12,13, lub 14 atomów węgla, i/lub między dolną granicą 1, 2, 3, 4, lub 5 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 atomów węgla. W pewnych przykładach wykonania, cząstka alkilu lub alkoksylu może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, lub 4 a górną granicą 5, 6 lub 7 atomów węgla. Cząstka alkilowa może być cząstką liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, heksadecylu, sec-butylu, tert-butylu, 2- metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylo-pentylu, 3-metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2propynylu. Cząstką alkoksylu mogą być różne cząstki alkoksylu w tym, ale nie wyłącznie , metoksylu, heksyloksylu, etoksylu, heptyloksylu, propoksylu, oktyloksylu, butoksylu, nonyloksylu, pentyloksylu, decyloksylu, undecyloksylu, dodecyloksylu, tridecyloksylu, tetradecyloksylu, pentadecyloksylu, heksadecyloksylu, oktadecyloksylu, nonadecyloksylu, eikozyloksylu, izopropoksylu, sec-butoksylu, tert-butoksylu, 2-metylobutoksylu, tert-pentyloksylu, 2-metylo-pentyloksylu, etyloheksyloksylu, butenyloksylu, 2-propylopentyloksylu, 2-butenyloksylu, 3-metylopentyloksylu, winyloksylu, etynyloksylu, 2- alliloksylu, 1-propynyloksylu, i 12- propynyloksylu. Cząstką terminującą może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, lub tertpentyl, lub cząstka niższego metoksylu takiego jak metoksyl, etoksyl, propoksyl, 52 EP 1 613 343 B1 izopropoksyl, butoksyl, sec-butoksyl, tert-butoksyl, pentyloksyl, lub tertpentyloksyl. W pewnych przykładach wykonania cząstką terminującą jest metyl lub metoksyl. W związku z tym, że cząstką terminującą może być cząstka alkilu lub metoksylu, należy rozumieć, że cząstką terminującą mogą być różne cząstki, co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, cząstki cukru, cholesterolu, alkoholi, kwasów tłuszczowych i PEG. [0121] Oligomer może zawierać strukturę o Wzorze XI: ????????A-Lj-Gk-R-G'm-R'-G"n-T?????(XI) gdzie A oznacza cząstkę możliwą do zaktywowania; L oznacza cząstkę łącznika; G, G' i G" są oddzielnie wybranymi cząstkami rozdzielającymi; R oznacza cząstkę lipofilową i R? oznacza cząstkę glikolu polialkilenowego, lub R? oznacza cząstkę lipofilową i R oznacza cząstkę glikolu polialkilenowego i tylko jedno z R i R? musi być obecne; T oznacza cząstkę terminującą; i j, k, m i n oznaczają oddzielnie 0 lub 1. [0122] Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6 lub 7 podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 lub więcej podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może także mieć pomiędzy dolną granicą 2, 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 podjednostek glikolu polialkilenowego i/lub pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego. W pewnych przykładach wykonania cząstka glikolu polialkilenowego może mieć pomiędzy dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 podjednostek glikolu polialkilenowego i w pewnych 53 EP 1 613 343 B1 przykładach wykonania cząstka glikolu polialkilenowego ma 7 podjednostek glikolu polialkilenowego. Cząstką glikolu polialkilenowego oligomeru może być cząstka glikolu polialkilenowego niższego alkilu takiego jak cząstka glikolu polietylenowego, cząstka glikolu polipropylenowego lub cząstka glikolu polibutylenowego. Gdy cząstką glikolu polialkilenowego jest cząstka glikolu polipropylenowego, cząstka może mieć jednorodną (tj. nie przypadkową) strukturę. Przykładowa cząstka glikolu polipropylenowego mająca jednorodną strukturę jest następująca: Ta jednorodna struktura glikolu polipropylenowego może być opisana jako mająca tylko jeden atom węgla podstawiony metylem przylegający do każdego atomu tlenu w łańcuchu glikolu polipropylenowego. Takie jednorodne cząstki glikolu polipropylenowego mogą wykazywać zarówno właściwości lipofilowe jak i hydrofilowe. [0123] Lipofilową cząstką może być lipofilowa cząstka co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Lipofilowa cząstka ma co najmniej 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla. Lipofilowa cząstka może także mieć pomiędzy dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub atomów węgla, i/lub pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14 atomów węgla. W pewnych przykładach wykonania, lipofilowa cząstka może mieć między dolną granicą 3, 4, 5, 6 lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9 lub 10 atomów węgla i w pewnych przykładach wykonania lipofilowa cząstka ma 6 atomów węgla. Lipofilową cząstką mogą być, ale nie wyłącznie, cząstki nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego alkilu, cząstki nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego, cząstka cholesterolu i adamantanu. Przykładowe cząstki alkilu 54 EP 1 613 343 B1 obejmują, ale nie wyłącznie, cząstki nasyconego, liniowego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, heksadecyl, oktadecyl, nonadecyl i eikozyl; cząstki nasyconego, rozgałęzionego alkilu takiego jak izopropyl, secbutyl, tert-butyl, 2-metylobutyl, tert-pentyl, 2-metylo-pentyl, 3-metylopentyl, 2etyloheksyl, 2-propylopentyl; i cząstki nienasyconego alkilu otrzymane z powyższych cząstek nasyconego alkilu w tym, ale nie wyłącznie, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Przykładowe cząstki kwasu tłuszczowego obejmują, ale nie wyłącznie, cząstki nienasyconego kwasu tłuszczowego takie jak laurylo-oleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, oleinian, elaidynian, eikozapentaenian i erukanian, linolan, dokozaheksaenian; i linolenian, cząstki arachidonian, nasyconego kwasu tłuszczowego takie jak octan, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0124] Cząsteczkami rozdzielającymi, G, G' i G", są cząsteczki rozdzielające co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Cząsteczkami rozdzielającymi mogą być, ale nie wyłącznie, cząstki cukru, cząstki cholesterolu i gliceryny. Cząstki cukru mogą być różnymi cząstkami cukru co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, cząstkami monosacharydu i cząstkami disacharydu. Cząstki monosacharydu mogą mieć między 4 a 6 atomów węgla. Oligomery zgodnie z pewnymi przykładami wykonania nie zawierają cząstek rozdzielających (tj. k, m i n oznaczają 0). [0125] Cząstka łącznika, L, może być zastosowana do sprzężenia oligomeru z polipeptydem peptydu C co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Cząstkami łącznika mogą być, ale nie wyłącznie, cząstki alkilu i kwasu tłuszczowego. Cząstką łącznika alkilowego może być cząstka nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylopentylu, 3-metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 155 EP 1 613 343 B1 butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkoksylową mogą być różne cząstki alkoksylu w tym, ale nie wyłącznie, metoksylu, etoksylu, propoksylu, butoksylu, pentyloksylu, heksyloksylu, heptyloksylu, oktyloksylu, nonyloksylu, decyloksylu, tetradecyloksylu, undecyloksylu, pentadecyloksylu, dodecyloksylu, heksadecyloksylu, tridecyloksylu, oktadecyloksylu, nonadecyloksylu, eikozyloksylu, izopropoksylu, sec-butoksylu, tert-butoksylu, 2metylobutoksylu, tert-pentyloksylu, 2-metylo-pentyloksylu, 3-metylopentyloksylu, 2-etyloheksyloksylu, butenyloksylu, 2-propylopentyloksylu, 2-butenyloksylu, winyloksylu, etynyloksylu, alliloksylu, 1-propynyloksylu, i 12- propynyloksylu. Cząstka łącznika alkilowego może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla a także może mieć pomiędzy 1, 2, 3, 4, lub 5 a 8, 9, 10, 11, lub 12 atomów węgla. Cząstka łącznika kwasu tłuszczowego może być cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, laurylo-oleinian, mirystylo-oleinian, palmitylo-oleinian, arachidonian, oleinian, elaidynian, eikozapentaenian, erukanian, linolan, linolenian, dokozaheksaenian; octan, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. Cząstka łącznika kwasu tłuszczowego może mieć pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla i może mieć pomiędzy 1, 2, 3, 4 lub 5 a 8, 10, 12, 14 lub 16 atomów węgla. [0126] Cząstką terminującą, T, może być cząstka alkilu lub alkoksylu. Cząstka alkilu lub alkoksylu może mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30 atomów węgla. Cząstka alkilu lub alkoksylu może także mieć między dolną granicą 1, 2, 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14 atomów węgla, i/lub pomiędzy dolną granicą 1, 2, 3, 4, lub 5 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 56 EP 1 613 343 B1 9, lub 10 atomów węgla. W pewnych przykładach wykonania, cząstka alkilu lub alkoksylu może mieć między dolną granicą 1, 2, 3 lub 4 a górną granicą 5, 6 lub 7 atomów węgla. Cząstką alkilu mogą być różne cząstki liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2metylo-pentylu, 3-metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Przykładowymi cząstkami alkoksylu mogą być różne cząstki alkoksylu, w tym, ale nie wyłącznie, metoksylu, heksyloksylu, etoksylu, heptyloksylu, propoksylu, oktyloksylu, butoksylu, pentyloksylu, nonyloksylu, decyloksylu, undecyloksylu, dodecyloksylu, tridecyloksylu, tetradecyloksylu, pentadecyloksylu, heksadecyloksylu, oktadecyloksylu, nonadecyloksylu, eikozyloksylu, izopropoksylu, sec-butoksylu, tert-butoksylu, 2-metylobutoksylu, tert-pentyloksylu, 2-metylo-pentyloksylu, etyloheksyloksylu, butenyloksylu, 2-propylopentyloksylu, 2-butenyloksylu, 3-metylopentyloksylu, winyloksylu, etynyloksylu, 2- alliloksylu, 1-propynyloksylu, i 12- propynyloksylu. Cząstką terminującą może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, lub tertpentyl, cząstka niższego alkoksylu takiego jak metoksyl, etoksyl, propoksyl, izopropoksyl, butoksyl, sec-butoksyl, tert-butoksyl, pentyloksyl, lub tertpentyloksyl. W pewnych przykładach wykonania, cząstką terminującą jest metyl lub metoksyl. W związku z tym, że cząstką terminującą może być cząstka alkilu lub alkoksylu, należy rozumieć, że cząstką terminującą mogą być różne cząstki co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, cząstki cukru, cząstki cholesterolu, alkoholi, kwasu tłuszczowego i cząstki mPEG. [0127] Możliwa do zaktywowania cząsteczka, A, jest cząsteczką, która pozwala na sprzężenie oligomeru ze środkiem aktywującym w celu utworzenia oligomeru zdolnego do sprzężenia z polipeptydem proinsuliny. Możliwą do 57 EP 1 613 343 B1 zaktywowania cząstką mogą być różne możliwe do zaktywowania cząstki co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie -C(O)OH, C(S)-OH, -C(S)-SH, -OH, -SH, i NH2. [0128] Oligomer może zawierać strukturę o Wzorze XII: ????????A-X(CH2)mY(C2H4O)nR?????(XII) gdzie: A oznacza -C(O)-OH, C(S)-OH, -C(S)-SH, -OH, -SH, lub NH2; X oznacza atom tlenu lub wiązanie kowalencyjne, z zastrzeżeniem że X nie oznacza atomu tlenu, gdy A oznacza ?OH; Y oznacza cząstkę wiążącą ester, eter, karbaminian, węglan lub amid i może oznaczać cząstkę wiążącą eter; m jest pomiędzy dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30, i może być pomiędzy dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub 22, a także może być pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14, i/lub pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9, lub 10; n jest między dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 4, 5, 46, 47, 48, 49, lub 50, i może być pomiędzy dolną granicą 2, 3, 4, 5, lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20, a także może być między dolną granicą 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego. W pewnych przykładach wykonania n może być pomiędzy dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 pojednostek glikolu polialkilenowego i w pewnych przykładach wykonania n oznacza 7; m i n oba nie oznaczają 0; i 58 EP 1 613 343 B1 R oznacza cząstkę alkilu, cząstkę cukru, cząstkę cholesterolu, adamantanu, alkoholu lub cząstkę kwasu tłuszczowego. Cząstką alkilu mogą być różne cząstki liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylo-pentylu, 3metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkilu może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, lub tert-pentyl. Cząstką alkilu może być także C1 do C3 alkil. W pewnych przykładach wykonania cząstką alkilu jest metyl. Cząstka kwasu tłuszczowego może być cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, laurylo-oleinian, elaidynian, mirystylo-oleinian, erukanian, eikozapentaenian, linolan, dokozaheksaenian; palmitylo-oleinian, linolenian, octan, oleinian, arachidonian, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0129] Oligomer może zawierać Strukturę o Wzorze XIII: ????????A-(CH2)m(OC2H4)nOR?????(XIII) gdzie: A oznacza -C(O)-OH, C(S)-OH, -C(S)-SH, -OH, -SH, lub NH2; m może być pomiędzy dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30, i może być między dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub 22, a także może być między dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14, i/lub pomiędzy dolną 59 EP 1 613 343 B1 granicą 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9, lub 10; n może być pomiędzy dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 1, 42, 43, 44, 5, 46, 47, 48, 49, lub 50, i może być pomiędzy dolną granicą 2, 3, 4, 5, lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20, a także może być pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego. W pewnych przykładach wykonania, n może być między dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 podjednostek glikolu polialkilenowego i w pewnych przykładach wykonania n oznacza 7; m i n oba nie oznaczają 0; i R oznacza cząstkę alkilu, cząstkę cukru, cząstkę cholesterolu, adamantanu, alkoholu lub cząstkę kwasu tłuszczowego. Cząstką alkilu mogą być różne cząstki liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylo-pentylu, 3metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkilu może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, lub tert-pentyl. Cząstką alkilu może być także C1 do C3 alkil. W pewnych przykładach wykonania cząstką alkilu jest metyl. Cząstka kwasu tłuszczowego może być cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, laurylo-oleinian, elaidynian, mirystylo-oleinian, erukanian, eikozapentaenian, linolan, dokozaheksaenian; palmitylo-oleinian, linolenian, octan, oleinian, arachidonian, kapronian, kaprylan, 60 EP 1 613 343 B1 kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0130] Oligomer może zawierać strukturę o Wzorze XIV: gdzie: m może być pomiędzy dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, lub 30, i może być między dolną granicą 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, lub 10 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, lub 22, a także może być między dolną granicą 3, 4, 5, 6, 7, 8, lub 9 a górną granicą 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, lub 14, i/lub pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5, 6, lub 7 a górną granicą 6, 7, 8, 9, lub 10; n może być pomiędzy dolną granicą 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20 a górną granicą 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 1, 42, 43, 44, 5, 46, 47, 48, 49, lub 50, i może być pomiędzy dolną granicą 2, 3, 4, 5, lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, lub 20, a także może być pomiędzy dolną granicą 3, 4, 5 lub 6 a górną granicą 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, lub 12 podjednostek glikolu polialkilenowego. W pewnych przykładach wykonania, n może być między dolną granicą 4, 5 lub 6 a górną granicą 6, 7 lub 8 podjednostek glikolu polialkilenowego i w pewnych przykładach wykonania n oznacza 7; m i n oba nie oznaczają 0; i R oznacza cząstkę alkilu, cząstkę cukru, cząstkę cholesterolu, adamantanu, alkoholu lub cząstkę kwasu tłuszczowego. Cząstką alkilu mogą być różne cząstki liniowego lub rozgałęzionego, nasyconego lub nienasyconego alkilu co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, metylu, etylu, propylu, butylu, pentylu, heksylu, 61 EP 1 613 343 B1 heptylu, oktylu, nonylu, decylu, undecylu, dodecylu, tridecylu, tetradecylu, pentadecylu, heksadecylu, oktadecylu, nonadecylu, eikozylu, izopropylu, sec-butylu, tert-butylu, 2-metylobutylu, tert-pentylu, 2-metylo-pentylu, 3metylopentylu, 2-etyloheksylu, 2-propylopentylu, winylu, allilu, 1-butenylu, 2-butenylu, etynylu, 1-propynylu, i 2-propynylu. Cząstką alkilu może być cząstka niższego alkilu takiego jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, lub tert-pentyl. Cząstką alkilu może być także C1 do C3 alkil. W pewnych przykładach wykonania cząstką alkilu jest metyl. Cząstka kwasu tłuszczowego może być cząstką nasyconego lub nienasyconego, liniowego lub rozgałęzionego kwasu tłuszczowego co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, laurylo-oleinian, elaidynian, mirystylo-oleinian, erukanian, eikozapentaenian, palmitylo-oleinian, linolan, dokozaheksaenian; linolenian, octan, oleinian, arachidonian, kapronian, kaprylan, kaprynian, laurynian, arachidan, behenian, lignocerynian i cerotonian. [0131] W różnych przykładach wykonania sposobu syntezy koniugatów polipeptyd peptydu C- oligomer opisanych powyżej, oligomer jest kowalencyjnie sprzężony z polipeptydem peptydu C. W pewnych przykładach wykonania, oligomer jest sprzężony z polipeptydem peptydu C przy wykorzystaniu ulegającego hydrolizie wiązania (np. wiązania estrowego lub węglanowego). Ulegające hydrolizie sprzężenie może dostarczyć koniugat polipeptyd peptydu C-oligomer, który działa jak prolek. W pewnych przykładach, na przykład gdzie koniugat polipeptyd peptydu C-oligomer jest biologicznie nieaktywny (tj. koniugat nie ma zdolności do oddziaływania na organizm przez główny mechanizm działania polipeptydu peptydu C), ulegające hydrolizie sprzężenie może zapewnić przedłużone uwalnianie lub kontrolowane uwalnianie, dostarczając biologicznie aktywny polipeptyd peptydu C przez dany czas, gdy jeden lub więcej oligomerów jest odcinanych od ich odpowiednich biologicznie nieaktywnych koniugatów polieptyd peptydu C ? oligomer dostarczając biologicznie aktywny polipeptyd peptydu C. W alternatywnych przykładach wykonania oligomer jest odcinany, aby uzyskać peptyd C. W innych przykładach wykonania, oligomer jest sprzężony z polipeptydem peptydu C przy 62 EP 1 613 343 B1 zastosowaniu wiązania nie ulegającego hydrolizie (np. wiązania karbaminianowego, amidowego lub eterowego). Zastosowanie nie ulegającego hydrolizie wiązania może być korzystne, gdy jest pożądane, aby umożliwić biologicznie nieaktywnemu koniugatowi polipeptyd peptydu C-oligomer na krążenie we krwi przez wydłużony okres czasu, korzystnie co najmniej 2 godziny. Gdy oligomer jest sprzężony z polipeptydem peptydu C przy zastosowaniu cząstki wiążącej, która zawiera cząstkę karbonylu, taką jak cząstka wiążąca ester, karbaminian, węglan lub amid, otrzymany koniugat polipeptyd peptydu C ? oligomer jest koniugatem polipeptyd peptydu C ? acylooligomer. [0132] Oligomery stosowane w różnych sposobach syntezy koniugatów polipeptyd peptydu C-oligomer opisanych powyżej są komercyjnie dostępne lub mogą być zsyntetyzowane za pomocą różnych sposobów co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Na przykład polirozproszone oligomery mogą być zsyntetyzowane za pomocą sposobów dostarczontcg w jednym lub więcej następujących odniesieniach: Amerykańskim Patencie Nr 4,179,337 wg Davis i in.; Amerykańskim Patencie Nr 5,567,422 wg Greenwald; Amerykańskim Patencie Nr. 5,359,030 wg Ekwuribe; Amerykańskim Patencie Nr 5,438,040 wg Ekwuribe, Amerykańskim Patencie Nr 5,681,811 wg Ekwuribe, Amerykańskim Patencie Nr 6,309,633 wg Ekwuribe i in. Nie-polirozproszone (np. zasadniczo monorozproszone i monorozproszone) oligomery mogą być zsyntetyzowane za pomocą sposobów dostarczonych w jednym lub więcej następujących odniesieniach: Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Numerze Seryjnym 09/873,731 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem "Methods of Synthesizing Substantially Monodispersed Mixtures of Polymers Having Polyethylene Glycol Mixtures"; Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Numerze Seryjnym 09/873,797 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem entitled "Mixtures of Drug-Oligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol, Uses Thereof, and Methods of Making Same"; i Amerykańskim Zgłoszeniu Patentowym o Numerze Seryjnym 09/873,899 wniesionym 4 Czerwca, 2001 przez Ekwuribe i in. pod tytułem entitled "Mixtures of Insulin Drug-Oligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol, Uses 63 EP 1 613 343 B1 Thereof, and Methods of Making Same". Oligomery zgodnie z przykładami wykonania według niniejszego wynalazku mogą być zasadniczo monorozproszone a także mogą być monorozproszone. Przykładowe sposoby syntezy monorozproszonych oligomerów są dostarczone w Przykładach zapewnionych w niniejszym zgłoszeniu. [0133] Zetknięcie polipeptydu pro-peptydu C z oligomerem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd pro-peptydu C-oligomer może być przeprowadzone przy zastosowaniu różnych warunków co będzie zrozumiałe przez fachowców z dziedziny. Zetknięcie polipeptydu pro-peptydu C z oligomerem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd pro-peptydu C ? oligomer obejmuje zetknięcie oligomeru ze środkiem aktywującym w warunkach odpowiednich do dostarczenia aktywowanego oligomeru; i zetknięcie aktywowanego oligomeru z polipeptydem pro-peptydu C w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptydu pro-peptydu C. Aktywowany oligomer może być utworzony ex situ lub in situ. [0134] Środkiem aktywującym mogą być różne środki aktywujące zdolne do aktywacji jednego lub więcej oligomerów opisanych powyżej tak, że oligomer jest zdolny do reagowania z nukleofilowymi hydroksylowymi grupami funkcyjnymi i/lub aminowymi grupami funkcyjnymi w polipeptydzie proinsuliny co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, w tym, ale nie wyłącznie, Nhydroksysukcynoimid, chloromrówczan p-nitrofenylu, 1,3- dicykloheksylokarbodiimid, i hydroksybenzotriazyd. [0135] Znawca z dziedziny zrozumie warunki odpowiednie do sprzężenia środka aktywującego z oligomerem w celu dostarczenia aktywowanego oligomeru. Na przykład znawca z dziedziny może odnieść się do R.C. Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS. A GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS (2-gie Wydanie, Nowy Jork, WileyVCH, 1999). [0136] Warunki odpowiednie do sprzężenia aktywowanego oligomeru z polipeptydem pro-peptydu C będą zrozumiałe dla znawcy z dziedziny. Na przykład polipeptyd pro-peptydu C może być rozpuszczony w dipolarnym aprotonowym rozpuszczalniku takim jak dimetylosulfotlenek dostarczając 64 EP 1 613 343 B1 roztwór polipeptydu pro-peptydu C. Środek buforujący taki jak trietyloamina może być dodany do roztworu polipeptydu pro-peptydu C. Aktywowany oligomer rozpuszczony w bezwodnym rozpuszczalniku takim jak acetonitryl następnie może być dodany do roztworu polipeptydu pro-peptydu C. Znawca z dziedziny może także odnieść się do R.C. Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS. A GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS (2-gie Wydanie, Nowy Jork, Wiley-VCH, 1999). Stosunek molowy aktywowanego oligomeru do polipeptydu pro-peptydu C może być większy niż około 1:1, większy niż około 2:1, większy niż około 3:1, większy niż około 4:1 i/lub większy niż około 5:1. [0137] W różnych przykładach wykonania sposobów syntezy koniugatów polipeptyd peptydu C ? oligomer opisanych powyżej, więcej niż jeden oligomer (np. wiele oligomerów) może być sprzężonych z częścią polipeptydu peptydu C polipeptydu pro-peptydu C. W innych przykładach wykonania oligomer (y) może być sprzężony z częściami polipeptydu peptydu C i insuliny polipeptydu propeptydu C, na przykład w celu ułatwienia rozdzielenia. Wiele oligomerów może być takich samych. Jednak należy zrozumieć, że wiele oligomerów może się różnić od siebie lub alternatywnie niektóre oligomery mogą być takie same a niektóre mogą być różne. Gdy wiele oligomerów jest sprzężonych z częścią polipeptydu peptydu C polipeptydu pro-peptydu C, jeden lub więcej oligomerów może być sprzężonych z częścią polipeptydu peptydu C polipeptydu propeptydu C za pomocą ulegających hydrolizie wiązań i jeden lub więcej oligomerów może być sprzężonych z częścią polipeptydu peptydu C polipeptydu pro-peptydu C za pomocą nie ulegających hydrolizie wiązań. Alternatywnie wszystkie wiązania sprzęgające wiele oligomerów z częścią polipeptydu peptydu C polipeptydu pro-peptydu C mogą ulegać hydrolizie, ale mają różne stopnie hydrolizywalności tak że na przykład jeden lub więcej oligomerów jest szybko usuwanych z polipeptydu peptydu C lub części polipeptydu peptydu C polipeptydu pro-peptydu C za pomocą hydrolizy w organizmie i jeden lub więcej z oligomerów są powoli usuwane z polipeptydu peptydu C lub części polipeptydu peptydu C za pomocą hydrolizy w organizmie. [0138] W różnych przykładach wykonania sposobów syntezy koniugatów 65 EP 1 613 343 B1 polipeptyd peptydu C-oligomer opisanych powyżej, oligomer może być sprzężony z częścią polipeptydu peptydu C polipeptydu pro-peptydu C (i opcjonalnie częścią polipeptydu insuliny i/lub częścią polipeptydu wiodącego jeśli występuje) w różnych nukleofilowych resztach części polipeptydu peptydu C w tym, ale nie wyłącznie, nukleofilowych hydroksylowych grupach funkcyjnych i/lub aminowych grupach funkcyjnych. Nukleofilowa hydroksylowa grupa funkcyjna może znajdować się na przykład w resztach seryny i/lub tyrozyny i nukleofilowa aminowa grupa funkcyjna może znajdować się na przykład w resztach histydyny i/lub lizyny, i/lub na jednym lub więcej N-końcach polipeptydu. Gdy oligomer jest sprzężony z jednym lub więcej N-końcami polipeptydu proinsuliny, sprzężenie może dać drugorzędową aminę. [0139] Odcięcie jednego lub więcej peptydów od koniugatu polipeptyd propeptydu C-oligomer dostarczające koniugat polipeptyd peptydu C ? oligomer może być przeprowadzone za pomocą różnych procesów co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Odcięcie jednego lub więcej peptydów z koniugatu polipeptyd pro-peptydu C ? oligomer obejmuje zetknięcie koniugatu polipeptyd pro-peptydu C ? oligomer z jednym lub więcej enzymami, które są zdolne do rozcięcia wiązania (-ań) pomiędzy jednym lub więcej peptydami i polipeptydem peptydu C w warunkach odpowiednich do odcięcia jednego lub więcej peptydów od koniugatu polipeptyd pro-peptydu C ? oligomer. Jak opisano w różnych odniesieniach, na przykład Kemmler i in. "Studies on the Conversion of Proinsulin to Insulin," J. Biol. Chem., 246: 6786-6791 (1971), znawca z dziedziny zrozumie jak wybrać odpowiednie enzymy z punktu widzenia określonego wiązania (-ań) peptydowego, które ma być rozcięte i jak zapewnić odpowiednie warunki do odcięcia jednego lub więcej peptydów z koniugatu polipeptyd pro-peptydu C ? oligomer. Jeden lub więcej enzymów może zawierać różne enzymy w tym, ale nie wyłącznie, trypsynę, chymotrypsynę, karboksypeptydazę B, i ich mieszaniny. W pewnych przykładach wykonania, jednym lub więcej enzymami może być trypsyna, karboksypeptydaza B i ich mieszaniny. [0140] Niniejsze ujawnienie dostarcza sposób syntezy koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer obejmujący: 66 EP 1 613 343 B1 (a) zetknięcie polipeptydu z oligomerem zawierającym część hydrofilową i/lub część lipofilową w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z polipeptydem proinsuliny i dostarczenia koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer, gdzie polipeptyd proinsuliny zawiera: (i) polipeptyd insuliny; i (ii) jeden lub więcej nie-insulinowych polipeptydów sprzężonych z polipeptydem insuliny za pomocą wiązania (-ań) peptydowego możliwego do rozcięcia w wyniku czego otrzymuje się polipeptyd insuliny; i (b) odcięcie jednego lub więcej nie-insulinowych polipeptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer dostarczając koniugat polipeptyd insuliny-oligomer. Zwiększona aktywność w odniesieniu do insuliny występuje na przykład wówczas, gdy podanie wywołuje działanie polegające na obniżeniu poziomu glukozy, które jest większe niż działanie obniżające poziom glukozy wywołane przez odpowiadającą ilość insuliny. [0141] Polipeptyd proinsuliny może zawierać wiele miejsc sprzężenia; i może zostać wytworzony polipeptyd proinsuliny-oligomer zawierający wiele oligomerów i/lub polipeptyd proinsuliny może zawierać jedno lub więcej miejsc sprzężenia na części polipeptydu insuliny, i może zostać wytworzony polipeptyd proinsuliny-oligomer zawierający jeden lub więcej oligomerów na części polipeptydu insuliny. W innym przykładzie wykonania sposoby mogą obejmować koniugat polipeptyd proinsuliny-oligomer, gdzie jeden lub więcej nieinsulinowego polipeptydu (ów) jest niesprzężonych. [0142] Polipeptyd proinsuliny zgodnie ze sposobami może zawierać co najmniej jedno miejsce sprzężenia na części polipeptydu insuliny; i co najmniej jedno miejsce sprzężenia na jednej lub więcej częściach nie-insulinowego polipeptydu; i może zostać wytworzony polipeptyd proinsuliny-oligomer, który może zawierać co najmniej jeden oligomer sprzężony z częścią polipeptydu insuliny; i co najmniej jeden oligomer sprzężony z jedną lub więcej częścią (ami) nie-insulinowego polipeptydu. [0143] Sposoby według tego ujawnienia mogą dodatkowo obejmować 67 EP 1 613 343 B1 zetknięcie oligomeru ze środkiem aktywującym w warunkach odpowiednich do dostarczenia aktywowanego oligomeru zdolnego do sprzężenia z nukleofilową grupą funkcyjną na polipeptydzie proinsuliny; i zetknięcie aktywowanego oligomeru z dostarczenia polipeptydem koniugatu proinsuliny w polipeptyd warunkach odpowiednich proinsuliny-oligomer. W do pewnych przykładach wykonania, sposoby mogą zostać przeprowadzone in situ. [0144] W pewnych przykładach wykonania sposobów, stosunek molowy aktywowanego oligomeru do polipeptydu proinsuliny może być większy niż około 1:1, większy niż około 3:1, i/lub większy niż około 4:1. [0145] Oligomer w sposobach może zawierać cząstkę glikolu polietylenowego i w pewnych przykładach wykonania oligomer może składać się zasadniczo z cząstki glikolu polietylenowego. [0146] W sposobach, polipeptyd insuliny może zawierać łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B i może zawierać jeden lub więcej nie-insulinowych polipeptydów, które zawierają peptyd łączący sprzężony na pierwszym końcu z C-końcem łańcucha polipeptydowego B i sprzężony na drugim końcu z Nkońcem łańcucha polipeptydowego A. W pewnych przykładach wykonania łańcuch B może zawierać miejsce sprzężenia w B29 i koniugat polipeptyd insuliny-oligomer może być sprzężony w miejscu sprzężenia B29. W innych przykładach wykonania, polipeptyd proinsuliny ma pojedynczą lizynę w B29 i koniugat polipeptyd insuliny-oligomer może być monokoniugatem B29. W dodatkowych przykładach wykonania, oligomer może być sprzężony z lizyną w pozycji B29 insuliny i z fenyloalaniną w pozycji B1 insuliny, tym samym tworząc dikoniugat B1, B29. Oligomer może także być sprzężony w miejscu sprzężenia B1 w łańcuchu B insuliny, skutkując koniugatem polipeptyd insuliny-oligomer, który jest sprzężony w miejscu sprzężenia B1. W jeszcze dodatkowych przykładach wykonania, peptydem łączącym może być polipeptyd peptydu C, który może zawierać lizynę i sposoby według tego wynalazku mogą prowadzić do wytworzenia polipeptyd proinsuliny-oligomer, w którym lizyna (y) polipeptydu peptydu C są sprzężone z oligomerem(-ami). W innych przykładach wykonania, peptyd łączący może być pozbawiony reszt lizyny. [0147] Także w sposobach według tego ujawnienia, polipeptyd proinsuliny 68 EP 1 613 343 B1 może zawierać peptyd wiodący sprzężony z N-końcem łańcucha polipeptydowego B i sekwencja wiodąca może zawierać lizynę i może zostać wytworzony polipeptyd proinsuliny-oligomer, w którym lizyna (-y) peptydu wiodącego są sprzężone z oligomerem (-ami). W pewnych przykładach wykonania, peptyd wiodący może być pozbawiony reszt lizyny. [0148] W pewnych przykładach wykonania sposobów może zostać wytworzony polipeptyd proinsuliny-oligomer zawierający oligomer sprzężony na końcu N peptydu wiodącego i w pewnych przykładach wykonania jeden lub więcej nieinsulinowych polipeptydów może zawierać peptyd wiodący sprzężony z Nkońcem łańcucha polipeptydowego B. Peptyd wiodący może zawierać lizynę i może zostać wytworzony polipeptyd proinsuliny-oligomer, w którym lizyna(-y) peptydu C są sprzężone z oligomerem (-ami). W innych przykładach wykonania, peptyd wiodący może być pozbawiony reszt lizyny. [0149] W innych przykładach wykonania sposobów, polipeptyd proinsuliny może zawierać łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B i C-koniec łańcucha polipeptydowego B może być sprzężony z N-końcem łańcucha polipeptydowego A. [0150] W pewnych przykładach wykonania sposobów, polipeptyd proinsuliny może być sprzężony na N-końcu łańcucha B z peptydem wiodącym za pomocą możliwego do rozcięcia wiązania peptydowego. W innych przykładach wykonania, polipeptydem insuliny może być insulina i oligomer może być sprzężony z lizyną w pozycji B29 insuliny lub oligomer może być sprzężony w pozycji B1 i w pozycji B29 insuliny tworząc dikoniugat. [0151] W jeszcze innych przykładach wykonania sposobów, polipeptydem insuliny może być analog insuliny, którym może być, ale nie wyłącznie, insulina GlyA21, ludzka; insulina GlyA21 GlnB3 ludzka; insulina AlaA21, ludzka; insulina AlaA21 GlnB3, ludzka; insulina GlnB3 ludzka; insulina GlnB30, ludzka; insulina GlyA21 GluB30 ludzka; insulina GlyA21 GlnB3 GluB30 ludzka; insulina GlnB3 GluB30 ludzka; insulina AspB28 ludzka; insulina LysB28 ludzka; insulina LeuB28 ludzka; insulina ValB28 ludzka; insulina AlaB28 ludzka; insulina AspB28 ProB29 ludzka; insulina LysB28 ProB29 ludzka; insulina LeuB28 ProB29 ludzka; insulina ValB28 ProB29 ludzka; insulina AlaB28 ProB29 ludzka. 69 EP 1 613 343 B1 [0152] Koniugat polipeptyd insuliny-oligomer mogą być amfifilowo zrównoważone i/lub oligomer może występować w postaci zasadniczo monorozproszonej mieszaniny i/lub oligomer może występować w postaci monorozproszonej mieszaniny. [0153] Hydrofilową cząstką oligomeru może być cząstka glikolu polialkilenowego i/lub cząstka glikolu polialkilowego może być cząstką glikolu polietylenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć między 1 a 50 podjednostek glikolu polialkilenowego, między 3 a 50 podjednostek glikolu polialkilenowego, między 2 a 10 podjednostek glikolu polialkilenowego, między 4 a 10 podjednostek glikolu polialkilenowego i/lub co najmniej 2 podjednostki glikolu polialkilenowego. [0154] Lipofilową cząstką może być cząstka alkilu lub kwasu tłuszczowego i cząstka lipofilowa może mieć między 1 a 28 atomów węgla, między 2 a 24 atomów węgla, między 3 a 18 atomów węgla, między 4 a 12 atomów węgla, między 5 a 7 atomów węgla, i/lub między 4 a 14 atomów węgla. [0155] Odcięcie jednego lub więcej nie-insulinowych polipeptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer może obejmować zetknięcie koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer z jednym lub więcej enzymami, które są zdolne do rozcięcia wiązania (-ań) pomiędzy jednym lub więcej nie-insulinowymi polipeptydami i polipeptydem insuliny w warunkach odpowiednich do odcięcia jednego lub więcej nie-insulinowych polipeptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer. Jednym lub więcej enzymami mogą być na przykład trypsyna, karboksypeptydaza B i/lub ich mieszaniny. [0156] Peptyd łączący może mieć końcową resztę aminokwasową na pierwszym końcu i odcięcie peptydu łączącego od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer może obejmować zetknięcie koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer z pierwszym enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu końcowa reszta aminokwasowa-polipeptyd insulinyoligomer i zetknięcie koniugatu końcowa reszta aminokwasowa-polipeptyd insuliny-oligomer z drugim enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd insuliny - oligomer. Końcową resztą aminokwasową może być reszta argininy, polipeptydem insuliny może być 70 EP 1 613 343 B1 insulina i peptydem łączącym może być ludzki peptyd C. W tych przykładach wykonania zetknięcie koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer z pierwszym enzymem i zetknięcie koniugatu końcowa reszta aminokwasowa-polipeptyd insuliny-oligomer z drugim enzymem może wystąpić zasadniczo jednocześnie. Ponadto pierwszy enzym i drugi enzym mogą być dostarczone w mieszaninie zawierającej pierwszy enzym i drugi enzym i w pewnych przykładach wykonania pierwszym enzymem jest trypsyna i drugim enzymem może być karboksypeptydaza B. [0157] Sposoby mogą dalej obejmować chemiczną modyfikację jednego lub więcej oligomeru (-ów) koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer, aktywację jednego lub więcej oligomeru (-ów) koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer, wydłużenie jednego lub więcej oligomeru (-ów) koniugatu polipeptyd insulinyoligomer i/lub skrócenie jednego lub więcej oligomeru (-ów) koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer, [0158] W sposobach według tego ujawnienia wydajność koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer może być większa niż 75 procent, większa niż 85 procent, większa niż 90 procent, większa niż 95 procent, i/lub większa niż 99 procent. [0159] Sposoby według tego ujawnienia ponadto obejmują sposób syntezy polipeptydu insuliny obejmujący syntezę koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer jak opisano w niniejszym zgłoszeniu i hydrolizę oligomeru (-ów) z koniugatu polipeptyd-oligomer w celu uzyskania polipeptydu insuliny. [0160] Także dostarczony jest w niniejszym zgłoszeniu sposób syntezy insuliny, obejmujący syntezę koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer jak opisano w niniejszym zgłoszeniu i hydrolizę oligomeru (-ów) z koniugatu polipeptydoligomer w celu uzyskania polipeptydu insuliny. [0161] W dalszych przykładach wykonania, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób syntezy koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer obejmujący: zetknięcie polipeptydu proinsuliny zawierającego polipeptyd insuliny sprzężony z jednym lub więcej nie-insulinowym polipeptydem (-ami) za pomocą wiązania (-ań) peptydowego możliwego do rozcięcia w celu uzyskania polipeptydu insuliny z oligomerem zawierającym strukturę o Wzorze I: 71 EP 1 613 343 B1 ????????A-Lj-Gk-R-G'm-R'-G"n-T?????(I) gdzie: A oznacza cząstkę możliwą do zaktywowania; L oznacza opcjonalną cząstkę łącznika; G, G' i G" każde oznacza opcjonalne cząstki rozdzielające; R oznacza cząstkę lipofilową, R' oznacza cząstkę glikolu polialkilenowego lub R? oznacza cząstkę lipofilową a R oznacza cząstkę glikolu polialkilenowego, i gdzie (i) R i R' są oba obecne, lub (ii) R i G są nieobecne a L jest sprzężone z G? jeśli jest obecne lub z R? jeśli G? nie jest obecne, lub (iii) R' i G" są nieobecne a T jest sprzężone z G' jeśli jest obecne lub z R jeśli G' nie jest obecne; T oznacza cząstkę terminującą; i j, k, m i n oddzielnie oznaczają 0 lub 1; w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny i dostarczenia koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer; i (b) odcięcie jednego lub więcej nie-insulinowych polipeptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer w celu dostarczenia koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer. [0162] W pewnych przykładach wykonania sposobów według tego ujawnienia, R i R' mogą występować oba; R i G mogą być nieobecne a L może być sprzężone z G? jeśli jest obecne lub z R? jeśli G? nie jest obecne; R? może oznaczać cząstkę glikolu polietylenowego; R? i G?? mogą być nieobecne a T może być sprzężone z G? jeśli jest obecne lub z R jeśli G? nie jest obecne; A może oznaczać -C(O)-OH, C(S)-OH, -C(S)-SH, -OH, -SH, i/lub NH 2; L może oznaczać cząstkę alkilu lub cząstkę kwasu tłuszczowego; G, G' i G" mogą oddzielnie być wybrane z cząstek cukru, cholesterolu i cząstek gliceryny; i/lub T może oznaczać alkil i alkoksyl. [0163] W szczególnych przykładach wykonania sposobów według tego ujawnienia A może oznaczać cząstkę kwasu karboksylowego; R może oznaczać cząstkę alkilu mającą między 3 a 8 atomów węgla; R? może oznaczać glikol polietylenowy mający między 4 a 10 podjednostek glikolu 72 EP 1 613 343 B1 polietylenowego; T może oznaczać niższy alkil lub niższy alkoksyl; a j, k, m i n mogą oznaczać 0. W innych przykładach wykonania A może oznaczać cząstkę kwasu karboksylowego; R może oznaczać cząstkę alkilu mającą między 3 a 8 atomów węgla; R? może oznaczać glikol polietylenowy mający 7 podjednostek glikolu polietylenowego; T może oznaczać metoksyl; a j, k, m i n mogą oznaczać 0. [0164] Dalej dostarczony w niniejszym ujawnieniu jest sposób syntezy koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer obejmujący: zetknięcie polipeptydu proinsuliny zawierającego polipeptyd insuliny sprzężony z jednym lub więcej nie-insulinowymi polipeptydami za pomocą wiązania (-ań) peptydowego możliwego do rozcięcia, aby uzyskać polipeptyd insuliny z oligomerem zawierającym strukturę o Wzorze II: ????????A-X(CH2)mY(C2H4O)nR?????(II) gdzie: A oznacza -C(O)-OH, C(S)-OH, -C(S)-SH, -OH, -SH, lub NH2; X oznacza atom tlenu lub wiązanie kowalencyjne z zastrzeżeniem, że X nie oznacza atomu tlenu, gdy A oznacza ?OH; Y oznacza cząstkę wiążącą ester, eter, karbaminian, węglan lub amid; m oznacza między 0 a 30; n oznacza między 0 a 50; m i n oba nie oznaczają 0; i R oznacza cząstkę alkilu, cząstkę cukru, cholesterolu, adamantanu, cząstkę alkoholu lub cząstkę kwasu tłuszczowego; w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny i dostarczenia koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer; i odcięcie jednego lub więcej nieinsulinowych polipeptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer w celu dostarczenia koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer. [0165] Także dostarczony jest sposób syntezy koniugatu polipeptyd insulinyoligomer polipeptyd obejmujący: insuliny zetknięcie sprzężony z polipeptydu jednym lub proinsuliny więcej zawierającego nie-insulinowymi 73 EP 1 613 343 B1 polipeptydami za pomocą wiązania (-ań) peptydowego możliwego do rozcięcia, aby uzyskać polipeptyd insuliny z oligomerem zawierającym strukturę o Wzorze III: ????????A-(CH2)m(OC2H4)nOR?????(III) gdzie: A oznacza -C(O)-OH, C(S)-OH, -C(S)-SH, -OH, -SH, lub NH2; m oznacza między 0 a 25; n oznacza między 0 a 25; m i n oba nie oznaczają 0; i R oznacza alkil; w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z częścią polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny i dostarczenia koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer; i odcięcie jednego lub więcej nieinsulinowych polipeptydów z koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer w celu dostarczenia koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer. [0166] Dodatkowo dostarczony jest sposób syntezy koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer obejmujący: zetknięcie polipeptydu proinsuliny zawierającego polipeptyd insuliny mający łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B, który zawiera resztę lizyny; zetknięcie peptydu sprzężonego na pierwszym końcu z C-końcem łańcucha polipeptydowego B i sprzężonego na drugim końcu z N-końcem łańcucha polipeptydowego A; i peptyd wiodący sprzężony z N-końcem łańcucha polipeptydowego B z oligomerem zawierającym strukturę o Wzorze IV: gdzie: m oznacza między 0 a 30; n oznacza między 0 a 50; 74 EP 1 613 343 B1 m i n oba nie oznaczają 0; i R oznacza alkil; w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z resztą lizyny łańcucha polipeptydowego B części polipeptydu insuliny polipeptydu proinsuliny i dostarczenia koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer; i enzymatyczne odcięcie peptydu łączącego i peptydu wiodącego od koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer, aby dostarczyć koniugat polipeptyd insuliny-oligomer. [0167] W sposobach opisanych w niniejszym zgłoszeniu m może oznaczać między 3 a 16, między 4 a 14, i/lub między 5 a 10. W pewnych przykładach wykonania, n może oznaczać między 3 a 18, między 4 a 14 i/lub między 5 a 10 i R może oznaczać niższy alkil, R może oznaczać C1 do C3 alkil i/lub R może oznaczać metyl. [0168] Niniejsze ujawnienie dalej dostarcza sposób syntezy koniugatu insulinaoligomer obejmujący: zetknięcie polipeptydu proinsuliny, który zawiera proinsulinę sprzężoną na swoim N-końcu z peptydem wiodącym, z oligomerem zawierającym strukturę o Wzorze V: w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z resztą lizyny B29 proinsuliny i dostarczenia koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer; i enzymatyczne odcięcie peptydu C i peptydu wiodącego z koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer, aby dostarczyć koniugat insulina-oligomer. [0169] W sposobach opisanych w niniejszym zgłoszeniu enzymatyczne odcięcie peptydu C i peptydu wiodącego od koniugatu polipeptyd proinsulinyoligomer może obejmować zetknięcie koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer z pierwszym enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu (Arg31)-insulina-oligomer i zetknięcie koniugatu (Arg31)-polipeptyd insulinyoligomer z drugim enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer. Pierwszym enzymem może być 75 EP 1 613 343 B1 trypsyna i drugim enzymem może być karboksypeptydaza B. [0170] Także dostarczony jest w niniejszym zgłoszeniu sposób syntezy koniugatu polipeptyd insuliny-acylo-oligomer, obejmujący enzymatyczne odcięcie jednego lub więcej nie-insulinowych polipeptydów od koniugatu polipeptyd proinsuliny-acylo-oligomer, aby dostarczyć koniugat polipeptyd insuliny-acylo-oligomer. [0171] W innym przykładzie wykonania, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób syntezy koniugatu insulina-acylo-oligomer obejmujący enzymatyczne odcięcie peptydu wiodącego i peptydu C od koniugatu polipeptyd proinsuliny-acylooligomer zawierającego następującą strukturę: aby dostarczyć koniugat insulina-acylo-oligomer zawierający następującą strukturę: [0172] W sposobach opisanych w niniejszym zgłoszeniu peptyd wiodący może być pozbawiony reszt lizyny i/lub enzymatyczne odcięcie peptydu C i peptydu wiodącego od koniugatu polipeptyd proinsuliny-acylo-oligomer może obejmować zetknięcie koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer z pierwszym enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu (Arg )- 31 insulina-oligomer; i zetknięcie koniugatu (Arg31)-polipeptyd insuliny-oligomer z drugim enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd insuliny-oligomer. Pierwszym enzymem może być trypsyna i drugim enzymem może być karboksypeptydaza B. 76 EP 1 613 343 B1 [0173] W niniejszym zgłoszeniu dostarczony jest sposób syntezy koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer obejmujący zetknięcie polipeptydu proinsuliny z oligomerem zawierającym cząstkę hydrofilową i cząstkę lipofilową w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd proinsuliny-oligomer. [0174] Dalej dostarczony jest sposób syntezy koniugatu polipeptyd peptydu Coligomer obejmujący: zetknięcie polipeptydu pro-peptydu C zawierającego polipeptyd peptydu C sprzężony z jednym lub więcej nie-insulinowymi polipeptydami za pomocą wiązania (-ań) peptydowego, które są możliwe do rozcięcia, aby uzyskać polipeptyd peptydu C z oligomerem w warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z częścią polipeptydu peptydu C polipeptydu pro-peptydu C, i aby dostarczyć koniugat polipeptyd pro-peptydu Coligomer; i odcięcie jednego lub więcej nie-insulinowych polipeptydów od koniugatu polipeptyd pro-peptydu C-oligomer, aby dostarczyć koniugat polipeptyd peptydu C-oligomer. Polipeptydem peptydu C może być peptyd C, polipeptydem pro-peptydu C może być polipeptyd proinsuliny, i/lub polipeptydem pro-peptydu C może być proinsulina. [0175] Zostanie docenione, że mimo tego że powyższa dyskusja skupia się głównie na polipeptydach insuliny i podobnych, zasady ujawnienia mogą być jednakowo stosowane do wytwarzania innych propylopeptydów. Tym samym na przykład zasady ujawnienia mogą być stosowane dla pro-X-polipeptydów, gdzie X może oznaczać, ale nie wyłącznie, insulinę, parathormon (1-34) (PTH (1-34)), ludzki hormon natriuretyczny typu B (hBNP), przedsionkowy peptyd natriuretyczny (ANP), glukagonopodobny peptyd 1 (GLP 1), luminalny czynnik uwalniający cholecystokininę (LRCF), peptyd C, leu-enkefalinę, met-enkefalinę, lizyna-leu-enkefalinę jak również jakikolwiek inny polipeptyd lub analog polipeptydu obecnie znany lub później zidentyfikowany, dla którego może zostać wytworzony pro-polipeptyd i/lub polipeptyd może zostać wytworzony z pro-polipeptydu zgodnie z niniejszym ujawnieniem. [0176] Tym samym, w jednym przykładzie wykonania, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób syntezy koniugatu polipeptyd X-oligomer. Sposób zwykle obejmuje zetknięcie polipeptydu pro-X z oligomerem zawierającym cząstkę hydrofilową i/lub cząstkę lipofilową. Etap łączenia zwykle występuje w 77 EP 1 613 343 B1 warunkach odpowiednich do sprzężenia oligomeru z polipeptydem pro-X i dostarczenia koniugatu polipeptyd pro-X-oligomer. Polipeptyd pro-X zwykle obejmuje polipeptyd X i jeden lub więcej polipeptydów niebędących X sprzężonych z polipeptydem X za pomocą wiązania (-ań) peptydowego możliwego do rozcięcia, aby uzyskać polipeptyd X. Po sprzężeniu sposób zwykle obejmuje odcięcie jednego lub więcej polipeptydu (-ów) niebędących X od koniugatu polipeptyd pro-X-oligomer dostarczając koniugat polipeptyd Xoligomer. [0177] Polipeptyd pro-X może zawierać wiele miejsc sprzężenia i polipeptyd pro-X-oligomer zawierający wiele oligomerów może zostać wytworzony. Polipeptyd pro-X może zawierać jedno lub więcej miejsc sprzężenia na części polipeptydu X i polipeptyd pro-X-oligomer zawierający jeden lub więcej oligomerów na części polipeptydu X może zostać wytworzony. Sposoby według tego ujawnienia mogą być także wykorzystane do wytworzenia koniugatu polipeptyd pro-X-oligomer, gdzie jeden lub więcej polipeptydu (-ów) niebędących X jest niesprzężonych. [0178] Polipeptyd pro-X może zawierać co najmniej jedno miejsce sprzężenia na części polipeptydu X. Polipeptyd pro-X może zawierać co najmniej jedno miejsce sprzężenia na jednej lub więcej częściach polipeptydu niebędącego X. Polipeptyd pro-X-oligomer może być wytworzony, który może zawierać co najmniej jeden oligomer sprzężony z częścią polipeptydu X; i co najmniej jeden oligomer sprzężony z jedną lub więcej częścią (-ami) polipeptydu niebędącego X. [0179] Sposoby według tego ujawnienia mogą dalej obejmować zetknięcie oligomeru ze środkiem aktywującym w warunkach odpowiednich do dostarczenia aktywowanego oligomeru zdolnego do sprzężenia z nukleofilową grupą funkcyjną na polipeptydzie pro-X; i zetknięcie aktywowanego oligomeru z polipeptydem pro-X w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd pro-X-oligomer. Sposoby mogą zostać przeprowadzone in situ. [0180] W pewnych przykładach wykonania sposobów według tego ujawnienia, stosunek molowy aktywowanego oligomeru do polipeptydu pro-X może być większy niż około 1:1, większy niż około 3:1 i/lub większy niż około 4:1. 78 EP 1 613 343 B1 [0181] W pewnych przykładach wykonania, oligomer jest sprzężony z polipeptydem pro-X w miejscu sprzężenia, które jest w granicach 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 aminokwasów miejsca hydrolizy (licząc ostatni peptyd pozostający po hydrolizie jako będący 1 aminokwasem miejsca hydrolizy). [0182] Zastosowane oligomery mogą zawierać cząstkę glikolu polietylenowego i w niektórych przykładach wykonania oligomer może składać się przede wszystkim z cząstki glikolu polietylenowego. Cząstka glikolu polietylenowego może w niektórych przykładach wykonania zawierać 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 lub 50 podjednostek glikolu polietylenowego i może być liniowa, rozgałęziona i/lub w postaci pętli. [0183] W sposobach według tego ujawnienia polipeptyd X może zawierać dwa lub więcej łańcuchy polipeptydowe i może zawierać jeden lub więcej polipeptydów innych niż X sprzężonych z łańcuchami polipeptydowymi. Łańcuchy polipeptydowe mogą zawierać miejsca sprzężenia takie jak aminowe końce i/lub ulegające sprzężeniu grupy funkcyjne, takie jak łańcuchy boczne lizyny. Koniugat polipeptyd X-oligomer może być sprzężony w jednym lub więcej miejscach sprzężenia. W pewnych przykładach wykonania polipeptyd pro-X może mieć pojedynczą lizynę i koniugat polipeptyd X-oligomer może być monokoniugatem. W jeszcze dodatkowych przykładach wykonania polipeptyd pro-X może zawierać peptyd łączący lub polipeptyd peptydu C łączący jedną lub więcej podjednostek polipeptydu pro-X. Sposoby mogą wytwarzać polipeptyd pro-X-oligomer, w którym lizyna(-y) łączącego lub polipeptydu peptydu C są sprzężone z oligomerem (-ami). W innych przykładach wykonania peptyd łączący lub peptyd C mogą być pozbawione reszt lizyny. [0184] Polipeptyd pro-X może zawierać peptyd wiodący sprzężony z N-końcem polipeptydu pro-X lub jego podjednostki polipeptydowej. Peptyd wiodący może zawierać jedną lub więcej lizyn i może zostać wytworzony polipeptyd pro-Xoligomer, w którym lizyna (y) peptydu wiodącego jest sprzężona z oligomerem (-ami). W niektórych przykładach wykonania peptyd wiodący może być pozbawiony reszt lizyny. 79 EP 1 613 343 B1 [0185] W pewnych przykładach wykonania sposobów według tego ujawnienia może zostać wytworzony polipeptyd pro-X-oligomer zawierający oligomer sprzężony na N-końcu peptydu wiodącego. Jeden lub więcej polipeptydów innych niż X może zawierać peptyd wiodący sprzężony z N-końcem polipeptydu X. Peptyd wiodący może zawierać lizynę i może zostać wytworzony koniugat polipeptyd pro-X-oligomer, w którym lizyna (y) peptydu C jest sprzężona z oligomerem(-ami). W innych przykładach wykonania peptyd wiodący może być pozbawiony reszt lizyny. [0186] Polipeptyd pro-X może zawierać łańcuch polipeptydowy A i łańcuch polipeptydowy B i C-koniec łańcucha polipeptydowego B może być sprzężony z N-końcem łańcucha polipeptydowego A. [0187] Polipeptyd pro-X może być sprzężony na N-końcu łańcucha B z peptydem wiodącym za pomocą możliwego do rozcięcia wiązania peptydowego. W innych przykładach wykonania, polipeptydem X może być insulina i oligomer może być sprzężony z lizyną w pozycji B29 insuliny. [0188] Sposób według ujawnienia może być zastosowany do wytworzenia sprzężonych natywnych peptydów jak również sprzężonych analogów natywnych peptydów. [0189] Koniugat polipeptyd X-oligomer może być amfifilowo zrównoważony. Polipeptyd X-oligomer może być rozpuszczalny w organicznych rozpuszczalnikach jak również wodzie. Oligomer może występować w postaci zasadniczo monorozproszonej mieszaniny i/lub oligomer może występować w postaci monorozproszonej mieszaniny. Hydrofilowa cząstka oligomeru może zawierać, składać się przede wszystkim z lub składać się z cząstki glikolu polialkilenowego i/lub cząstką glikolu polialkilenowego może być cząstka glikolu polietylenowego. Cząstka glikolu polialkilenowego może mieć między 1 a 50 podjednostek glikolu polialkilenowego, między 3 a 50 podjednostek glikolu polialkilenowego, między 2 a 10 podjednostek glikolu polialkilenowego, między 4 a 10 podjednostek glikolu polialkilenowego, i/lub co najmniej 2 podjednostek glikolu polialkilenowego. [0190] W lipofilowej cząstce może być cząstka alkilu lub kwasu tłuszczowego lub cząstka lipofilowa może mieć między 1 a 28 atomów węgla, między 2 a 24 80 EP 1 613 343 B1 atomy węgla, między 3 a 18 atomy węgla, między 4 a 12 atomów węgla, między 5 a 7 atomów węgla, i/lub między 4 a 14 atomów węgla. [0191] Odcięcie jednego lub więcej polipeptydów innych niż X od koniugatu polipeptyd pro-X-oligomer może obejmować zetknięcie koniugatu polipeptyd pro-X-oligomer z jednym lub więcej enzymami, które są zdolne do rozcięcia wiązania (-ań) pomiędzy jednym lub więcej polipeptydami innymi niż X i polipeptydem X w warunkach odpowiednich do odcięcia jednego lub więcej polipeptydów innych niż X od koniugatu polipeptyd pro-X-oligomer. Jednym lub więcej enzymami mogą być, na przykład, trypsyna, karboksypeptydaza B, i/lub ich mieszaniny. [0192] Peptyd łączący może mieć końcową resztę aminokwasową na pierwszym końcu i odcięcie peptydu łączącego od koniugatu polipeptyd pro-Xoligomer może obejmować zetknięcie koniugatu polipeptyd pro-X ? oligomer z pierwszym enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu końcowa reszta aminokwasowa-polipeptyd X-oligomer; i zetknięcie koniugatu końcowa reszta aminokwasowa-polipeptyd X-oligomer z drugim enzymem w warunkach odpowiednich do dostarczenia koniugatu polipeptyd X-oligomer. Końcową resztą aminokwasową może być reszta argininy, polipeptydem X może być insulina i peptydem łączącym może być ludzki peptyd C. [0193] Zetknięcie koniugatu polipeptyd pro-X-oligomer z pierwszym enzymem i zetknięcie koniugatu końcowa reszta aminokwasowa-polipeptyd X-oligomer z drugim enzymem może wystąpić zasadniczo jednocześnie. Ponadto, pierwszy enzym i drugi enzym mogą być dostarczone w mieszaninie zawierającej pierwszy enzym i drugi enzym i w pewnych przykładach wykonania pierwszym enzymem może być trypsyna i drugim enzymem może być karboksypeptydaza B. [0194] Sposoby według tego ujawnienia mogą dalej obejmować chemiczną modyfikację jednego lub więcej oligomeru (-ów) koniugatu polipeptyd Xoligomer, aktywację jednego lub więcej oligomeru (-ów) koniugatu polipeptyd Xoligomer, wydłużenie jednego lub więcej oligomeru (-ów) koniugatu polipeptyd X-oligomer i/lub skrócenie jednego lub więcej oligomeru (-ów) koniugatu polipeptyd X-oligomer, 81 EP 1 613 343 B1 [0195] W sposobach według tego ujawnienia wydajność koniugatu polipeptyd X-oligomer może być większa nić 75 procent, większa niż 85 procent, większa niż około 90 procent, większa niż 95 procent i/lub większa niż 99 procent. [0196] Sposoby według tego ujawnienia dalej obejmują sposób syntezy polipeptydu X, obejmujący syntezę koniugatu polipeptyd X-oligomer jak opisano w niniejszym zgłoszeniu i hydrolizę oligomeru (-ów) z koniugatu polipeptydoligomer w celu uzyskania polipeptydu X. [0197] Także dostarczony jest w niniejszym zgłoszeniu sposób syntezy polipeptydu X obejmujący syntezę koniugatu polipeptyd X-oligomer jak opisano w niniejszym zgłoszeniu i hydrolizę oligomeru (-ów) z koniugatu polipeptydoligomer w celu uzyskania polipeptydu X. [0198] Produkt z tych sposobów może być częściowo rozciętą sprzężoną proinsuliną lub peptydem pro-X, np. częściowo rozciętym peptydem C lub peptydem łączącym. [0199] Oligomery użyteczne w sprzężeniu polipeptydów pro-X obejmują oligomery opisane w niniejszym zgłoszeniu takie jak oligomery o Wzorach I, II, III, IV, V, i VI opisanych powyżej. [0200] Dostarczona jest farmaceutyczna kompozycja, która zawiera (i) koniugat polipeptyd-oligomer zawierający propolipeptyd zawierający bioaktywny polipeptyd sprzężony z peptydem za pomocą wiązania peptydowego, które jest możliwe do rozcięcia in vitro lub in vivo uzyskując bioaktywny polipeptyd i (ii) farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą. [0201] Farmaceutyczne kompozycje zawierające koniugat polipeptyd proinsuliny-oligomer zgodnie przykładami wykonania według niniejszego ujawnienia są także dostarczone. Koniugaty polipeptyd proinsuliny-oligomer opisane powyżej mogą być utworzone do podania w farmaceutycznym nośniku zgodnie ze znanymi technikami. Zobacz, np. Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9-te Wyd. 1995). [0202] W wytwarzaniu farmaceutycznej kompozycji, koniugat propolipeptydoligomer jest zwykle zmieszany między innymi z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Nośnik musi oczywiście być dopuszczalny w sensie bycia kompatybilnym z jakimikolwiek innymi składnikami w farmaceutycznej 82 EP 1 613 343 B1 kompozycji i nie powinien być szkodliwy dla osobnika. Nośnik może być ciałem stałym lub cieczą lub oboma i korzystnie jest utworzony z koniugatem propolipeptyd-oligomer w postaci formulacji dawki jednostkowej, na przykład tabletki, która może zawierać od około 0,01 lub 0,5% do około 95% lub 99% wagowych koniugatu propolipeptyd-oligomer. Farmaceutyczne kompozycje mogą zostać przygotowane za pomocą jakichkolwiek dobrze znanych technik farmaceutycznych w tym, ale nie wyłącznie, zmieszanie komponentów, opcjonalnie zawarcie jednego lub więcej dodatkowych składników. [0203] W pewnych przykładach wykonania propolipeptydem jest proinsulina, analog proinsuliny, fragment proinsuliny, analog fragmentu proinsuliny, preproinsulina, analog preproinsuliny, fragment preproinsuliny, lub analog fragmentu preproinsuliny i możliwym do leczenia schorzeniem jest niedobór insuliny taki jak cukrzyca Typu I lub Typu II. [0204] Niniejsze ujawnienie dodatkowo dostarcza farmaceutyczne kompozycje zawierające koniugaty insulina-oligomer i/lub peptyd C-oligomer i/lub koniugaty propeptyd insuliny-oligomer zgodnie z tym wynalazkiem w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku i sposoby podania wspomnianych farmaceutycznych kompozycji osobnikowi w celu leczenia niedoboru insuliny lub zaburzenia związanego z niedoborem insuliny. [0205] Stosowany w niniejszym zgłoszeniu ?farmaceutycznie dopuszczalny nośnik? zgodnie z niniejszym ujawnieniem oznacza komponent taki jak nośnik, rozcieńczalnik lub substancja pomocnicza kompozycji, który jest kompatybilny z innymi składnikami kompozycji tak że może być połączony ze związkami i/lub kompozycjami według niniejszego ujawnienia bez eliminacji biologicznej aktywności związków lub kompozycji i jest odpowiedni do zastosowania u osobników jak określono w niniejszym zgłoszeniu bez nadmiernych działań ubocznych (takich jak toksyczność, podrażnienie, odpowiedź alergiczna i śmierć). Działania uboczne są ?nadmierne?, gdy ryzyko przewyższa korzyść zapewnioną przez kompozycję farmaceutyczną. Nie-ograniczające przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych komponentów obejmują bez ograniczeń jakiekolwiek ze standardowych farmaceutycznych nośników takich jak roztwory soli fizjologicznej buforowane fosforanem, woda, emulsje takie jak emulsje 83 EP 1 613 343 B1 olej/woda lub emulsje woda/olej, mikroemulsje i różne rodzaje środków zwilżających. [0206] Farmaceutyczne kompozycje mogą zawierać różne odpowiednie substancje pomocnicze co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny, takie jak te znajdujące się w Narodowym Receptariuszu 19, strony 2404-2406 (2000). Na przykład farmaceutyczne kompozycje mogą zawierać środki smarujące takie jak na przykład talk, stearynian magnezu i olej mineralny; środki zwilżające; środki emulgujące i zawieszające; środki wiążące takie jak skrobie, guma arabska, celuloza mikrokrystaliczna, celuloza, metyloceluloza i syrop; środki przeciwzbrylające takie jak krzemian wapnia; środki powlekające takie jak metakrylany hydroksybenzoesany i metylu szelak; i środki propylu; konserwujące środki słodzące; takie lub jak środki aromatyzujące. Także mogą być stosowane poliole i obojętne środki wypełniające. Przykłady polioli obejmują, ale nie wyłącznie, mannitol, sorbitol, ksylitol, sacharozę, maltozę, glukozę, laktozę, dekstrozę i tym podobne. Inne obojętne środki wypełniające, które mogą być stosowane obejmują te, które są znane w dziedzinie i są użyteczne w wytwarzaniu różnych postaci dawkowania. Jeśli jest to pożądane stałe formulacje mogą zawierać inne komponenty takie jak środki pęczniejące i/lub środki granulujące i tym podobne. Produkty leku według wynalazku mogą być tworzone tak, aby zapewnić szybkie, przedłużone lub opóźnione uwalnianie aktywnego składnika po podaniu osobnikowi przez zastosowanie procedur dobrze znanych w dziedzinie. [0207] Niniejsze ujawnienie także dostarcza farmaceutyczne kompozycje, które obejmują te odpowiednie do podania doustnego, doodbytniczego, przez inhalację (np. za pomocą aerozolu), doustnego (np. podjęzykowego), dopochwowego, pozajelitowego śródskórnego, śródstawowego, (np. podskórnego, śródpłucnego, domięśniowego, dootrzewnowego, domózgowego, dotętniczego lub dożylnego), miejscowego (np. zarówno przez powierzchnie skóry jak i błony śluzowe, w tym powierzchnie dróg oddechowych) i przezskórne podanie, chociaż najodpowiedniejsza droga w jakimkolwiek danym przypadku będzie zależeć od charakteru i ostrości leczonego schorzenia 84 EP 1 613 343 B1 i od charakteru określonego koniugatu insulina-oligomer, który jest stosowany. [0208] Farmaceutyczne kompozycje odpowiednie do podania doustnego mogą występować w oddzielnych jednostkach takich jak kapsułki, pastylki lub tabletki, każda zawierająca wcześniej określoną ilość koniugatów insulina-oligomer; w postaci proszku lub granulek; w postaci roztworu lub zawiesiny w wodnej lub nie-wodnej cieczy; lub w postaci emulsji olej-w-wodzie lub woda-w-oleju. Takie formulacje mogą być przygotowane za pomocą jakiegokolwiek odpowiedniego sposobu farmaceutycznego, który obejmuje etap połączenia koniugatu insulinaoligomer i odpowiedniego nośnika (który może zawierać jeden lub więcej dodatkowych składników jak stwierdzono powyżej). Ogólnie, farmaceutyczna kompozycja może być przygotowana przez jednolite i dokładne zmieszanie koniugatu insulina lecznicza-oligomer z cieczą lub drobno podzielonym stałym nośnikiem lub oboma a następnie jeśli to konieczne, ukształtowanie otrzymanej mieszaniny. [0209] Farmaceutyczna kompozycją odpowiednią kompozycja do podania może być doustnego. ciekłą farmaceutyczną Gdy farmaceutyczna kompozycja jest ciekłą farmaceutyczną kompozycją kompozycja może zawierać środek buforujący jak opisano powyżej. Ciekłe kompozycje farmaceutyczne mogą mieć pH które jest fizjologicznie kompatybilne. Ciekłe kompozycje farmaceutyczne mogą mieć pH, które wynosi między 6.2 a 9.0. W pewnych przykładach wykonania ciekłe kompozycje farmaceutyczne mają pH, które jest między dolną granicą 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, lub 7.7 a górną granicą 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, lub 8.9. W pewnych przykładach wykonania ciekłe kompozycje farmaceutyczne mają pH, które jest między 7.0 a 8.5. W innych przykładach wykonania, ciekłe farmaceutyczne kompozycje zgodnie z niniejszym wynalazkiem mają pH, które wynosi między 7.4 a 8.2. [0210] W innych przykładach wykonania farmaceutyczna kompozycja jest stałą farmaceutyczną kompozycją odpowiednią do podania doustnego. Stała farmaceutyczna kompozycja może być przygotowana za pomocą różnych sposobów co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Na przykład tabletka może być przygotowana przez kompresję lub formowanie proszku lub 85 EP 1 613 343 B1 granulek zawierających koniugat insulina lecznicza-oligomer, opcjonalnie z jednym lub więcej dodatkowymi składnikami. Kompresowane tabletki mogą być przygotowane przez kompresję w odpowiednim urządzeniu mieszaniny w postaci sypkiej takiej jak proszek lub granulki opcjonalnie zmieszane ze środkiem(-ami) wiążącym, smarującym, obojętnym rozcieńczalnikiem i/lub środkiem powierzchniowo czynnym/rozpraszającym. Formowane tabletki mogą zostać wytworzone przez formowanie, w odpowiednim urządzeniu, sproszkowanego związku zwilżonego obojętnym ciekłym środkiem wiążącym. [0211] Farmaceutyczne kompozycje odpowiednie do podania doustnego (podjęzykowego) obejmują pastylki zawierające koniugat insulina leczniczaoligomer w smakowym podłożu, zazwyczaj sztucznym słodziku i akacji lub tragakancie; i pastylki zawierające koniugat insulina lecznicza-oligomer w obojętnym podłożu takim jak żelatyna i gliceryna lub sacharoza i akacja. [0212] Farmaceutyczne kompozycje mogą zawierać jałowe wodne i nie-wodne roztwory do wstrzyknięć zawierające koniugat insulina lecznicza-oligomer, które te preparaty mogą być izotoniczne z krwią przeznaczonego biorcy. Te preparaty mogą zawierać przeciw-utleniacze, bufory, bakteriostatyki i substancje rozpuszczone, które czynią kompozycje izotoniczne z krwią przeznaczonego biorcy. Wodne i nie-wodne jałowe zawiesiny mogą zawierać środki zawieszające i środki zagęszczające. Kompozycje mogą występować w pojemnikach z dawką jednostkową lub wielodawkowych, na przykład szczelnych ampułkach i fiolkach i mogą być przechowywane w stanie liofilizowanym wymagającym tylko dodania jałowego ciekłego nośnika, na przykład soli lub wody do wstrzyknięć bezpośrednio przed zastosowaniem. [0213] Roztwory i zawiesiny do wstrzyknięć przygotowywane ex tempore mogą być utworzone z jałowych proszków, granulek i tabletek jakiegokolwiek opisanego wcześniej rodzaju. Na przykład, może być dostarczona wstrzykiwalna, trwała, jałowa kompozycja zawierająca koniugat insulina lecznicza-oligomer w postaci dawki jednostkowej w szczelnym pojemniku. Koniugat insulina lecznicza-oligomer jest dostarczony w postaci liofilizatu, który może być odtworzony za pomocą odpowiedniego farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika w celu utworzenia ciekłej kompozycji odpowiedniej do 86 EP 1 613 343 B1 wstrzyknięcia osobnikowi. [0214] Farmaceutyczne kompozycje mogą dodatkowo zawierać komponent buforujący. Komponent buforujący może zawierać różne środki buforujące co będzie zrozumiałe przez znawców z dziedziny. Przykładowe środki buforujące obejmują, ale nie wyłącznie, kwasy nieorganiczne (np. kwas fosforowy), kwasy organiczne (np. kwas cytrynowy), zasady organiczne (np. tris-zasadę (tris(hydroksymetylo)aminometan), trolaminę (trietanoloaminę), lub histydynę), i ich mieszaniny. Komponent buforujący może zawierać organiczną zasadę i może zawierać tris-zasadę, trolaminę lub ich mieszaninę. W pewnych przykładach wykonania komponent buforujący zawiera kwas organiczny i zasadę organiczną i może zawierać kwas cytrynowy i tris-zasadę, trolaminę lub ich mieszaninę. Środek buforujący może występować w ilości, która zbuforuje farmaceutyczną kompozycję na środowisko kwaśne, na które może być wystawiona w jelicie co będzie zrozumiałe przez znawcę z dziedziny. [0215] Postać dawki jednostkowej kompozycji może sięgać od około 1.0 ?g do około 10 gramów. koniugatu insulina lecznicza-oligomer. Gdy koniugat insulina lecznicza-oligomer jest zasadniczo nierozpuszczalny w wodzie, odpowiednia ilość środka emulgującego, która jest fizjologicznie dopuszczalna może być zastosowana w odpowiedniej ilości do zemulgowania koniugatu insulina lecznicza-oligomer w wodnym nośniku. Jednym takim użytecznym środkiem emulgującym jest fosfatydylocholina. [0216] Farmaceutyczne kompozycje odpowiednie do podania doodbytniczego mogą występować w postaci czopków z dawką jednostkową. Mogą one zostać przygotowane przez zmieszanie koniugatu insulina lecznicza-oligomer z jednym lub więcej konwencjonalnymi stałymi nośnikami, na przykład masłem kakaowym a następnie uformowanie otrzymanej mieszaniny. [0217] Farmaceutyczne kompozycje odpowiednie do podania na skórę mogą być w postaci maści, kremu, balsamu, pasty, żelu, spreju, aerozolu, przezskórnego plastra lub oleju. Nośniki, które mogą być stosowane obejmują, ale nie wyłącznie, wazelinę białą, lanolinę, glikole polietylenowe, alkohole, przezskórne środki wzmacniające i połączenia dwóch lub więcej z nich. [0218] Farmaceutyczne kompozycje odpowiednie do podania przezskórnego 87 EP 1 613 343 B1 mogą występować w postaci odrębnych plastrów przystosowanych do pozostania w bliskim kontakcie z naskórkiem biorcy przez wydłużony okres czasu. Kompozycje odpowiednie do podania przezskórnego mogą także być dostarczone za pomocą jonoforezy (zobacz na przykład Pharmaceutical Research 3 (6):318 (1986)) i zwykle mają postać opcjonalnie buforowanego roztworu koniugatu insulina lecznicza-oligomer. Odpowiednie formulacje zawierają cytrynian lub bis/tris bufor (pH 6) lub etanol/wodę i mogą zawierać na przykład od 0,1 do 0,2 M aktywnego składnika. [0219] Sposoby leczenia niedoboru insuliny i/lub zaburzeń związanych z niedoborem insuliny u osobnika potrzebującego takiego leczenia przez podanie terapeutycznie skutecznej ilości jakiejkolwiek z różnych farmaceutycznych kompozycji według niniejszego ujawnienia są także dostarczone. Skuteczna ilość koniugatu insulina lecznicza-oligomer może różnić się między koniugatami i osobnikami i będzie zależeć na przykład od czynników takich jak wiek, stan osobnika, ostrość schorzenia, które ma być leczone i/lub drogi podania. Odpowiednia ?terapeutycznie skuteczna ilość? w jakimkolwiek poszczególnym przypadku może być wyznaczona przez znawcę z dziedziny przez odniesienie do odpowiednich tekstów i literatury i/lub przez zastosowanie rutynowych doświadczeń. (Zobacz na przykład Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9-te Wyd. 1995). Terapeutycznie skuteczna ilość farmaceutycznych kompozycji według tego ujawnienia może zawierać takie ilości, które skutkują lub zachowują poziomy glukozy we krwi w prawidłowym zakresie, co będzie wiadome dla znawcy z dziedziny. [0220] Badanym według tego ujawnienia może być jakiekolwiek zwierzę, które wytwarza insulinę i dlatego też jest podatne na niedobór insuliny i/lub zaburzenia związane z niedoborem insuliny i które jest możliwe do leczenia za pomocą kompozycji według tego wynalazku. Badanym może być jakikolwiek ssak i ssakiem może być człowiek. [0221] Sposoby leczenia schorzenia możliwego do leczenia za pomocą bioaktywnego polipeptydu u osobnika potrzebującego takiego leczenia także są dostarczone w niniejszym zgłoszeniu, które obejmują podanie osobnikowi skutecznej ilości koniugatu propolipeptyd-oligomer, który to koniugat zawiera 88 EP 1 613 343 B1 bioaktywny polipeptyd sprzężony z peptydem za pomocą wiązania peptydowego, które jest możliwe do rozcięcia in vivo dając bioaktywny polipeptyd, i dostarczony jest także oligomer sprzężony z bioaktywną polipeptydową częścią propolipeptydu. [0222] Przykładowo, dawka od około 1.0 ?g/kg do około 50 mg/kg, w tym jakikolwiek zakres dawek między tymi wartościami, będzie wykazywać terapeutyczną skuteczność, z wszystkimi masami obliczonymi w oparciu o masę insuliny i/lub koniugatu insulina lecznicza-oligomer. Obawy związane z toksycznością na wyższym poziomie mogą ograniczyć dożylne dawki do niższego poziomu takiego jak do około 10 mg/kg, z wszystkimi masami obliczonymi w oparciu o masę aktywnej zasady. Dawka od około 10 mg/kg do około 50 mg/kg może być zastosowana do podania doustnego. Zwykle dawka od około 0,5 mg/kg do 5 mg/kg może być zastosowana do wstrzyknięcia domięśniowego. Częstotliwość podania może wynosić na przykład raz, dwa, trzy lub więcej razy na dzień lub kiedy jest to konieczne do kontroli schorzenia. Kontrola schorzenia i skuteczność leczenia mogą być z łatwością wyznaczone przez znawców z dziedziny badania i/lub leczenia niedoborów insuliny i/lub powiązanych zaburzeń. Alternatywnie farmaceutyczne kompozycje według tego wynalazku mogą być podane za pomocą wlewu ciągłego. Czas trwania leczenia zależy od rodzaju leczonego niedoboru insuliny i może trwać całe życie osobnika. [0223] Niniejszy wynalazek zostanie teraz opisany w odniesieniu do następujących przykładów. Przykłady Przykład 1 Synteza estru 2,5-diokso-pirolidyn-1-ylowego kwasu 6-(2-{2-[2-(2-12-[2-(2metoksyetoksy)etoksy]-etoksylo-etoksy)-etoksy]-etoksy}-etoksy)heksanowego (8) [0224] Eter monobenzylowy glikolu heksaetylenowego (1). Wodny roztwór wodorotlenku sodu przygotowany przez rozpuszczenie 3.99 (100 mmol) NaOH w 4 ml wody dodano powoli do monorozproszonego glikolu heksaetylenowego (28.175 g, 25 ml, 100 mmol). Dodano chlorek benzylu (3.9 g, 30.8 mmol, 3.54 89 EP 1 613 343 B1 ml) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano mieszając do 100°C przez 18 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną ochłodzono, rozcieńczono solanką (250 ml) i ekstrahowano chlorkiem metylenu (200 ml x 2). Połączone warstwy organiczne przemyto raz solanką, wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni do ciemnobrązowego oleju. Surową mieszaninę z produktem oczyszczono za pomocą szybkiej chromatografii (żel krzemionkowy, elucja gradientowa: octan etylu do 9/1 octan etylu/metanol) uzyskując 8.099 g (70 %) monorozproszonego związku 1 w postaci żółtego oleju. [0225] 6-Metylosulfonyloksyheksanian etylu (2). Roztwór monorozproszonego 6-hydroksyheksanianu etylu (50.76 ml, 50.41 g, 227 mmol) w suchym dichlorometanie (75 ml) ochłodzono w łaźni lodowej i umieszczono w atmosferze azotu. Dodano trietyloaminę (34.43 ml, 24.99 g, 247 mmol). Przez dodatkowy lejek dodano kroplami roztwór chlorku metanosulfonylu (19.15 ml, 28.3 g, 247 mmol) w suchym dichlorometanie (75 ml). Mieszaninę mieszano przez trzy i pół godziny, powoli doprowadzając ją do temperatury pokojowej wraz z topieniem się łaźni lodowej. Mieszaninę przesączono przez żel krzemionkowy i przesącz przemywano kolejno wodą, nasyconym NaHCO3, wodą i solanką. Warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni uzyskując bladożółty olej. Ostateczne oczyszczanie surowego produktu osiągnięto za pomocą szybkiej chromatografii (żel krzemionkowy, 1/1 heksany/octan etylu) uzyskując monorozproszony związek 2 (46.13 g, 85 %) w postaci przejrzystego, bezbarwnego oleju. FAB MS: m/e 239 (M+H), 193 (M-C2H5O). [0226] Ester etylowy kwasu 6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-benzyloksyetoksy)etoksyloetoksylo-etoksy)-etoksy)-etoksy}-heksanowego (3). Wodorek sodu (3.225 g lub 60 % rozproszenie w oleju, 80.6 mmol) zawieszono w 80 ml bezwodnego toluenu, umieszczono w atmosferze azotu i ochłodzono w łaźni lodowej. Do zawiesiny NaH dodano roztwór monorozproszonego alkoholu 9 (27.3 g, 73.3 mmol) w 80 ml bezwodnego toluenu. Mieszaninę mieszano w 0°C przez trzydzieści minut, pozostawiono do osiągnięcia temperatury pokojowej i mieszano przez kolejne pięć godzin, w którym to czasie mieszanina stała się przejrzystym brązowym roztworem. Do mieszaniny NaH/alkoholu dodano 90 EP 1 613 343 B1 monorozproszony mesylan 10 (19.21 g, 80.6 mmol) w 80 ml suchego toluenu i połączone roztwory mieszano w temperaturze pokojowej przez trzy dni. Mieszaninę reakcyjną ugaszono za pomocą 50 ml metanolu i przesączono przez zasadową glinkę. Przesącz zatężono w próżni i oczyszczono za pomocą szybkiej chromatografii (żel krzemionkowy, elucja gradientowa: 3/1 octan etylu/heksany do octanu etylu) uzyskując monorozproszony związek 3 w postaci bladożółtego oleju (16.52 g, 44 %). FAB MS: mle 515 (M+H). [0227] Ester etylowy kwasu 6-{2-[2-(2-{2-[2-(2-hydroksyetoksy)etoksyloetoksy}-etoksy)-etoksy]-etoksy}-heksanowego (4). Zasadniczo monorozproszony eter benzylowy 3 (1.03 g, 2.0 mmol) rozpuszczono w 25 ml etanolu. Do tego roztworu dodano 270 mg 10 % Pd/C, i mieszaninę umieszczono w atmosferze wodoru i mieszano przez cztery godziny, w którym to czasie TLC wykazało całkowite zniknięcie materiału wyjściowego. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez Celit 545, aby usunąć katalizator i przesącz zatężono w próżni uzyskując monorozproszony związek 4 w postaci przejrzystego oleju (0.67 g, 79 %). FAB MS: m/e 425 (M+H), 447 (M+Na). [0228] Ester etylowy kwasu 6-{2-[2-(2-{2-[2-(2- metylosulfonyloetoksy)etoksylo-etoksy}-etoksy)-etoksylo-etoksy}heksanowego (5). Monorozproszony alkohol 4 (0.835 g, 1.97 mmol) rozpuszczono w 3,5 ml suchego dichlorometanu i umieszczono w atmosferze azotu. Dodano trietyloaminę (0.301 ml, 0.219 g, 2.16 mmol) i mieszaninę ochłodzono w łaźni lodowej. Po dwóch minutach dodano chlorek metanosulfonylu (0.16 ml, 0.248 g, 2.16 mmol). Mieszaninę mieszano przez 15 minut w 0°C, następnie w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Mieszaninę reakcyjną przesączono przez żel krzemionkowy w celu usunięcia chlorku trietyloamonu i przesącz kolejno przemywano wodą, nasyconym NaHCO3, wodą i solanką. Warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni. Pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, 9/1 octan etylu/metanol) uzyskując monorozproszony związek 5 w postaci przejrzystego oleju (0.819 g, 83 %). FAB MS: m/e 503 (M+H). [0229] Ester etylowy kwasu 6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-metoksyetoksy)etoksy]91 EP 1 613 343 B1 etoksy}-etoksy)-etoksy]-etoksy)-etoksy)-heksanowego (6). NaH (88 mg 60 % rozproszenia w oleju, 2.2 mmol) zawieszono w bezwodnym toluenie (3 ml) w atmosferze N2 i ochłodzono do 0 °C. Dodano monorozproszony eter monometylowy glikolu dietylenowego (0.26 ml, 0.26 g, 2.2 mmol), który wysuszono za pomocą destylacji azeotropowej z toluenem. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano przez cztery godziny, w którym to czasie mętna szara zawiesina stała się przejrzysta i żółta a następnie zmieniła kolor na brązowy. Dodano mesylan 5 (0.50 g, 1.0 mmol) w 2.5 ml suchego toluenu. Po mieszaniu w temperaturze pokojowej przez całą noc reakcję wygaszono przez dodanie 2 ml metanolu i otrzymany roztwór przesączono przez żel krzemionkowy. Przesącz zatężono w próżni i FAB MS: m/e 499 (M+H), 521 (M+Na). Dodatkowe oczyszczenie za pomocą chromatografii preparatywnej (żel krzemionkowy, 19/3 chloroform/metanol) dostarczyło monorozproszony związek 6 w postaci przejrzystego żółtego oleju (0.302 g 57 %). FAB MS: m/e 527 (M+H), 549 (M+Na). [0230] Kwas 6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-metoksyetoksy)etoksy]-etoksy}-etoksy)etoksy]-etoksy}-etoksy)-heksanowy (7). Monorozproszony ester 6 (0.25 g, 0.46 mmol) mieszano przez 18 godzin w 0.71 ml 1 N NaOH. Po 18 godzinach mieszaninę zatężono w próżni w celu usunięcia alkoholu i pozostałość rozpuszczono w dodatkowych 10 ml wody. Wodny roztwór zakwaszono do pH 2 za pomocą 2N HCl i produkt ekstrahowano do dichlorometanu (30 ml x 2). Połączone warstwy organiczne następnie przemyto solanką (25 ml x 2), wysuszono nad Na2SO4,przesączono i zatężono w próżni uzyskując monorozproszony związek 15 w postaci żółtego oleju (0.147 g, 62 %). FAB MS: m/e 499 (M+H), 521 (M+Na). [0231] Ester 2,5-diokso-pirolidyn-1-ylowy kwasu 6-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2metoksyetoksy)etoksy]-etoksy}-etoksy)-etoksy]-etoksy}-etoksy)heksanowego(8). Monorozproszony kwas 7 (0.209 g, 0.42 mmol) rozpuszczono w 4 ml suchego dichlorometanu i dodano do suchej kolby już zawierającej NHS (N-hydroksysukcynoimid) (57.8 mg, 0.502 mmol) i EDC (chlorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu) (98.0 mg, 92 EP 1 613 343 B1 0.502 mmol) w atmosferze N2. Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez całą noc i przesączono przez żel krzemionkowy w celu usunięcia nadmiaru odczynników i mocznika utworzonego z EDC. Przesącz zatężono w próżni uzyskując aktywowany monorozproszony oligomer 8 w postaci ciemnożółtego oleju (0.235g, 94%). FAB MS: m/e 596 (M+H), 618 (M+Na). Przykład 2 Synteza Aktywowanego MPEG7-C8 (14) [0232] Mesylan eteru monometylowego glikolu trietylenowego (9). Do roztworu CH2Cl2 (100 mL) ochłodzonego do 0°C w łaźni lodowej dodano monorozproszony eter monometylowy glikolu trietylenowego (25 g, 0.15 mol). Następnie dodano trietyloaminę (29.5 mL, 0.22 mol) i roztwór mieszano przez 15 minut w 0°C, po czym kroplami dodano chlorek metanosulfonylu (13.8 mL, 0.18 mol, rozpuszczony w 20 mL CH2Cl2). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 minut w 0°C, pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej a następnie mieszano przez 2 godziny. Surową mieszaninę reakcyjną przesączono przez Celit (przemyto CH2Cl2 ~200 mL), następnie przemyto H2O (300 mL), 5% NaHCO3 (300 mL), H2O (300 mL), nas. NaCl (300 mL), wysuszono nad MgSO4, i odparowano do sucha. Olej umieszczono na linii próżniowej na ~2 godz., aby zapewnić wysuszenie i uzyskano monorozproszony związek 9 w postaci żółtego oleju (29.15 g, 80% wydajność). [0233] Eter monoetylowy glikolu heptaetylenowego (10). Do roztworu monorozproszonego glikolu tetraetylenowego (51.5 g, 0.27 mol) w THF (1L) dodawano t-butoksyd potasu (14.8 g, 0.13 mol, małymi porcjami przez ~30 minut). Mieszaninę reakcyjną następnie mieszano przez 1 godzinę a następnie 9 (29.15 g, 0.12 mol) rozpuszczony w THF (90 mL) dodano kroplami i mieszaninę reakcyjną mieszano przez całą noc. Surową mieszaninę reakcyjną przesączono przez Celit (przemyto CH2Cl2, ~200 mL) i odparowano do sucha. Następnie olej rozpuszczono w HCl (250 mL, 1 N) i przemyto octanem etylu (250 mL), aby usunąć nadmiar 9. Dodatkowe przemycia octanem etylu (125 mL) mogą być wymagane, aby usunąć pozostały 9. Fazę wodną ponownie przemywano CH2Cl2 (125 mL objętości) aż większość związku 18 zostało usunięto z fazy wodnej. Pierwsza ekstrakcja będzie zawierać 9, 10, i podwójnie 93 EP 1 613 343 B1 sprzężony produkt uboczny i powinien być z powrotem ekstrahowany za pomocą HCl (125 mL, 1N). Warstwy organiczne połączono i odparowano do sucha. Otrzymany olej następnie rozpuszczono w CH2Cl2 (100 mL) i ponownie przemywano H2O (50 mL objętości) aż do usunięcia 10. Wodne frakcje połączono, całkowita objętość 500 mL i dodawano NaCl aż roztwór stał się mętny i wtedy przemyto za pomocą CH2Cl2 (2 x 500 mL). Warstwy organiczne połączono, wysuszono nad MgSO4, i odparowano do sucha uzyskując monorozproszony związek 10 w postaci oleju (16.9 g, 41% wydajność). Może być pożądane, aby powtórzyć jeden lub więcej etapów procedury oczyszczania, aby zapewnić wysoką czystość. [0234] 8-Bromooktanian (11). Do roztworu monorozproszonego kwasu 8bromooktanowego (5.0 g, 22 mmol) w etanolu (100 mL) dodano H2SO4 (0.36 mL, 7.5 mmol) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano pod chłodnicą zwrotną mieszając przez 3 godziny. Surową mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej i przemyto H2O (100 mL), nas. NaHCO3 (2 x 100 mL), H2O (100 mL), wysuszono nad MgSO4, i odparowano do sucha uzyskując przejrzysty olej 11 (5.5 g, 98% wydajność). [0235] Ester MPEG7-C8 (12). Do roztworu monorozproszonego związku 10 (3.0 g, 8.8 mmol) w eterze (90 mL) dodano t-butoksyd potasu (1.2 g, 9.6 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę. Następnie dodano kroplami monorozproszony związek 11 (2.4 g, 9.6 mmol), rozpuszczony w eterze (10 mL), i mieszaninę reakcyjną mieszano przez całą noc. Surową mieszaninę reakcyjną przesączono przez Celit (przemyty CH2Cl2, ~200 mL) i odparowano do sucha. Otrzymany olej rozpuszczono w octanie etylu i przemyto H2O (2 x 200 mL), wysuszono nad MgSO4, i odparowano do sucha. Przeprowadzono chromatografię kolumnową (Krzemionka, octan etylu do octan etylu/metanol, 10:1) i uzyskano monorozproszony związek 12 w postaci przejrzystego oleju (0.843 g, 19% wydajność). [0236] Kwas MPEG7-C8 (13). Do oleju monorozproszonego związku 12 (0.70 g, 1.4 mmol) dodano 1N NaOH (2.0 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godziny. Surową mieszaninę reakcyjną zatężono, zakwaszono (pH~2), nasycono NaCl, i przemyto CH2Cl2 (2 x 50 mL). Warstwy organiczne połączono, 94 EP 1 613 343 B1 przemyto nas. NaCl, wysuszono nad MgSO4, i odparowano do sucha uzyskując monorozproszony związek 13 w postaci przejrzystego oleju (0.35 g, 53% wydajność). [0237] Aktywacja kwasu MPEG7-C8. Monorozproszony kwas mPEG7-C8 13 (0.31g, 0.64 mmol) rozpuszczono w 3 ml bezwodnego chlorku metylenu a następnie dodano roztwór N-hydroksysukcynoimidu (0.079g, 0.69 mmol) i EDCI?HCl (135.6 mg, 0.71 mmol) w bezwodnym chlorku metylenu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez kilka godzin, następnie przemyto 1N HCl, wodą, wysuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono. Surowy materiał oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej, zatężono uzyskując monorozproszony aktywowany MPEG7-C8 14 w postaci przejrzystego oleju i wysuszono za pomocą próżni. Przykład 3 Synteza Aktywowanego MPEG7-C10 (19) [0238] 10-hydroksydekanian (15). Do roztworu monorozproszonego kwasu 10-hydroksydekanowego (5.0 g, 26.5 mol) w etanolu (100 mL) dodano H2SO4 (0.43 mL, 8.8 mmol) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano pod chłodnicą zwrotną mieszając przez 3 godziny. Surową mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej i przemyto H2O (100 mL), nas. NaHCO3 (2 x 100 mL), H2O (100 mL), wysuszono nad MgSO4, i odparowano do sucha uzyskując monorozproszony związek 15 w postaci przejrzystego oleju (6.9 g, 98% wydajność). [0239] Mesylan 10-hydroksydekanianu (16). Do roztworu CH2Cl2 (27 mL) dodano monorozproszony 10-hydroksydekanian 15 (5.6 g, 26 mmol) i ochłodzono do 0°C w łaźni lodowej. Następnie dodano trietyloaminę (5 mL, 37 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut w 0°C. Następnie dodano chlorek metanosulfonylu (2.7 mL, 24 mmol) rozpuszczony w CH2Cl2 (3 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 30 minut, łaźnię lodową usunięto i mieszaninę reakcyjną mieszano przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze pokojowej. Surową mieszaninę reakcyjną przesączono przez Celit (przemyty CH2Cl2, 80 mL) i przesącz przemyto H2O (100 mL), 5% NaHCO3 (2 x 100 mL), H2O (100 mL), nas. NaCl (100 mL), wysuszono nad MgSO4, i 95 EP 1 613 343 B1 odparowano do sucha uzyskując monorozproszony związek 16 w postaci żółtawego oleju (7.42 g, 97% wydajność). [0240] Ester MPEG7-C10 (17). Do roztworu zasadniczo monorozproszonego eteru monometylowego glikolu heptaetylenowego 10 (2.5 g, 7.3 mmol) w tetrahydrofuranie (100 mL) dodano wodorek sodu (0.194 g, 8.1 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę. Następnie dodano kroplami mesylan monorozproszonego 10-hydroksydekanianu 16 (2.4 g, 8.1 mmol), rozpuszczonego w tetrahydrofuranie (10 mL), i mieszaninę reakcyjną mieszano przez całą noc. Surową mieszaninę reakcyjną przesączono przez Celit (przemyty CH2Cl2, ~200 mL) i odparowano do sucha. Otrzymany olej rozpuszczono w octanie etylu i przemyto H2O (2 x 200 mL), wysuszono nad MgSO4, odparowano do sucha, poddano analizie chromatograficznej (krzemionka, octan etylu/metanol, 10:1) i poddano analizie chromatograficznej (krzemionka, octan etylu) uzyskując monorozproszony związek 17 w postaci przejrzystego oleju (0.570 g, 15% wydajność). [0241] Kwas MPEG7-C10 (18). Do oleju monorozproszonego estru mPEG 7-C10 17 (0.570 g, 1.1 mmol) dodano 1N NaOH (1.6 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez całą noc. Surową mieszaninę reakcyjną zatężono, zakwaszono (pH~2), nasycono NaCl, i przemyto CH2Cl2 (2 x 50 mL). Warstwy organiczne połączono, przemyto nas.NaCl (2 x 50 mL), wysuszono nad MgSO4, i odparowano do sucha uzyskując monorozproszony związek 18 w postaci przejrzystego oleju (0.340 g, 62% wydajność). [0242] Aktywacja Kwasu MPEG7-C10. Monorozproszony kwas 18 aktywowano przy zastosowaniu procedur opisanych w niniejszym zgłoszeniu dostarczając aktywowany Oligomer MPEG7-C10 19. Przykład 4 Synteza Aktywowanego Oligomeru C18(PEG6) (22) [0243] Synteza Oligomeru C18(PEG6) (20). Monorozproszony chlorek stearoilu (0.7g, 2.31 mmol) powoli dodano do mieszaniny monorozproszonego PEG 6 (5 g, 17.7 mmol) i pirydyny (0.97g, 12.4 mmol) w benzenie. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez kilka godzin (~5). Po reakcji przeprowadzono TLC przy zastosowaniu octanu etylu/metanolu jako rozpuszczalnika rozwijającego. 96 EP 1 613 343 B1 Następnie mieszaninę reakcyjną przemyto wodą, wysuszono nad MgSO4, zatężono i wysuszono za pomocą próżni. Oczyszczony monorozproszony związek 20 analizowano za pomocą FABMS: m/e 549/ M+H. [0244] Aktywacja Oligomeru C18(PEG6). Aktywację monorozproszonego oligomeru C18(PEG6) przeprowadzono w dwóch etapach. 1) Monorozproszony stearoilo-PEG6 20 (0.8 g, 1.46 mmol) rozpuszczono w toluenie i dodano do roztworu fosgenu (10 ml, 20% w toluenie), który ochłodzono za pomocą łaźni lodowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę w 0°C a następnie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie fosgen i toluen oddestylowano i pozostały zasadniczo monorozproszony chloromrówczan stearoilo-PEG6 21 suszono nad P2O5 przez całą noc. 2) Do roztworu monorozproszonego chloromrówczanu stearoilo-PEG 6 21 (0.78g, 1.27 mmol) i TEA (128 mg, 1.27 mmol) w bezwodnym chlorku metylenu dodano roztwór N-hydroksysukcynoimidu (NHS) w chlorku metylenu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 16 godzin, następnie przemyto wodą, wysuszono nad MgSO4, przesączono, zatężono i wysuszono za pomocą próżni uzyskując monorozproszony aktywowany oligomer C18(PEG6) 22. Przykład 5 Synteza Aktywowanego Oligomeru C18(PEG8) (28) [0245] Monobenzyloeter glikolu tetraetylenowego (23). Do oleju monorozproszonego glikolu tetraetylenowego (19.4 g, 0.10 mol) dodano roztwór NaOH (4.0 g w 4.0 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut. Dodano chlorek benzylu (3.54 mL, 30.8 mmol) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano do 100°C i mieszano przez całą noc. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, rozcieńczono nas.NaCl (250 mL) i przemyto CH2Cl2 (2 x 200 mL). Warstwy organiczne połączono, przemyto nas. NaCl, wysuszono nad MgSO4, i poddano analizie chromatograficznej (krzemionka, octan etylu) uzyskując monorozproszony związek 23 w postaci żółtego oleju (6.21 g, 71% wydajność). [0246] Mesylan monobenzyloeteru glikolu tetraetylenowego (24). Do 97 EP 1 613 343 B1 roztworu CH2Cl2 (20 mL) dodano monorozproszony monobenzyloeter glikolu tetraetylenowego 23 (6.21 g, 22 mmol) i ochłodzono do 0°C w łaźni lodowej. Następnie dodano trietyloaminę (3.2 mL, 24 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut w 0°C. Następnie dodano chlorek metanosulfonylu (1.7 mL, 24 mmol) rozpuszczony w CH2Cl2 (2 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano w 0°C przez 30 minut, łaźnię lodową usunięto i mieszaninę reakcyjną mieszano przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze pokojowej. Surową mieszaninę reakcyjną przesączono przez Celit (przemyty CH2Cl2, 80 mL) i przesącz przemyto H2O (100 mL), 5% NaHCO3 (2 x 100 mL), H2O (100 mL), nas. NaCl (100 mL), i wysuszono nad MgSO4. Otrzymany żółty olej poddano analizie chromatograficznej na wkładce z krzemionki zawierającej aktywowany węgiel (10 g) uzyskując monorozproszony związek 24 w postaci przejrzystego oleju (7.10 g, 89% wydajność). [0247] Monobenzyloeter glikolu oktaetylenowego (25). Do roztworu tetrahydrofuranu (140 mL) zawierającego wodorek sodu (0.43 g, 18 mmol) dodano kroplami roztwór monorozproszonego glikolu tetraetylenowego (3.5 g, 18 mmol) w tetrahydrofuranie (10 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę. Następnie monobenzyloeteru kroplami glikolu dodano tetraetylenowego mesylan 24 monorozproszonego (6.0 g, 16.5 mmol) rozpuszczonego w tetrahydrofuranie (10 mL) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez całą noc. Surową mieszaninę reakcyjną przesączono przez Celit (przemyty, CH2Cl2, 250 mL) i przesącz przemyto H2O, wysuszono MgSO4, i odparowano do sucha. Otrzymany olej poddano analizie chromatograficznej (krzemionka, octan etylu/metanol, 10:1) i poddano analizie chromatograficznej (krzemionka, chloroform/metanol, 25:1) uzyskując monorozproszony związek 25 w postaci przejrzystego oleju (2.62 g, 34% wydajność). [0248] Synteza Stearynianu PEG8-Benzylu (26). Do zmieszanego ochłodzonego monorozproszonego monobenzyloeteru glikolu oktaetylenowego 25 (0.998 g, 2.07 mmol) i pirydyny (163.9 mg, 2.07 mmol) dodano monorozproszony chlorek stearoilu (627.7 mg, 2.07 mmol) w benzenie. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez całą noc (18 godzin). Następnego dnia mieszaninę reakcyjną przemyto wodą, wysuszono nad MgSO4, zatężono i 98 EP 1 613 343 B1 wysuszono za pomocą próżni. Następnie surowy produkt poddano szybkiej chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym, wykorzystując 10% metanol/90% chloroform. Frakcje zawierające produkt połączono, zatężono i wysuszono za pomocą próżni uzyskując monorozproszony związek 26. [0249] Hydrogenoliza Stearynianu-PEG8-Benzylu. Do metanolowego roztworu monorozproszonego stearynianu PEG 8-Bzl 26 (0.854g 1.138 mmol) dodano Pd/C(10%) (pallad, 10% wag. na węglu aktywowanym). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez całą noc (18 godzin) w atmosferze wodoru. Następnie roztwór przesączono, zatężono i oczyszczono za pomocą szybkiej chromatografii kolumnowej wykorzystując 10% metanol/90% chloroform, zebrano frakcje z Rt=0.6, zatężono i wysuszono uzyskując monorozproszony kwas 27. [0250] Aktywacja Oligomeru C18(PEG8). Dwuetapową aktywację monorozproszonego oligomeru stearynianu-PEG8 27 przeprowadzono jak opisano dla stearynianu PEG6 w powyższym Przykładzie 4 dostarczając monorozproszony aktywowany oligomer C18(PEG8) 28. Przykład 6 Synteza Aktywowanych Monometylowych Oligomerów Glikolu Trietylenowego [0251] Roztwór toluenu zawierający 20% fosgen (100 ml, około 18.7 g, 189 mmol fosgen) ochłodzono do 0°C w atmosferze N 2. Monorozproszony mTEG (glikol trietylenowy, eter monometylowy, 7.8 g, 47.5 mmol) rozpuszczono w 25 mL bezwodnego octanu etylu i dodano do schłodzonego roztworu fosgenu. Mieszaninę mieszano przez jedną godzinę w 0°C, następnie pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszano przez kolejne dwie i pół godzin. Pozostały fosgen, octan etylu i toluen usunięto za pomocą destylacji próżniowej zostawiając monorozproszony chloromrówczan mTEG w postaci przejrzystej olejowej pozostałości. [0252] Monorozproszony chloromrówczan nTEG rozpuszczono w 50 mL suchego dichlorometanu, do którego dodano TEA (trietyloamina, 6.62 mL, 47.5 mmol) i NHS (N-hydroksysukcynoimid, 5.8 g, 50.4 mmol). Mieszaninę mieszano 99 EP 1 613 343 B1 w temperaturze pokojowej w bezwodnej atmosferze przez dwadzieścia godzin, w którym to czasie pojawiła się duża ilość białego osadu. Mieszaninę przesączono, aby usunąć ten osad i zatężono w próżni. Otrzymany olej umieszczono w dichlorometanie i przemyto dwukrotnie zimną dejonizowaną wodą, dwukrotnie 1N HCl i raz solanką. Warstwy organiczne wysuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono uzyskując monorozproszony związek tytułowy w postaci przejrzystego, jasnożółtego oleju. Jeśli to konieczne ester NHS może być dalej oczyszczany za pomocą szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym wykorzystując EtOAc jako eluenta. Przykład 7 Synteza Aktywowanych Oligomerów Palmitynian-TEG [0253] Monorozproszony bezwodnik palmitynowy (5 g; 10 mmol) rozpuszczono w suchym THF (20 mL) i mieszano w temperaturze pokojowej. Do zmieszanego roztworu dodano 3 mol nadmiaru pirydyny a następnie monorozproszony glikol trietylenowy (1.4 mL). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę (postęp reakcji monitorowano za pomocą TLC; octan etylu-chloroform; 3:7). Na końcu reakcji THF usunięto i produkt zmieszano z 10% kwasem H2SO4 i ekstrahowano octanem etylu (3 x 30 mL). Połączony ekstrakt przemyto kolejno wodą, solanką, wysuszono nad MgSO4, i odparowano uzyskując monorozproszone oligomery palmitynian-TEG. [0254] Roztwór węglanu N,N'-disukcynoimidylu (3 mmol) w DMF (~10 mL) dodano do roztworu monorozproszonych oligomerów palmitynian-TEG (1 mmol) w 10 mL bezwodnego DMF jednocześnie mieszając. Powoli dodano wodorek sodu (3 mmol) do mieszaniny reakcyjnej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez kilka godzin (np. 5 godzin). Dodano eter dietylowy w celu wytrącenia monorozproszonego aktywowanego tytułowego oligomeru. Ten proces powtórzono 3 razy i produkt ostatecznie wysuszono. Przykład 8 Synteza Aktywowanych Monometylowych Oligomerów Glikolu monometylowy glikolu Heksaetylenowego [0255] Monorozproszony aktywowany eter heksaetylenowego przygotowano analogicznie do tego monorozproszonego 100 EP 1 613 343 B1 glikolu trietylenowego jak opisano w niniejszym zgłoszeniu. 20% fosgen w roztworze toluenu (35 mL, 6.66 g, 67.4 mmol fosgen) ochłodzono w atmosferze N2 w łaźni wodnej z lodem/solą. Monorozproszony glikol heksaetylenowy (1.85 mL, 2.0 g, 6.74 mmol) rozpuszczono w 5 mL bezwodnego EtOAc i dodano do roztworu fosgenu za pomocą strzykawki. Mieszaninę reakcyjną mieszano na łaźni lodowej przez jedną godzinę, usunięto i mieszano 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Fosgen, EtOAc i toluen usunięto za pomocą destylacji próżniowej, pozostawiając monorozproszony chloromrówczan glikolu metyloheksaetylenowego w postaci przejrzystej olejowej pozostałości. [0256] Monorozproszony chloromrówczan rozpuszczono w 20 mL suchego dichlorometanu i umieszczono w suchej, obojętnej atmosferze. Dodano trietyloaminę (0.94 mL, 0.68 g, 6.7 mmol) a następnie NHS (N- hydroksysukcynoimid, 0.82 g, 7.1 mmol) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Mieszaninę przesączono przez żel krzemionkowy, aby usunąć biały osad i zatężono w próżni. Pozostałość umieszczono w dichlorometanie i przemyto dwukrotnie zimną wodą, dwukrotnie 1N HCl i raz solanką. Warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono. Ostateczne oczyszczanie wykonano za pomocą szybkiej chromatografii (żel krzemionkowy, EtOAc) uzyskując aktywowany monorozproszony eter monometylowy heksaetylenu. Przykład 9 Synteza Aktywowanego Monometylowego Eteru Glikolu Heptaetylenowego [0257] 8-Metoksy-1-(metylosulfonylo)oksy-3,6-dioksaoktan (29). Roztwór monorozproszonych cząsteczek monometylowego eteru glikolu trietylenowego (4.00 mL, 4.19 g, 25.5 mmol) i trietyloaminy (4.26 mL, 3.09 g, 30.6 mmol) w suchym dichlorometanie (50 mL) ochłodzono w łaźni lodowej i umieszczono w atmosferze azotu. Kroplami dodano z lejka roztwór chlorku metanosulfonylu (2.37 mL, 3.51 g, 30.6 mmol) w suchym dichlorometanie (20 mL). Dziesięć minut po zakończeniu dodawania chlorku, mieszaninę reakcyjną usunięto z łaźni lodowej i pozostawiono do uzyskania temperatury pokojowej. Mieszaninę mieszano przez dodatkową godzinę, w którym to czasie TLC (CHCl 3 z 15% 101 EP 1 613 343 B1 MeOH jako eluentem) wykazało brak pozostającego monometylowego eteru glikolu trietylenowego. [0258] Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono kolejnymi 75 mL dichlorometanu i przemyto kolejno nasyconym NaHCO3, wodą i solanką. Warstwy organiczne wysuszono nad Na2SO4, przesączono i zatężono w próżni uzyskując monorozproszoną mieszaninę związków 29 w postaci przejrzystego oleju (5.31g, 86%). [0259] Monometylowy eter glikolu heptaetylenowego (30). Do zmieszanego roztworu monorozproszonego glikolu tetraetylenowego (35.7 mmol) w suchym DMF (25.7 mL), w atmosferze N2 dodano w części 60% rozproszenie NaH w oleju mineralnym i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Do otrzymanej soli sodowej glikolu tetraetylenowego dodano roztwór monorozproszonego mesylanu 29 (23.36) w suchym DMF (4 ml) w pojedynczej części i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 3,5 godziny. Postęp reakcji monitorowano za pomocą TLC (12% CH 3OH-CHCl3). Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono równą ilością 1N HCl i ekstrahowano octanem etylu (2 x 20 ml) i odrzucono. Ekstrakcja wodnego roztworu i obróbka dały monorozproszony monometylowy eter glikolu heptaetylenowego 30 (82 -84% wydajność). Olej; Rf 0.46 (metanol: chloroform = 3:22); MS m/z obliczone dla C15H32O8 340.21 (M++1), stwierdzone 341.2. [0260] Aktywacja monometylowego eteru glikolu heptaetylenowego. Monorozproszony monometylowy eter glikolu heptaetylenowego 30 jest aktywowany za pomocą procedury opisanej w niniejszym zgłoszeniu do aktywacji monometylowego eteru glikolu trietylenowego w celu dostarczenia aktywowanego monometylowego eteru glikolu heptaetylenowego. Przykład 10 Synteza Aktywowanego Monometylowego Eteru Glikolu Dekaetylenowego (33). [0261] 20-metoksy-1-(metylosulfonylo)oksy-3,6,9,12,15,18- heksaoksaeikozan (31). Monorozproszony związek 31 otrzymano w ilościowej wydajności ze związku 30 i chlorku metanosulfonylu jak opisano dla 29 w niniejszym zgłoszeniu, w postaci oleju; Rf 0.4 (octan etylu : acetonitryl = 1:5); 102 EP 1 613 343 B1 MS m/z obliczone dla C17H37O10 433.21 (M++1), stwierdzone 433.469. [0262] Monometylowy eter glikolu dekaetylenowego (32). Monorozproszony związek 32 przygotowano ze związku 31 i monorozproszonego glikolu trietylenowego przy zastosowaniu procedury opisanej w niniejszym zgłoszeniu. Olej; Rf 0.41 (metanol: chloroform = 6:10); MS m/z obliczone dla C 21H44O11 472.29 (M++1), stwierdzone 472.29. [0263] Aktywacja monometylowego eteru glikolu dekaetylenowego. Monorozproszony monometylowy eter glikolu dekaetylenowego 32 jest aktywowany za pomocą procedury opisanej w niniejszym zgłoszeniu do aktywacji monometylowego eteru glikolu trietylenowego w celu dostarczenia aktywowanego monometylowego eteru glikolu dekaetylenowego 33. Przykład 11 Przygotowanie Insuliny Sprzężonej z LysB29-Oligomerem [0264] Sprzężenie Rekombinowanej Proinsuliny I. Rekombinowaną Proinsulinę I (Masa cząsteczkowa 10,642 Daltonów) otrzymano z Biobras, Belo Horizonte, Brazylia. Porcję proinsuliny I wynoszącą 2.32 x 10 -3 mmol rozpuszczono w 10 mL DMSO. Do roztworu dodano 324 ?L trietyloaminy. Otrzymany roztwór mieszano przez 5 minut a następnie dodano roztwór aktywowanego glikolu metyloheptaetylenowego ((PEG7)-heksylo-oligomeru) (9.30 x 10 -3 mmol) w acetonitrylu. Przebieg reakcji sprzężenia (acylacji) monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną, wygaszono ją przez dodanie 3,54 mL 5% wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 nM Buforu Tris-HCl, pH 7.6 Profil HPLC mieszaniny produktów, rekombinowanej Proinsuliny I sprzężonej z oligomerem jest przedstawiony na Figurze 11. (b) Rozcięcie za pomocą koktajlu enzymów Rekombinowanej Proinsuliny I Sprzężonej z Oligomerem. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu z Przykładu 1(a) analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów z Przykładu 11 103 EP 1 613 343 B1 (a) (0.424 ?mol/mL) poddano reakcji z trypsyną (5.97 x 10 -4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (1.93 x 10 -4 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1,58 mL 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC (w odniesieniu do czasów retencji znanych referencyjnych wzorców) i analizy widma masowego. W ten sposób otrzymano Insulinę (10%) i Insulinę Sprzężoną z LysB29-Heksylo-PEG7-Oligomerem (84%) (Figury 11 - 13). Przykład 12 Izolacja Produktów Sprzężenia Oligomeru z Rekombinowaną Proinsuliną I [0265] HPLC w odwróconym układzie faz zastosowano do wyizolowania głównych produktów z mieszaniny produktów otrzymanej z reakcji sprzężenia opisanej w Przykładzie 11 (a). Kolumnę HPLC (1.0 cm średnicy.x25 cm długości) wypełniono komercyjnie dostępną fazą stacjonarną C18, która wiadomo że jest użyteczna do rozdzielenia peptydów i białek, a następnie wprowadzono do układu HPLC. Układ ekwilibrowano za pomocą buforu elucyjnego, mieszaniny zawierającej 72% fazy ruchomej A (H2O z 0.1 % kwasem trifluooroctowym) i 28% fazy ruchomej B (acetonitryl z 0,1% kwasem trifluorooctowym), który dostarczono z szybkością przepływu 5 mL/min. Roztwór mieszaniny produktów w 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6, naniesiono na kolumnę w odwróconym układzie faz i produkty rozdzielono i eluowano przy zastosowaniu gradientu, w którym komponent acetonitrylowy buforu elucyjnego (faza ruchoma B) zwiększano w następujący sposób: 28%-30% faza ruchoma B przez 60 minut, następnie 30%-32% faza ruchoma B przez 30 minut, następnie 32%-36% faza ruchoma B przez 40 minut. Frakcje zebrano i pojedynczo analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia identyczności i czystości zawartego w nich produktu. Wspólne frakcje zawierające ("Monokoniugat-A jeden Proinsuliny z czterech I?), produktów monokoniugat-B (monokoniugat-A (?Monokoniugat-B Proinsuliny I?), dikoniugat (?Dikoniugat Proinsuliny I?) i trikoniugat (?Trikoniugat Proinsuliny I?) zostały następnie zebrane i rozpuszczalnik usunięto przez 104 EP 1 613 343 B1 rotacyjne odparowanie. HPLC (Figura 14) i analizę widm masowych zastosowano do wyznaczenia identyczności i czystości każdego izolatu. Przykład 13 Rozcięcie za pomocą Koktajlu Enzymów Wyizolowanych Koniugatów Rekombinowanej Proinsuliny (I) [0266] Każdy koniugat (Mono A, Mono B, Di, lub Tri Proinsuliny I), który wyizolowano przy zastosowaniu procedury opisanej w Przykładzie 12 rozpuszczono w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6 i zastosowano analityczną HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu otrzymanego roztworu. Roztwór trypsyny (traktowany TPCK; z trzustki bydlęcej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Surową mieszaninę (1 mmol) następnie poddano reakcji z trypsyną (1.39 x 10 -3 mmol) i karboksypeptydazą B (4.56 x10 -4 mmol). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Mieszaninę produktów z każdej reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Czas retencji HPLC w odniesieniu do referencyjnych wzorców i analiza widm masowych zostały wykorzystane do określenia identyczności i czystości każdego produktu (Tabela 1). Tabela 1 Koniugaty Proinsuliny I i Oligomeru oraz Produkty (lub Przewidywane Produkty) z Rozcięcia Każdego z nich za pomocą Koktajlu Enzymów Koniugat Produkt (Przewidywane Produkty) Figura Mono A Insulina, (peptyd C sprzężony z Lys64-heksylo- 16 Proinsulina I PEG7-oligomerem), (Insulina Diarginal), (Insulina (Proinsulina I 64 Monoarginal), (peptyd C sprzężony z Arg65Lys sprzężona w Lys heksylo-PEG7-oligomerem) i peptyd wiodący 64) Mono B Proinsulina I (proinsulina I sprzężona w B29) (insulina sprzężona z Lys B29-Heksylo-PEG7- oligomerem), (proinsulina lub proinsulina I sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys B29-heksylo-PEG7oligomerem), proinsulina lub proinsulina I sprzężona z Des 65, 64 Lys B29-heksylo-PEG7oligomerem), peptyd wiodący) Di Proinsulina I Insulina sprzężona z LysB29-Heksylo-PEG7- 15 (proinsulina I Oligomerem (peptyd C sprzężony z Lys64-heksylosprzężona w B29 i PEG7-oligomerem), (Proinsulina lub Proinsulina I 105 EP 1 613 343 B1 Koniugaty Proinsuliny I i Oligomeru oraz Produkty (lub Przewidywane Produkty) z Rozcięcia Każdego z nich za pomocą Koktajlu Enzymów Koniugat Produkt (Przewidywane Produkty) Figura Lys 64) sprzężona z Des 65 Lys 64Lys B29-Di (heksyloPEG7-oligomerem), proinsulina lub proinsulina I sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys 64Lys B29Di(heksylo-PEG7-oligomerem), (peptyd wiodący), (peptyd C sprzężony z Arg31,32 Lys64-heksyloPEG7-oligomerem), (peptyd C sprzężony z Arg32 Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem) Tri Proinsulina I (proinsulina I sprzężona w B29, Lys 64 i N-końcu aminowym peptydu wiodącego) (Insulina sprzężona z LysB29-Heksylo-PEG7- Oligomerem) (peptyd C sprzężony z Lys-heksyloPEG7-oligomerem) (Insulina sprzężona z Lys B29heksylo-PEG7-oligomerem Proinsulina lub Proinsulina I sprzężona z Arg31-Arg32, Des 65 Lys 64 Lys B29-Di(heksylo-PEG7-oligomerem, proinsulina lub proinsulina I sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys 64 Lys B29-Di(heksylo-PEG7-oligomerem), HeksyloPEG7-oligomer Peptyd Wiodący-Arg i HeksyloPEG7-oligomer Peptyd Wiodący Przykład 14 Rozcięcie Trypsyną Wyizolowanych Koniugatów Proinsuliny I [0267] Każdy koniugat (Mono A, Mono B, Di, lub Tri Proinsuliny I), który wyizolowano przy zastosowaniu procedury opisanej w Przykładzie 12 rozpuszczono w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6 i otrzymany roztwór analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Roztwór trypsyny (traktowany TPCK; z trzustki bydlęcej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Każdy koniugat (300 mmol) następnie poddano reakcji z trypsyną (1 mmol). Po 20 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Produkty reakcji wyizolowano i analizowano za pomocą czasu retencji HPLC i analizy widm masowych w celu określenia identyczności. Przewidywanymi produktami są Insulina(Arg31) lub Insulina(Arg31) sprzężona z LysB29-heksylo-PEG7-oligomerem przedstawione w Tabeli 2. Tabela 2 Koniugat Przewidywane produkty Mono A Proinsulina I Insulina-Arg", Insulina-Arg31-Arg32, Des 65, 64 proinsulina (Proinsulina I sprzężona lub proinsulina I, Des Arg 31,32 proinsulina lub proinsulina 106 EP 1 613 343 B1 Koniugat Przewidywane produkty w Lys 64) I, peptyd C sprzężony z Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem i Arg65-Lys64-peptyd C Mono B Proinsulina I insulina (Arg31) sprzężona z LysB29-heksylo-PEG7(proinsulina I sprzężona oligomerem, Insulina-Arg31- Arg32, proinsulina lub w B29) proinsulina I sprzężona z Des 65, 64 Lys 29-heksyloPEG7-oligomerem, proinsulina lub proinsulina I sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys heksylo-PEG7-oligomerem, i peptyd C Di Proinsulina I insulina(Arg31) sprzężona z LysB29-heksylo-PEG7(proinsulina I sprzężona oligomerem, peptyd C sprzężony z Arg65-Lys64-heksylow B29 i Lys 64) PEG7-oligomerem, Insulina-Arg31- Arg32 sprzężona z LysB29heksylo-PEG7-oligomerem, proinsulina lub 64 B29 proinsulina I sprzężona z Des 65 Lys Lys -Di(heksyloPEG7-oligomerem, proinsulina lub proinsulina I sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys 64Lys B29- Di(heksylo-PEG7oligomerem) i peptyd C sprzężony z Lys 64-heksylo-PEG7oligomerem Tri Proinsulina I (proinsulina I sprzężona w B29, Lys 64 i N-końcu aminowym peptydu wiodącego) insulina(Arg31) sprzężona z LysB29-heksylo-PEG7oligomerem, peptyd C sprzężony z Arg65-Lys64-heksyloPEG7-oligomerem, Insulina-Arg31- Arg32 sprzężona z Lys B29 - heksylo-PEG7-oligomerem, proinsulina lub proinsulina I sprzężona z Des 65 Lys 64Lys B29-Di(heksylo-PEG7oligomerem, proinsulina lub proinsulina I sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys 64Lys B29- Di(heksylo-PEG7-oligomerem) peptyd C sprzężony z Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem i Heksylo-PEG7-oligomer Peptyd wiodący-Arg Przykład 15 Rozcięcie Karboksypeptydazą B Mieszaniny Produktów z Rozcięcia Trypsyną [0268] Porcję mieszaniny reakcyjnej zawierającej Insulinę(Arg31) sprzężoną z LysB29-heksylo-PEG7-oligomerem (300 mmol) (z Przykładu 14) w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 7.6 usunięto. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 7.6. Do mieszaniny reakcyjnej dodano karboksypeptydazę B (1 mmol). Reakcję pozostawiono do kontynuacji na 15 godzin a następnie ugaszono przez dodanie 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Spodziewane produkty z każdej reakcji są przedstawione w Tabeli 3. Tabela 3 107 EP 1 613 343 B1 Koniugat Przewidywane Produkty Mono A Proinsulina I Insulina i peptyd C sprzężone z Lys-heksylo-PEG7oligomerem Mono B Proinsulina I Insulina i peptyd C sprzężone z LysB29-heksylo-PEG7oligomerem Di Proinsulina I Insulin sprzężona z LysB29 -heksylo-PEG7-oligomerem i peptyd C sprzężony z Lys-heksylo-PEG7-oligomerem Tri Proinsulina I Insulin sprzężona z LysB29 -heksylo-PEG7-oligomerem i Peptyd C sprzężony z Lys-heksylo-PEG7-oligomerem i Peptyd wiodący sprzężony z Lys-heksylo-PEG7-oligomerem Przykład 16 Przygotowanie Insuliny Sprzężonej z LysB29-Oligomerem [0269] (a) Sprzężenie Rekombinowanej Proinsuliny II. Rekombinowaną Proinsulinę II (Masa cząsteczkowa 11,133 Daltonów) otrzymano z Itoham Foods, Inc. of Ibaraki Pref, Japonia. Rekombinowana Proinsulina II miała peptyd wiodący i peptyd C każdy pozbawiony reszt Lizyny. Część rekombinowanej proinsuliny II wynoszącą 2.55 x 10 -3 mmol rozpuszczono w 10 mL DMSO. Do roztworu dodano 355 ?L trietyloaminy. Otrzymany roztwór mieszano przez 5 minut a następnie dodano roztwór aktywowanego glikolu metylopolietylenowego ((PEGn)-heksylo-oligomer) (n = 7 ? 3 lub n = 7) (5.10 x 10-3 mmol) w acetonitrylu. Przebieg reakcji monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną, wygaszono ją przez dodanie 3,7 mL 5% wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 nM Buforu Tris-HCl, pH 7.6 Profil HPLC mieszaniny produktów, rekombinowanej Proinsuliny II sprzężonej z oligomerem jest przedstawiony na Figurze 2. (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu Enzymów Rekombinowanej Proinsuliny II Sprzężonej z Oligomerem. Roztwór Tris-HCl mieszaniny produktu z Przykładu 16(a) analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia w nim stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 108 EP 1 613 343 B1 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów (0.399 ?mol/mL) poddano reakcji z trypsyną (5.57 x 10 -4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (1.82 x 10 -4 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 550 ?L 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC (w odniesieniu do znanych referencyjnych wzorców) i analizy widma masowego. W ten sposób otrzymano Insulinę (23%) i Insulinę Sprzężoną z LysB29-Heksylo-PEG7-Oligomerem (60%) oraz inne (17%) (Figury 9-10). Przykład 17 Izolacja Produktów Sprzężenia Oligomeru z Rekombinowaną Proinsuliną II [0270] Każdy główny produkt z reakcji sprzężenia opisanej w Przykładzie 16(a) wyizolowano przy zastosowaniu HPLC w odwróconym układzie faz. Kolumnę HPLC (1.0 cm średnicy.x25 cm długości) wypełniono komercyjnie dostępną fazą stacjonarną C18, która wiadomo że jest użyteczna do rozdzielenia polipeptydów i białek, a następnie wprowadzono do układu HPLC. Układ ekwilibrowano za pomocą buforu elucyjnego, którą stanowiła mieszanina składająca się z 75% fazy ruchomej A (H2O z 0.1 % kwasem trifluooroctowym) i 25% fazy ruchomej B (acetonitryl z 0,1% kwasem trifluorooctowym), który dostarczono z szybkością przepływu 5 mL/min. Roztwór Tris-HCl mieszaniny produktów z Przykładu 16 (a) naniesiono na kolumnę i główne produkty rozdzielono i eluowano przy zastosowaniu elucji gradientowej, w której kompozycja buforu elucyjnego zmieniła się od 25% ruchomej fazy B do 35% fazy ruchomej B przez 120 minut. Każdą z frakcji, które zebrano analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia identyczności i czystości zawartego w nich produktu. Wspólne frakcje każdego produktu (monokoniugatu Proinsuliny II ("Mono Proinsulina II?) i dikoniugatu (?Di Proinsulina II?) zostały następnie zebrane i rozpuszczalnik usunięto przez rotacyjne odparowanie. Identyczność i czystość każdego produktu wyznaczono za pomocą HPLC i analizy widm masowych (Figury 2-4). Przykład 18 109 EP 1 613 343 B1 Rozcięcie za pomocą Koktajlu Enzymów Wyizolowanych Koniugatów Rekombinowanej Proinsuliny II [0271] Każdy koniugat Proinsuliny II (Mono Di, lub Tri Proinsuliny II), który wyizolowano przy zastosowaniu procedury opisanej w Przykładzie 17 rozpuszczono w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6 i porcję roztworu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia w nim stężenia polipeptydu. Roztwór trypsyny (traktowany TPCK; z trzustki bydlęcej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Koniugat (0.127 ?mol/mL) następnie poddano reakcji z trypsyną (1.77 x 10 -4 mmol) i karboksypeptydazą B (5.77 x10 -5 mmol). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 250 ?L 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Izolacja głównych produktów a następnie identyfikacja za pomocą czasu retencji HPLC w odniesieniu do referencyjnych wzorców i analizy widm masowych wykazały, że w reakcji powstały Insulina lub acylowana w B-29 Insulina-heksylo-PEG7. Produkty i wydajności każdej reakcji są przedstawione w Tabeli 4. Tabela 4 Koniugat Przewidywane Produkty Wydajność Mono Proinsulina II Insulina Di Proinsulina II 15% B29 Insulina sprzężona oligomerem z Lys -heksylo-PEGn- 85% Insulina sprzężona oligomerem z LysB29-heksylo-PEGn- 92% Przykład 19 Rozcięcie Trypsyną Wyizolowanych Koniugatów Proinsuliny II [0272] Każdy koniugat (Mono, Di, lub Tri Proinsuliny II) z Przykładu 17 rozpuszczono w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6 i otrzymany roztwór analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia w nim stężenia polipeptydu. Roztwór trypsyny (traktowany TPCK; z trzustki bydlęcej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Każdy koniugat (0.127 ?mol/mL) następnie poddano reakcji z trypsyną (4.23 x 10 -4 ?mol/mL). Po 20 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 250 ?L 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. 110 EP 1 613 343 B1 Izolacja głównych produktów a następnie identyfikacja za pomocą czasu retencji HPLC i analizy widm masowych wykazały, że w reakcji powstały Insulina(Arg31) lub Insulina(Arg31) sprzężona z LysB29-heksylo-PEGn- oligomerem. Produkty i wydajności każdej z reakcji są przedstawione w Tabeli 5. Tabela 5 Koniugat Produkty (przewidywane produkty) Mono Proinsulina II Insulina -Arg31, (peptyd C-Arg), (Peptyd Wiodący-Arg) insulina-Arg31 oligomerem sprzężona z Wydajność LysB29-heksylo-PEGn- - Di Proinsulina II insulina-Arg31 sprzężona z LysB29-heksylo-PEGn- oligomerem, (peptyd-C-Arg), (Peptyd wiodący-Arg sprzężone z heksylo-PEGn-oligomerem) Przykład 20 Rozcięcie Karboksypeptydazą B Mieszaniny z Rozcięcia Trypsyną [0273] Porcję mieszaniny reakcyjnej Insuliny(Arg31) sprzężonej z LysB29-heksyloPEG7-oligomerem (3.10 x 10-5 mmol) z Przykładu 19 usunięto. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 nM buforze Tris-HCl o pH 7.6. Do mieszaniny reakcyjnej dodano karboksypeptydazę B (1.03 x 10-7). Reakcję pozostawiono do kontynuacji na 15 godzin a następnie wygaszono ją przez dodanie 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Po przetworzeniu produkty reakcji analizowano za pomocą HPLC. Czas retencji i analiza widma masowego zostały wykorzystane do wyznaczenia identyczności. Insulina (23%) i insulina sprzężona z LysB29-heksylo-PEGn-oligomerem (60%) (Figury 5, 7 - 8) zostały utworzone z reakcji monokoniugatu Proinsuliny II. Przewidywane produkty reakcji dikoniugatu Proinsuliny II są przedstawione w Tabeli 6. Tabela 6 Koniugat Produkty (Przewidywane produkty) Mono Proinsulina II Insulina i 23% Insulina sprzężona z Lys oligomerem Di Proinsulina II (Insulina Wydajność sprzężona z B29 -heksylo-PEGn- 60% LysB29-Heksylo-PEGn111 EP 1 613 343 B1 Koniugat Produkty (Przewidywane produkty) Wydajność oligomerem) Przykład 21 Przygotowanie Insuliny Sprzężonej z LysB29-Oligomerem [0274] (a) Sprzężenie Naturalnej Ludzkiej Proinsuliny. Naturalną ludzką proinsulinę (Sigma Chemical Co.) (3.20 x 10 -4 mmol) rozpuszczono w 5 mL DMSO. Do roztworu dodano 45 ?L trietyloaminy. Roztwór mieszano przez 5 minut zanim dodano aktywowany PEG-7-heksylo-oligomer (6.4 x 10-4 mmol) w acetonitrylu. Po rozwoju reakcji tak, że analiza HPLC wskazała, że proinsulina została zużyta (lub stężenie proinsuliny dłużej nie zmniejszało się) reakcję wygaszono przez dodanie 0,5 mL 5% wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 mM Bufor Tris-HCl, pH 7.6. (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu enzymów Naturalnej Proinsuliny Sprzężonej z Oligomerem. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu z Przykładu 21(a) analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia w nim stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Surową mieszaninę (1 mol ekwiw.) następnie poddano reakcji z trypsyną (1.39 x 10 -3 mol ekwiw.) i karboksypeptydazą B (4.56 x 10-4 mol ekwiw.). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Mieszaninę produktów reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Czas retencji (w odniesieniu do referencyjnych wzorców) i analizę widm masowych zastosowano w celu wyznaczenia identyczności. Przewidywanymi produktami reakcji są Insulina i Insulina Przykład 22 Izolacja Produktów Sprzężenia Naturalnej Ludzkiej Proinsuliny [0275] Każdy główny produkt otrzymany z reakcji sprzężenia opisanej w 112 EP 1 613 343 B1 Przykładzie 21(a) wyizolowano przy zastosowaniu HPLC w odwróconym układzie faz. Kolumnę HPLC (1.0 cm średnicy.x25 cm długości) wypełniono komercyjnie dostępną fazą stacjonarną C18, która wiadomo że jest użyteczna do rozdzielenia polipeptydów i białek, a następnie wprowadzono do układu HPLC. Układ ekwilibrowano za pomocą buforu elucyjnego, którą stanowiła mieszanina składająca się z 75% fazy ruchomej A (H2O z 0.1 % kwasem trifluooroctowym) i 25% fazy ruchomej B (acetonitryl z 0,1% kwasem trifluorooctowym). Roztwór Tris-HCl mieszaniny produktów z Przykładu 21 (a) naniesiono na kolumnę i główne produkty rozdzielono i eluowano przy zastosowaniu elucji gradientowej, w której procent komponentu acetonitrylowego zwiększano od 25% -35% w ciągu 120 minut. Frakcje zebrano i analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia identyczności i czystości zawartego w nich produktu. Wspólne frakcje każdego produktu zebrano i rozpuszczalnik usunięto przez rotacyjne odparowanie. Identyczność i czystość każdego piku produktu wyznaczono za pomocą HPLC i spektrometrii masowej. Przewidywane produkty składają się z 2 monokoniugatów ludzkiej Proinsuliny (Lys B29 lub Lys 64), 1 dikoniugatu ludzkiej Proinsuliny (Lys B29, Lys 64) i 1 trikoniugatu ludzkiej Proinsuliny (Phe B1, Lys B29, Lys 64). Zastosowanie zmodyfikowanych warunków sprzężenia zgodnie z Przykładem 21 skutkuje monokoniugatami ludzkiej Proinsuliny (Phe B1 lub Lys B29 lub Lys 64). Przykład 23 Rozcięcie za pomocą Koktajlu Enzymów Wyizolowanych Koniugatów Naturalnej Ludzkiej Proinsuliny [0276] Każdy koniugat , który otrzymano przy zastosowaniu procedury opisanej w Przykładzie 22 rozpuszczono w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6 i otrzymany roztwór analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia w nim stężenia polipeptydu. Roztwór trypsyny (traktowany TPCK; z trzustki bydlęcej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Surową mieszaninę (1 mol ekwiw.) następnie poddano reakcji z trypsyną (1.39 x 10-3 mol ekwiw.) i karboksypeptydazą B (4.56 x10 -4 mol ekwiw.). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1% kwasu trifluorooctowego w 113 EP 1 613 343 B1 acetonitrylu. Mieszaninę produktów reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Czas retencji (w odniesieniu do referencyjnych wzorców) i analiza widm masowych zastosowano w celu wyznaczenia identyczności. Przewidywanymi produktami reakcji są Insulina i Insulina sprzężona z LysB29heksylo-PEG7-oligomerem lub insulina sprzężona z PheB1-Di [Heksylo-PEG7Oligomerem] lub peptyd C sprzężony z Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem lub Insulina lub LysB29 lub peptyd C sprzężone z PheB1-heksylo-PEG7-oligomerem. Przykład 24 Rozcięcie Trypsyną Wyizolowanych Koniugatów Naturalnej Ludzkiej Proinsuliny [0277] Każdy koniugat , który otrzymano zgodnie z tym jak opisano w Przykładzie 22 rozpuszczono w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6 i otrzymany roztwór analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia w nim stężenia polipeptydu. Roztwór trypsyny (traktowany TPCK; z trzustki bydlęcej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Koniugat (300 mol ekwiw.) następnie poddano reakcji z trypsyną (1 mol ekwiw.). Po 20 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Produkty przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Czas retencji i spektrometrię masową zastosowano do wyznaczenia identyczności. Przewidywanymi produktami reakcji są Insulina(Arg31) lub desThr-Insulina lub Insulina(Arg31) sprzężona z LysB29-heksylo-PEG7-oligomerem lub Insulina-Arg31 sprzężona z LysB29, PheB1-Di [Heksylo-PEG7-Oligomerem] lub Insulina-Arg31 sprzężona z PheB1- heksylo-PEG7-oligomerem lub peptyd C sprzężony z Lys64-heksyloPEG7-oligomerem lub peptyd C-Arg. Przykład 25 Rozcięcie Karboksypeptydazą B Mieszaniny z Rozcięcia Trypsyną [0278] Porcję mieszaniny reakcji z trypsyną każdego koniugatu (300 mmol) z Przykładu 24 usunięto. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 nM buforze Tris-HCl o pH 7.6. Do mieszaniny reakcyjnej dodano karboksypeptydazę B (1 mmol). Reakcję pozostawiono do kontynuacji na 15 godzin a następnie wygaszono ją przez dodanie 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Produkty reakcji przetworzono i analizowano 114 EP 1 613 343 B1 za pomocą HPLC. Czas retencji i analiza widma masowego wykorzystana w celu wyznaczenia identyczności. Przewidywanymi produktami są Insulina lub desThr-Insulina lub Insulina sprzężona z LysB29-heksylo-PEG7-oligomerem lub Insulina sprzężona z PheB1 - heksylo-PEG7-oligomerem lub Insulina sprzężona z LysB29, PheB1-Di[Heksylo-PEG7-Oligomerem] lub peptyd C sprzężony z Lys64heksylo-PEG7-oligomerem lub peptyd C. Przykład 26 Zoptymalizowane Przygotowanie Insuliny Sprzężonej z LysB29-Oligomerem [0279] Analiza danych doświadczalnych z Przykładu 11 wskazała, że Insulina sprzężona z LysB29-heksylo-PEG7-oligomerem i peptyd C sprzężony z Lysheksylo-PEG7-oligomerem mogą być otrzymane z wysoką wydajnością i czystością przez (a) acylowanie grupy ?-aminowej wszystkich reszt lizyny, które występują na proinsulinie, i (b) rozcięcie otrzymanej w pełni sprzężonej z oligomerem proinsuliny za pomocą koktajlu enzymów składającego się z trypsyny i karboksypeptydazy B. Doświadczalne potwierdzenie tej hipotezy otrzymano w następujący sposób: (a) Sprzężenie Rekombinowanej Proinsuliny I. Rekombinowaną Proinsulinę I (Masa cząsteczkowa 10,642 Daltonów) otrzymano z Biobras, Belo Horizonte, Brazylia. Część proinsuliny I wynoszącą 2.32 x 10-3 mmol rozpuszczono w 10 mL DMSO. Do roztworu dodano 324 ?L trietyloaminy. Otrzymany roztwór mieszano przez 5 minut a następnie dodano roztwór aktywowanego glikolu metyloheptaetylenowego(PEG7)heksylo-oligomeru (4-6 mol ekwiw.; wystarczająco do przekształcenia całej Proinsuliny I do trikoniugatu) w acetonitrylu. Przebieg reakcji sprzężenia (acylacji) monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną (tj. nie obserwowano za pomocą HPLC żadnej niesprzężonej Proinsuliny I) wygaszono ją przez dodanie 3.54 mL 5% wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6. Przewidywano, że profil HPLC mieszaniny produktów, rekombinowanej Proinsuliny I sprzężonej z oligomerem, wykaże piki odpowiadające tylko trikoniugatowi (wszystkie sprzężone z Lys i N115 EP 1 613 343 B1 końcu) i dikoniugatowi. (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu enzymów Rekombinowanej Proinsuliny I Sprzężonej z Oligomerem. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu z Przykładu 16(a) analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia w nim stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów z Przykładu 16(a) (0.424 ?mol/mL) następnie poddano reakcji z trypsyną (5.97 x 10 -4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (1.93 x 10 -4 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1.58 mL 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC (w odniesieniu do czasów retencji znanych referencyjnych wzorców) i analizy widm masowych. Przewiduje się, że Insulina sprzężona z LysB29-Heksylo-PEG7-Oligomerem, jedyny koniugat insuliny, który jest obecny, zostanie otrzymany z prawie 95% wydajnością. Peptyd C sprzężony z Lys1-Heksylo-PEG7-Oligomerem jest także otrzymywany z prawie ilościową wydajnością. Przykład 27 Przygotowanie Insuliny Sprzężonej z LysB29-Oligomerem ?20 g powiększenie skali [0280] (a) Sprzężenie Rekombinowanej Proinsuliny I. Rekombinowaną Proinsulinę I (Masa cząsteczkowa 10,642 Daltonów) otrzymano z Biobras, Belo Horizonte, Brazylia. Część proinsuliny I wynoszącą 20g (1.85 mmol) rozpuszczono w 540 mL 50 mM kwasu borowego. Roztwór doprowadzono do pH 9.3 za pomocą 4N roztworu wodorotlenku sodu i dodano do 120 mL etanolu i doprowadzono do pH 10.2 za pomocą wodorotlenku sodu. Do powyższego zmieszanego roztworu dodano roztwór aktywowanego glikolu metyloheptaetylenowego (PEG7)-heksylooligomeru (4x1.85 mmol) w 14 mL etanolu. Przebieg reakcji sprzężenia (acylacji) monitorowano za pomocą HPLC i pH utrzymywano 10.2 za 116 EP 1 613 343 B1 pomocą 4N wodorotlenek sodu. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną po 20 minutach chlorowodorowego wygaszono do pH ją 6.8. przez Mieszaninę dodanie 4N reakcyjną kwasu następnie przetworzono i wymieniono do 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6 przez diafiltrację przy zastosowaniu układu Millipore's Pellicon II. Profil HPLC mieszaniny produktów wykazał >80% di i trikoniugatów rekombinowanej Proinsuliny I i oligomeru. (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu enzymów Rekombinowanej Proinsuliny I Sprzężonej z Oligomerem. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu i rozcieńczono do 15 mg/ml ekwiwalentu insuliny. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów (2.64 mmol) następnie poddano reakcji z trypsyną (3.68 x 10-3 mmol) i karboksypeptydazą B (1.20 x 10 -3 mmol) w 15°C . Po 55 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 4N kwasu chlorowodorowego do pH~3. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC (w odniesieniu do czasów retencji znanych referencyjnych wzorców) i analizy widm masowych. W ten sposób otrzymano Insulinę sprzężoną z LysB29-Heksylo-PEG7-Oligomerem (80%) i insulinę (7%). Peptyd C sprzężony z Lys64-Heksylo-PEG7Oligomerem otrzymano jako główny produkt uboczny z części peptydu C koniugatów proinsuliny I. (c) Izolacja Produktów Rozcięcia za pomocą Koktajlu Enzymów Koniugatu Rekombinowanej Proinsuliny I i Oligomeru. [0281] ] HPLC w odwróconym układzie faz zastosowano do wyizolowania głównych produktów z mieszaniny produktów otrzymanej z reakcji sprzężenia. Kolumnę HPLC (1.0 cm średnicy x25 cm długości) wypełniono komercyjnie dostępną fazą stacjonarną C18, która wiadomo że jest użyteczna do rozdzielenia peptydów i białek, a następnie wprowadzono do układu HPLC. Układ ekwilibrowano za pomocą buforu elucyjnego, mieszaniny zawierającej 117 EP 1 613 343 B1 80% fazy ruchomej A ( 10mM bufor octanu amonu) i 20% fazy ruchomej B (acetonitryl) który dostarczono z szybkością przepływu 120 mL/min. Roztwór mieszaniny produktów w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6, naniesiono na kolumnę w odwróconym układzie faz i produkty rozdzielono i eluowano przy zastosowaniu gradientu, w którym komponent acetonitrylowy buforu elucyjnego (faza ruchoma B) zwiększano w następujący sposób: 20%-27% faza ruchoma B przez 30 minut, następnie 27%-29% faza ruchoma B przez 30 minut, następnie 29%-32% faza ruchoma B przez 12 minut, następnie 32%-35% faza ruchoma B przez 6 minut, następnie 35%-45% faza ruchoma B przez 13 minut. [0282] Frakcje zebrano i oddzielnie analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia identyczności i czystości zawartego w nich produktu. Wspólne frakcje zawierające jeden z trzech produktów (Insulinę sprzężoną z LysB29Heksylo-PEG7-Oligomerem ("PEG7 HIM2")), Insulinę ("Insulina") i peptyd C sprzężony z Lys64-Heksylo-PEG7-Oligomerem ("PEG7 Lys-peptyd -C") następnie zebrano, każdy zestaw rozcieńczono do 10% acetonitrylu za pomocą wody i następnie przetworzono, wymieniono do 10 mM Bufor Octanu Amonu, pH 7.4 i zatężono przez diafiltrację wykorzystując układ Millipore's Pellicon II. Stężone roztwory PEG7 HIM2 i PEG7-Lys peptydu C liofilizowano w liofilizatorze do białych proszków PEG7 HIM2 (4.86g ekwiwalent insuliny) i PEG7-Lys peptydu C (3.7g). HPLC i analizę widm masowych wykorzystano w celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego izolatu. Próbkę liofilizowanego materiału PEG7 HIM2 dodatkowo charakteryzowano za pomocą dodatkowych testów, mapowania peptydów i biopotencji (za pomocą analizy poziomu glukozy w mysiej krwi (MBGA)) i porównano z tymi insuliny USP i PEG7 HIM2 otrzymanej przez sprzężenie przy zastosowaniu insuliny USP. Przykład 28 Mapowanie Peptydów, Porównywalność chemiczna i potencji Insuliny PEG7 HIM2 sprzężonej z LysB29-PEG7-heksylo-Oligomerem wytworzonej z Proinsuliny w stosunku do PEG7 HIM2 wytworzonego z Insuliny 118 EP 1 613 343 B1 A. Sposób Mapowania Peptydów Mapowanie Peptydów za Pomocą Trawienia Endoproteinazą Gluc-C (Proteaza Staphylococcus aureus V8) [0283] Procedura opiera się na sposobie opisanym w monografii USP dla ludzkiej insuliny. Przygotowanie Próbki: [0284] Roztwory insuliny i koniugatu insuliny mające stężenie ~ 0.5 mg/mL przygotowano przy zastosowaniu 100mM buforu HEPES, pH 7,5 jako rozcieńczalnika. Roztwory analizowano za pomocą sposobu HPLC do analizy Insuliny i PEG7 HIM2 w celu wyznaczenia stężenia w odniesieniu do Wzorcowej Insuliny. Roztwory przechowywano w +5 °C. Roztwór endoproteinazy Glu-C (z Staphylococcus aureus V8) o stężeniu 2mg/mL przygotowano w wodzie. Analiza Testowa: [0285] 0.375 mL roztworu umieszczono w fiolce, dodano 30 ?L roztworu endoproteinazy Glu-C, fiolkę zamknięto i uszczelniono, następnie inkubowano w 25 °C (z wytrząsaniem łaźni wodnej) przez około 4 godziny. Dodano 405 ?L roztworu 50:50 (obj./obj.) 2.0 M siarczanu amonu/0.5 M kwasu siarkowego do fiolki w celu wygaszenia reakcji. Próbkę zamrożono. Analiza: [0286] Próbki podstawowe analizowano za pomocą sposobu HPLC do analizy PEG7 HIM2 i insuliny. Wszystkie strawione próbki analizowano za pomocą sposobu HPLC V8MAP1 (poniżej). Kolumna: Kolumna Waters DeltaPak C18, 150 mm długości x 3.9 mm średnicy; rozmiar cząstek 5 ?m, faza stacjonarna o wielkości porów 300 ? Temperatura kolumny: +40 °C Długość fali do detekcji: 220 nm Faza ruchoma A: 10% (obj/obj) metanol w wodzie zawierającej 0.1% TFA Faza ruchoma B: 10% (obj/obj) metanol w acetonitrylu zawierającym 0.1% TFA Szybkość przepływu: 1 mL/min. 119 EP 1 613 343 B1 Gradient: Czas (Minuty) % Fazy ruchomej A % Fazy Ruchomej B 0 89 11 70 67 37 73 89 11 75 89 11 TABELA 7 Główne Fragmenty Otrzymane przez trawienie Endoproteinazą Glu-C próbek Ludzkiej Insuliny, USP i PEG7 HIM2 utworzonych z Insuliny i Proinsuliny I Fragment Ludzka Insulina PEG7 Wytworzone insuliny 2970 2970 2970 1379 1379 1378 1116 Nie obecne Nie obecne [B22-B30] Nie obecne 1554 (Uwaga 2 i 3) 1553 (Uwaga 2 i 3) [A1-A4] 416 416 416 Nr Struktura 1 [A5-A17 B1-B13] + 2 [A18-A21 B14-B21] + 3 3' (Uwaga 1) 4 HIM2, PEG7 HIM2, z Wytworzone z Proinsuliny I Uwagi do Tabeli 7 Uwaga 1: Fragment 3' dotyczy piku obserwowanego na mapie peptydowej PEG7 HIM, który jest inny niż fragment 3 ludzkiej insuliny. Uwaga 2: Chromatogram HPLC przedstawia inny czas retencji dla tego fragmentu sugerując, że fragment został zmodyfikowany przez heksylo-oligomer. Widmo masowe, które przedstawia pseudo-cząsteczkowy jon mający m/z (?masę?) wynoszącą 1554 jednostek masy atomowej (amu) potwierdza strukturę tego fragmentu jako [B22-B30 + heksylo-oligomer o pojedynczej masie cząsteczkowej]. Uwaga 3: Chromatogram HPLC przedstawia inny czas retencji dla tego fragment sugerując, że fragment został zmodyfikowany przez heksylo-oligomer. Widmo masowe, które przedstawia jon mający m/z wynoszącą 1554, potwierdza strukturę tego fragmentu jako [B22-B30 + heksylo-oligomer o pojedynczej masie cząsteczkowej]. [0287] Figury 17a i 17b przedstawiają profil HPLC trawienia peptydazą Glu-C (VX proteaza) koniugatu Insuliny i LysB29-PEG7-heksylo-Oligomeru (PEG7 HIM2). Pik zidentyfikowany jako ?unk? jest nieznanym fragmentem, który jest wyraźnie nieistotnym produktem ubocznym utworzonym w warunkach trawienia 120 EP 1 613 343 B1 enzymem. Niezidentyfikowany fragment także występuje w chromatogramach dla HIM2, ale nie jest zidentyfikowany za pomocą nazwy. B. Chemiczna Porównywalność: [0288] Badania kontrolne PEG7 HIM2 z Insuliny USP PEG7 HIM2 Proinsuliny I Wygląd (Wizualny) Biały proszek z Pre- Biały proszek Identyczność: Masa cząsteczkowa (za 6245.2 (M+1) pomocą MALDI/MS) 6244 (M+1) HPLC Zgodne Zgodne Mapowanie peptydowe Zgodne Zgodne Czystość (HPLC) 96.1% 99.3% Powiązane (HPLC) substancje 3.9% 0.7% Zawartość białka (HPLC) 95.9% wag./wag. (RH=23%) 78.6 % (RH=nd) Wilgotność (Karl Fisher) 5.7% wag./wag. wag./wag. 8.7% wag./wag. Octan (Chromatografia 0.13% wag./wag. Jonowa) 2.6% wag./wag. Resztkowe rozpuszczalniki (GC-MS) ACN 6.2 ppm Etanol 4.3 ppm ACN 257ppm Jon amonowy 0.4% wag./wag. (Chromatografia Jonowa 0.52% wag./wag. nd: nie wyznaczone C. Sposób Badania Biopotencji: MBGA [0289] Rozszerzona Analiza Poziomu Glukozy we Krwi Mysiej (MBGA). Sześć grup sparowanych pod względem dawki 5 samców myszy CF-1 (Charles River Laboratories; 25-30 g) otrzymało podskórne wstrzyknięcia albo koniugatu insuliny (przedmiot badany) albo rekombinowanej ludzkiej insuliny. Badany przedmiot odtworzono za pomocą dejonizowanej wody i dawkowano w ilości 100, 66.6, 43.3, 30, 20, i 13.3 ?g/kg. Insulinę odtworzono za pomocą dejonizowanej wody i dawkowano w ilościach 50, 33.3, 21.7, 15, 10, i 6.7 ?g/kg. Po otrzymaniu podskórnej dawki w kieszeń utworzoną przez udo i pachwinę; zwierzęta wróciły do swoich klatek na 30 minut w temperaturze pokojowej a 121 EP 1 613 343 B1 następnie szybko jest znieczulono i ostatecznie poddano wykrwawieniu. Próbki krwi zebrano do probówek z heparyną do analizy poziomu glukozy. Jeśli analiza poziomu glukozy opóźniła się, probówki przechowywano w lodowatej wodzie i ponownie ogrzano do temperatury pokojowej przed analizą. [0290] Poziom glukozy w osoczu zmierzono za pomocą glukometru (np., One Touch? Basic; Lifescan), który skalibrowano na początku każdego dnia zastosowania zgodnie z instrukcjami producenta. Potencję koniugatu insuliny następnie obliczono w odniesieniu do krzywej wzorcowej, którą wytworzono dla odpowiedzi na rekombinowaną ludzką insulinę. Obliczenia opierały się na założeniu, że rekombinowana ludzka insulina ma potencję wynoszącą 27.4 IU/mg. [0291] Figury 18a & b i 19a & b przedstawiają profile biopotencji wyznaczonej za pomocą MBGA Insuliny i Insuliny PEG7 HIM2. Badania Kontrolne PEG7 HIM2 z Insuliny USP PEG7 HIM2 z Pre-Proinsuliny I Biopotencja wyznaczona pomocą MBGA 76-94% 84% za Przykład 29 Przygotowanie Insuliny Sprzężonej z LysB29-Oligomerem i Insuliny Sprzężonej z LysB29, PheB1-Di (Oligomerem) jak opisano w Przykładzie 21 [0292] (a) Sprzężenie Naturalnej Ludzkiej Proinsuliny. Naturalną ludzką proinsulinę (Sigma Chemical Co.) (3.20 x 10 -4 mmol) rozpuszczono w 5 mL DMSO. Do roztworu dodano 45 ?L trietyloaminy. Roztwór mieszano przez 5 minut zanim dodano aktywowany PEG-7-heksylo-oligomer (6.4 x 10-4 mmol) w acetonitrylu. Po rozwoju reakcji tak, że analiza HPLC wskazała, że proinsulina została zużyta (lub stężenie proinsuliny dłużej nie zmniejszało się) reakcję wygaszono przez dodanie 0.5 mL 5% wodnego roztworu kwasu trifluorooctowego. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6. (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu enzymów Naturalnej Proinsuliny 122 EP 1 613 343 B1 Sprzężonej z Oligomerem. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Surową mieszaninę (1 mol ekwiw.) następnie poddano reakcji z trypsyną (1.39 x 10-3 mol.ekwiw.) i karboksypeptydazą B (4.56 x 10 -4 mol.ekwiw.). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Mieszaninę produktów reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Czas retencji (w odniesieniu do referencyjnych wzorców) i analizę widma masowego wykorzystano w celu wyznaczenia identyczności. Produktami i przewidywanymi produktami reakcji była Insulina, Insulina sprzężona z LysB29-heksylo-PEG7-oligomerem, insulina sprzężona z PheB1,LysB29 Di (heksylo-PEG7-oligomerem) i peptyd C sprzężony z Lysheksylo-PEG7-oligomerem (Tabela 8) Tabela 8 Koniugaty surowej mieszaninie w Produkty i (Przewidywane Produkty) Masa cząsteczkowa wyznaczona za pomocą spektrometrii masowej Mono A Naturalna Insulina 5009 (M+1) Proinsulina Des Thr insulina (Proinsulina sprzężona z Lys64) (peptyd C sprzężony z Lys64-heksyloPEG7-oligomerem), Mono B Naturalna Proinsulina III (proinsulina sprzężona z Lys29) (Insulina Diarginal, Insulina Monoarginal), (peptyd C sprzężony z Arg65Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem), (Des Arg 31, 32 proinsulina) i (Des 65, 64 proinsulina) Di Naturalna Insulina sprzężona Proinsulina PEG7-oligomerem, (Proinsulina Peptyd C sprzężona z LysB29 i Lys64) z Lys-heksylo- 6244 (M+1) (Figura 28) Tri Proinsulina III (proinsulina sprzężona z Des Arg 31, 32 B29 (Proinsulina Lys -heksylo-PEG7-oligomerem), B29 sprzężona z Lys , (proinsulina sprzężona z Des 65, 64 Lys B29 64 Lys 64 i PheB1) -heksylo-PEG7-oligomerem -), 31 (peptyd C sprzężony z Arg ,32 Lys64123 EP 1 613 343 B1 Koniugaty surowej mieszaninie w Produkty i (Przewidywane Produkty) Masa cząsteczkowa wyznaczona za pomocą spektrometrii masowej heksylo-PEG7-oligomerem) i (peptyd C sprzężony z Arg32 Lys64-heksylo-PEG7oligomerem) Insulina sprzężona z PheB1, LysB29 Di 6682 (M+1)(figura 29) [Heksylo-PEG7-Oligomerem]-, peptyd C sprzężony z Lys64-heksylo-PEG7oligomerem (Insulina-Arg31-Arg32 sprzężona z Lys B29 -heksylo-PEG7-oligomerem), (Proinsulina sprzężona z Des 65 Lys 64 Lys B29-Phe B1-Tri (heksylo-PEG7oligomerem), (proinsulina sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys 64Lys B29, Phe B1Tri(heksylo-PEG7-oligomerem), (peptyd C sprzężony z Arg31,32 Lys64heksylo-PEG7-oligomerem 64) i (peptyd C sprzężony z Arg32 Lys64-heksyloPEG7-oligomerem) Przykład 30 Przygotowanie Monorozproszonego Koniugatu Insuliny z LysB29- Oligomerem [0293] (a) Sprzężenie Rekombinowanej Proinsuliny II. Rekombinowaną Proinsulinę II (Masa cząsteczkowa 11,133 Daltonów) otrzymano z Itoham Foods, Inc. of Ibaraki Pref, Japonia. Rekombinowana Proinsulina II miała peptyd wiodący i peptyd C każdy pozbawiony reszt Lizyny. Część rekombinowanej proinsuliny II wynoszącą 2.55 x 10 -3 mmol rozpuszczono w 10 mL DMSO. Do roztworu dodano 355 ?L trietyloaminy. Otrzymany roztwór mieszano przez 5 minut a następnie dodano aktywowanego ((PEG7)-heksylo- glikolu metylopolietylenowego roztwór oligomeru) (5.10 x 10-3 mmol) w 0.6 mL acetonitrylu. Przebieg reakcji monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną, wygaszono ją przez dodanie 3,7 mL 5% wodnego roztworu kwasu 124 EP 1 613 343 B1 trifluorooctowego. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 nM Buforu Tris-HCl, pH 7.6 P (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu enzymów Rekombinowanej Proinsuliny II Sprzężonej z Oligomerem. Roztwór Tris-HCl mieszaniny produktu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia w nim stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów (0.399 ?mol/mL) poddano reakcji z trypsyną (5.57 x 10 -4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (1.82 x 10-4 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 550 ?L 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC (w odniesieniu do znanych referencyjnych wzorców) i analizy widma masowego. W ten sposób otrzymano Insulinę (8%) i Insulinę Sprzężoną z LysB29-HeksyloPEG7-Oligomerem (60%) oraz inne (30%). Przykład 31 Izolacja Produktów Sprzężenia Rekombinowanej Proinsuliny II z Oligomerem [0294] Każdy główny produkt z reakcji sprzężenia opisanej w Przykładzie 30(a) wyizolowano przy zastosowaniu HPLC w odwróconym układzie faz. Kolumnę (1.0 cm średnicy x25 cm długości) wypełniono komercyjnie dostępną fazą stacjonarną C18, która wiadomo że jest użyteczna do rozdzielenia polipeptydów i białek, a następnie wprowadzono do układu HPLC. Układ ekwilibrowano za pomocą buforu elucyjnego, który stanowiła mieszanina składająca się z 75% fazy ruchomej A (H2O z 0.1 % kwasem trifluooroctowym) i 25% fazy ruchomej B (acetonitryl z 0,1% kwasem trifluorooctowym), który dostarczono z szybkością przepływu 5 mL/min. Roztwór Tris-HCl mieszaniny produktów z Przykładu 30 (a) naniesiono na kolumnę i główne produkty rozdzielono i eluowano przy zastosowaniu elucji gradientowej, w której kompozycja buforu elucyjnego zmieniła się od 25% ruchomej fazy B do 35% fazy ruchomej B przez 120 minut. Każdą z frakcji, które zebrano analizowano za pomocą HPLC w celu 125 EP 1 613 343 B1 wyznaczenia identyczności i czystości zawartego w nich produktu. Powszechne frakcje każdego produktu (monokoniugatu Proinsuliny II ("Mono Proinsulina II?) i dikoniugatu (?Di Proinsulina II?) zostały następnie zebrane i rozpuszczalnik usunięto przez rotacyjne odparowanie. Identyczność i czystość każdego produktu wyznaczono za pomocą HPLC i analizy widm masowych. Przykład 32 Rozcięcie za pomocą Koktajlu Enzymów Wyizolowanych Koniugatów Rekombinowanej Proinsuliny II [0295] Każdy koniugat proinsuliny II (Mono A, Di, lub Tri Proinsulina II), który wyizolowano przy zastosowaniu procedury opisanej w Przykładzie 30 rozpuszczono w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6 i porcję roztworu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu otrzymanego roztworu. Roztwór trypsyny (traktowany TPCK; z trzustki bydlęcej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Koniugat (0.127 ?mol/mL) następnie poddano reakcji z trypsyną (1.77 x 10 -1 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (5.77 x 10 -5 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 250 ?L 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Izolacja głównych produktów a następnie identyfikacja za pomocą czasu retencji HPLC w odniesieniu do referencyjnych wzorców i analiza widm masowych wykazały, że w reakcji zostały wytworzone Insulina, B-29 acylowana Insulina-heksylo-PEG7 i N-amino-acylowany sztuczny peptyd C. Produkty i wydajności każdej reakcji są przedstawione w Tabeli 9 monorozproszonych koniugatów. Tabela 9 mono-rozproszone Koniugat Produkty Mono Proinsulina II Insulina (Masa cząsteczkowa 5808) Wydajność 8% (Figura 30) Insulina sprzężona z LysB29-heksylo- 90% (Figura 31) PEG7-oligomerem (Masa cząsteczkowa 6244) Sztuczny peptyd C sprzężony z NHeksylo-PEG7-oligomerem Di Proinsulina II Insulina sprzężona z LysB29-heksyly- 92% (Figura 32) PEG7-oligomerem (Masa cząsteczkowa 126 EP 1 613 343 B1 Koniugat Produkty Wydajność 6244) Przykład 33 Przygotowanie Insuliny Sprzężonej z LysB29-Oligomerem [0296] (a) Sprzężenie Rekombinowanej Proinsuliny III. Rekombinowaną Proinsulinę III (9990 Daltonów) otrzymano z innego źródła (Chung Kun Dang Corporation (CKD)). Zobacz Amerykański Patent Nr 5,952,461, którego cała zawartość jest wprowadzona do niniejszego zgłoszenia przez odniesienie do wskazówek do przygotowania proinsuliny. Zobacz także następujące Amerykańskie patenty, których zawartości są wprowadzone do niniejszego zgłoszenia dla wskazówek wytwarzania proinsuliny i różnych analogów proinsuliny i peptydu C: Amerykański Patent Nr 6,348,327, Amerykański Patent Nr 5,962,267, Amerykański Patent Nr 5,952,461, Amerykański Patent Nr 5,840,542, Amerykański Patent Nr 5,473,049, Amerykański Patent Nr 5,460,954, Amerykański Patent Nr 5,304,473, Amerykański Patent Nr 5,130,236, Amerykański Patent Nr 4,792,602, Amerykański Patent Nr 4,764,592, Amerykański Patent Nr 4,654,324, Amerykański Patent Nr 4,652,548, Amerykański Patent Nr 4,652,547, Amerykański Patent Nr 4,616,078, Amerykański Patent Nr 4,431,740, Amerykański Patent Nr 4,327,072, i Amerykański Patent Nr 3,953,418. Porcję proinsuliny III wynoszącą 2.32 x 10-3 rozpuszczono w 10 mL buforu boranowego (100mM, pH 9.5). Do otrzymanego roztworu dodano roztwór aktywowanego glikolu metyloheptaetylenowego ((PEG7)- heksylo-oligomeru) (9.30 x 10-3 mmol) w 3-6 mL acetonitrylu. Przebieg reakcji sprzężenia (acylacji) monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wydawała się być zakończona, wygaszono ją przez doprowadzenie pH roztworu do pH <6 za pomocą rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6. 127 EP 1 613 343 B1 (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu enzymów Rekombinowanej Proinsuliny III Sprzężonej z Oligomerem. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów (0.424 ?mol/mL) następnie poddano reakcji z trypsyną (5.97 x 10 -4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (1.93 x 10 -4 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1.58 mL 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC (w odniesieniu do czasów retencji znanych referencyjnych wzorców) i analizy widm masowych. W ten sposób otrzymano Insulinę i Insulinę sprzężoną z LysB29-heksylo-PEG7-oligomerem. Mieszaninę produktów z reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widm masowych wykorzystano w celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu (Tabela 10). Tabela 10 Koniugaty Oligomeru i Proinsuliny III i Produktów (lub Przewidywanych Produktów) z Rozcięcia Każdego za pomocą Koktajlu Enzymów Koniugat Spodziewane Produkty Mono A Proinsulina III Insulina, (Proinsulina III sprzężona Peptyd C sprzężony z Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem, w Lys 64) Insulina Diarginal, Insulina Monoarginal, peptyd C sprzężony z Arg65Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem, Des Arg 31, 32 proinsulina, Des 65, 64 proinsulina,Arg-Peptyd Wiodący i Peptyd Wiodący Mono B Proinsulina III Insulina sprzężona z Lys B29-Heksylo-PEG7-oligomerem, (proinsulina III sprzężona peptyd C w B29) Proinsulina lub proinsulina III sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys B29-heksylo-PEG7-oligomerem, Proinsulina lub proinsulina III sprzężona z Des 65, 64 Lys B29-heksyloPEG7-oligomerem, peptyd C sprzężony z Arg31,32 Lys64heksylo-PEG7-oligomerem, peptyd C sprzężony z Arg32 Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem Arg-peptyd wiodący i 128 EP 1 613 343 B1 Koniugaty Oligomeru i Proinsuliny III i Produktów (lub Przewidywanych Produktów) z Rozcięcia Każdego za pomocą Koktajlu Enzymów Koniugat Spodziewane Produkty Peptyd Wiodący Di Proinsulina III Insulina sprzężona z LysB29-Heksylo-PEG7-Oligomerem, (proinsulina III sprzężona peptyd C sprzężony z Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem, w B29 i Lys 64) proinsulina lub proinsulina III sprzężona z Des 65 Lys 64 Lys B29-Di(heksylo-PEG7-oligomerem), proinsulina lub proinsulina III sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys 64 Lys B29Di(heksylo-PEG7-oligomerem), peptyd C sprzężony z Arg31,32 Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem, peptyd C sprzężony z Arg32 Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem, Argpeptyd Wiodący i peptyd Wiodący Tri Proinsulina III (proinsulina III sprzężona w B29, Lys 64 i Naminowym końcu peptydu Wiodącego) Insulina sprzężona z LysB29-Heksylo-PEG7-Oligomerem, peptyd C sprzężony z Lys-heksylo-PEG7-oligomerem, Insulina-Arg31-Arg32 sprzężona z Lys B29-heksylo-PEG7oligomerem, proinsulina lub proinsulina III sprzężona z Des 65 Lys 64Lys B2 -Di (heksylo-PEG7-oligomerem), proinsulina lub proinsulina III sprzężona z Des Arg 31, 32 Lys 64Lys B29-Di(heksylo-PEG7-oligomerem), peptyd C sprzężony z Arg31,32 Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem, peptyd C sprzężony z Arg32 Lys64-heksylo-PEG7oligomerem, Peptyd wiodący-Arg i Heksylo-PEG7oligomer sprzężone z Heksylo-PEG7-oligomerem Przykład 34 Przygotowanie desThr Insuliny sprzężonej z LysB29-Oligomerem z jednołańcuchowego prekursora desThr insuliny [0297] (a) Sprzężenie desThr miniproinsuliny. Otrzymano rekombinowany jednołańcuchowy prekursor desThr insuliny (desThr miniproinsulina) (Masa cząsteczkowa 5688 Daltonów). (Wockhardt). W 5 mL buforu boranowego (100mM, pH 9.5) rozpuszczono ilość (0.0195mmol) i pH doprowadzono z powrotem do pH 9.97. Do otrzymanego roztworu dodano roztwór aktywowanego glikolu metyloheptaetylenowego ((PEG7)-heksylo-oligomeru) (0.024mmol) w 1 mL etanolu. Przebieg reakcji sprzężenia (acylacji) monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną, wygaszono ją przez doprowadzenie roztworu do pH <6 za pomocą rozcieńczonego kwasu 129 EP 1 613 343 B1 chlorowodorowego. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 nM Buforu Tris-HCl, pH 7.6. Chromatogram HPLC końcowej mieszaniny reakcyjnej przedstawia następującą kompozycję: nieprzereagowana miniproinsulina (20.7%), sprzężona miniproinsulina LysB29 (71.1%) i podwójnie sprzężona miniproinsulina PheB1, LysB29 (6.2%). Z części powyższej mieszaniny reakcyjnej, każdy główny produkt z reakcji sprzężenia opisany powyżej jest izolowany przy zastosowaniu HPLC w odwróconym układzie faz. Kolumnę HPLC (1.0 cm średnicy x25 cm długości) wypełniono komercyjnie dostępną fazą stacjonarną C18, która wiadomo że jest użyteczna do rozdzielenia peptydów i białek, a następnie wprowadzono do układu HPLC. Układ ekwilibrowano za pomocą buforu elucyjnego, który stanowiła mieszanina składająca się z 75% fazy ruchomej A (H2O z 0.1 % 15 20 25 30 kwasem trifluooroctowym) i 25% fazy ruchomej B (acetonitryl z 0,1% kwasem trifluorooctowym), który dostarczono z szybkością przepływu 5 mL/min. Roztwór mieszaniny produktów w Tris-HCl, naniesiono na kolumnę i główne produkty rozdzielono i eluowano przy zastosowaniu elucji gradientowej, w której kompozycja buforu elucyjnego zmieniła się z 25% fazy ruchomej B do 35% fazy ruchomej B w ciągu 120 minut. Każdą z frakcji, które zebrano, analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia identyczności i czystości zawartego w niej produktu. Wspólne frakcje każdego produktu (nieprzereagowanej miniproinsuliny, monokoniugatu miniproinsuliny i dikoniugatu miniproinsuliny) następnie zebrano i rozpuszczalnik usunięto przez odparowanie rotacyjne. Identyczność i czystość każdego produktu jest wyznaczana za pomocą analiz HPLC i spektrometrii masowej. (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu Enzymów Rekombinowanej desThr Miniproinsuliny Sprzężonej z Oligomerem. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM 130 EP 1 613 343 B1 Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów (0.424 ?mol/mL) poddano reakcji z trypsyną (5.97 x 10 -4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (1.93 x 10-4 ?mol/mL). Po 60 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1,58 mL 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC (w odniesieniu do czasów retencji znanych referencyjnych wzorców) i analizy widma masowego. W ten sposób otrzymano desThr Insulinę sprzężoną z LysB29Heksylo-PEG7-Oligomerem, desThr Insulinę sprzężoną z LysB29, PheB1Di (Heksylo-PEG7-Oligomerem) i desThr Insulinę. Mieszaninę produktów z reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. W celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu wykorzystano czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widma masowego (Tabela 11). Tabela 11 Koniugaty desThr Miniproinsuliny i Oligomeru I Produkty (lub Przewidywane Produkty) z Rozcięcia Każdego z nich za pomocą Koktajlu Enzymów Koniugat Spodziewane Produkty Monokoniugat Miniproinsulina LysB29- DesThr Insulina sprzężona z Lys29-heksyloPEG7 ?oligomerem Dikoniugat PheB1, miniproinsulina LysB29- desThr Insulina sprzężona z PheB1, Lys29Di(Heksylo-PEG7-oligomerem) Przykład 35 Przygotowanie peptydu C Sprzężonego z Lys 64-Oligomerem z propeptydu C [0298] (a) Sprzężenie syntetycznego propeptydu C. Syntetyczny propeptyd C 31-65) (Arg-Arg-ludzki peptyd C-Lys-Arg) (Masa cząsteczkowa 3617 Daltonów) zakupiono od American Peptide Company, USA. W 10 mL buforu boranowego (100mM, pH 9.5) rozpuszczono porcję peptydu C wynoszącą 2.32 x 10-3 mmol. Do otrzymanego roztworu dodano roztwór metyloheptaetylenowego ((PEG7)-heksylo-oligomeru) (9.30 x 10 -1 mmol) w 3-6 mL acetonitrylu aktywowanego za pomocą N- 131 EP 1 613 343 B1 hydroksysukcynoimidu glikolu. Przebieg reakcji sprzężenia (acylacji) monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną, wygaszono ją przez doprowadzenie roztworu do pH <6 za pomocą rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 nM Buforu Tris-HCl, pH 7.6. (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu Enzymów Propeptydu C 31-56 Sprzężonego z Oligomerem. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów (0.424 ?mol/mL) następnie poddano reakcji z trypsyną (5.97 x 10 -4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (1.93 x 10 -4 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 1,58 mL 1% kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC (w odniesieniu do czasów retencji znanych referencyjnych wzorców) i analizy widma masowego. W ten sposób otrzymano Ludzki peptyd C (33-63) i peptyd C sprzężony z Lys 64-Heksylo-PEG7Oligomerem. Mieszaninę produktów z reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. W celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu wykorzystano czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widma masowego (Tabela 12). Tabela 12 Koniugaty propeptydu C i Oligomeru I Produkty (lub Przewidywane Produkty) z Rozcięcia za pomocą Koktajlu Enzymów Koniugat Przewidywane Produkty Monokoniugat (Lys 64)-propeptyd C Peptyd C sprzężony z Lys64-heksylo-PEG7(sprzężony w Lys64) oligomerem, peptyd C sprzężony z 64 Arg65Lys -heksylo-PEG7-oligomerem, peptyd C sprzężony z Arg 32,Lys64-heksylo132 EP 1 613 343 B1 Koniugaty propeptydu C i Oligomeru I Produkty (lub Przewidywane Produkty) z Rozcięcia za pomocą Koktajlu Enzymów Koniugat Przewidywane Produkty PEG7-oligomerem Koniugat(Arg31)-propetyd (sprzężony w Arg 31) C Peptyd C, Arg31-peptyd C Dikoniugat propeptydu C (sprzężony Peptyd C sprzężony z Lys64-heksylo-PEG7w Arg3 i Lys 64) oligomerem, peptyd C sprzężony z Arg65Lys64-heksylo-PEG7-oligomerem, peptyd C sprzężony z Arg 32,Lys64-heksyloPEG7-oligomerem Przykład 36 Sposoby syntezy acylowanych polipeptydów insuliny przy zastosowaniu Preparatów innej Insuliny sprzężonej z LysB29-Oligomerem [0299] (a) Sprzężenie Rekombinowanej Proinsuliny II. Otrzymano rekombinowaną Proinsulinę II (Masa cząsteczkowa 11134 Daltonów). Część proinsuliny II (1.79 x 10-3 mmol) rozpuszczono w 1 mL DMSO i dodano do 0,25 mL trietyloaminy i roztwór mieszano przez 20 minut. Do otrzymanego roztworu monoheksadecyloeteru dodano roztwór heksaetylenoglikolu aktywowanego (heksadecylo-PEG6- oligomeru, Figura 20) (4.49 x 10-3 mmol) w 1 mL THF. Przebieg reakcji sprzężenia (acylacji) monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną wygaszono ją przez dodanie 1% roztworu TFA. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6. Małą część mieszaniny reakcyjnej przed wymianą do 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6 przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Główne produkty oczyszczono za pomocą HPLC i analizowano za pomocą spektroskopii masowej. W ten sposób otrzymano dwa monokoniugaty i jeden dikoniugat Proinsuliny II.W celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu wykorzystano czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widm masowych (Tabela 13). 133 EP 1 613 343 B1 Tabela 13 Koniugaty Proinsuliny II i Oligomeru Koniugat Produkt Masa Figura cząsteczkowa Mono B Proinsulina II sprzężona z LysB29-heksadecylo- 11666 Proinsulina PEG6-oligomerem II 21 Mono A Proinsulina II sprzężona z peptydem wiodącym 11666 Proinsulina ? heksadecylo- PEG6-oligomerem II 22 Di Proinsulina II sprzężona z LysB29-heksadecylo- 12198 Proinsulina oligomerem i Proinsulina II sprzężona z II peptydem wiodącym-heksadecylo-PEG6oligomerem 23 (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu enzymów Rekombinowanej Proinsuliny I Sprzężonej z Heksadecylo-PEG6- Oligomerem. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów (0.05 ?mol/mL) następnie poddano reakcji z trypsyną (1.56 x 10 -4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (0.78 x 10 -1 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 9 mL 0.1 % kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC i analizy widm masowych (Figury 25 i 26). W ten sposób otrzymano Insulinę i Insulinę sprzężoną z LysB29-Heksadecylo-PEG6Oligomerem. Mieszaninę produktów z reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. W celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu wykorzystano czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widm masowych (Tabela 14). Tabela 14 134 EP 1 613 343 B1 Koniugaty Proinsuliny II i Oligomeru I Produkty lub (Przewidywane Produkty) z Rozcięcia za pomocą Koktajlu Enzymów Koniugat Produkty Masa Figura cząsteczkowa Mono A Insulina Proinsulina II 5809 (M+1) -- Peptyd wiodący sprzężony z heksadecylo- 2035 (M+1) PEG6-oligomerem, (desThr insulina) i (Sztuczny peptyd C) -- Mono B Insulina sprzężona z LysB29-heksadecylo- 6341 (M+1) Proinsulina II PEG6-oligomerem i (peptyd wiodący) 23 Di Proinsulina Insulina sprzężona z LysB29-Heksadecylo- 6341 (M+1) II PEG6-Oligomerem (peptyd wiodący sprzężony z heksadecylo-PEG6oligomerem) i (Sztuczny peptyd C) 23 [0300] Aktywowany monoheksadecyloeter glikolu tetraetylenowego (C16PEG4) (Figura 27) i aktywowany monoheksadecyloeter glikolu oktaetylenowego (C16-PEG8) (Figura 27) sprzężono z proinsuliną II wykorzystując tę procedurę i poddano działaniu koktajlu enzymów opisanego w niniejszym zgłoszeniu w celu uzyskania końcowych produktów odpowiednio Insuliny sprzężonej z LysB29Heksadecylo-PEG4-Oligomerem i Insuliny sprzężonej z LysB29-HeksadecyloPEG8-Oligomerem. Przykład 37 Przygotowanie LysB29-Acylowanej Insuliny [0301] (a) Acylacja Rekombinowanej Proinsuliny I. Otrzymano rekombinowaną Proinsulinę I (Masa Cząsteczkowa 10,642 Daltonów). Część proinsuliny I (1.79 x 10-3 mmol) rozpuszczono w 1 mL DMSO i dodano do 0,25 mL trietyloaminy i roztwór mieszano przez 20 minut. Do otrzymanego roztworu dodano roztwór estru N-hydroksysukcynoimidowego kwasu palmitynowego (CH 3 (CH2)14CO2H) (9.30 x 10-3 mmol) w 1 mL THF. Przebieg reakcji sprzężenia (acylacji) monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną wygaszono ją za pomocą 1% roztworu TFA. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono i wymieniono do 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6. Małą część mieszaniny reakcyjnej przed wymianą do 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6 135 EP 1 613 343 B1 przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Główne produkty oczyszczono za pomocą HPLC i analizowano za pomocą spektroskopii masowej. W ten sposób otrzymano dwa monoacylowane, jeden diacylowany i jeden triacylowany produkty Proinsuliny I. W celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu wykorzystano czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widm masowych (Tabela 15). Tabela 15 Koniugaty Proinsuliny I i Oligomeru z Aktywowanym Palmitoilem Koniugat (Produkt) Przewidywana Masa Cząsteczkowa Mono B Proinsulina I (LysB29-Palmitoilo-Proinsulina I) 10880 Mono A Proinsulina I 10880 (Lys64-Palmitoilo-Proinsulina I) B29 Di-Proinsulina I (Lys ,Lys 64 Di (Palmitoilo)-Proinsulina I) 1118 Tri-Proinsulina I (LysB29, Lys 64 i N-aminowy Peptyd 11356 Wiodący i Tri(Palmitoilo)-Proinsulina I) (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu Enzymów Rekombinowanej PalmitoiloProinsuliny I. Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów (0.05 ?mol/mL) następnie poddano reakcji z trypsyną (1.56 x 10 -4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (0.78 x 10 -1 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 9 mL 0.1 % kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC i analizy widm masowych. W ten sposób otrzymano Insulinę, LysB29-Palmitoilo-Insulinę i Lys64-Palmitoilo-peptyd C. Mieszaninę produktów z reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. W celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu wykorzystano czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widm masowych. [0302] Aktywowane estry łańcucha Acylowego (C2 do C18) są poddawane reakcji z proinsuliną I przy zastosowaniu procedury z przykładu 37(a) i poddane 136 EP 1 613 343 B1 działaniu koktajlu enzymów jak w przykładzie 37(b) w celu uzyskania końcowych produktów Lys B29 Acylowanych Insulin i Lys 64 acylowanych peptydów C odpowiadających łańcuchowi acylowemu. Przykład 38 Przygotowanie Insuliny z Karbonylowanej Proinsuliny [0303] (a) Karbonylacja Rekombinowanej Proinsuliny I. Otrzymano rekombinowaną Proinsulinę I (Masa Cząsteczkowa 10,642 Daltonów). Część proinsuliny I (1.79 x 10-3 mmol) rozpuszczono w 1 mL DMSO i dodano do 0,25 mL trietyloaminy i roztwór mieszano przez 20 minut. Do otrzymanego roztworu dodano roztwór estru arylo-węglanowego (9.30 x 10 -3 mmol) (ester węglanowy N-hydroksysukcynoimidu i fenolu) w 1 mL THF. Przebieg reakcji sprzężenia (acylacji) monitorowano za pomocą HPLC. Gdy reakcja wyglądała na zakończoną wygaszono ją za pomocą 1% roztworu TFA. Mieszaninę reakcyjną następnie przetworzono w celu usunięcia rozpuszczalników, N- hydroksysukcynoimidu i fenolu i wymieniono do 100 mM Buforu Tris-HCl, pH 7.6. Małą część mieszaniny reakcyjnej przed wymianą do 100 mM Buforu TrisHCl, pH 7.6 przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Główne produkty oczyszczono za pomocą HPLC i analizowano za pomocą spektroskopii masowej. W ten sposób otrzymano dwa monokarbonylowane, jeden diakarbonylowany i jeden triakarbonylowany produkty Proinsuliny I. W celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu wykorzystano czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widm masowych (Tabela 16). Tabela 16 Koniugaty Oligomeru i Proinsuliny I z aktywowanym estrem węglanowym fenolu Koniugat (Produkt) Mono B Proinsulina I (LysB29-karbonylowana Proinsulina I) Mono A Proinsulina I (Lys64-karbonylowana Proinsulina I) Di-Proinsulina I (LysB29,Lys 64 Di(karbonylowana)Proinsulina I) Tri-Proinsulina I (LysB29, Lys 64 i N-aminowy peptyd wiodący i Tri(karbonylowana)Proinsulina I) (b) Rozcięcie za pomocą Koktajlu Enzymów Rekombinowanej Karbonylowanej 137 EP 1 613 343 B1 Proinsuliny I . Porcję roztworu Tris-HCl mieszaniny produktu analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Przygotowano roztwór trypsyny (traktowanej TPCK; z trzustki wołowej) w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Roztwór karboksypeptydazy B (z trzustki świńskiej) przygotowano w 100 mM Buforze Tris-HCl, pH 7.6. Mieszaninę produktów (0.05 ?mol/mL) następnie poddano reakcji z trypsyną (1.56 x 10-4 ?mol/mL) i karboksypeptydazą B (0.78 x 10-1 ?mol/mL). Po 30 minutach, reakcję wygaszono przez dodanie 9 mL 0.1 % kwasu trifluorooctowego w acetonitrylu. Mieszaninę produktów z reakcji następnie przetworzono i wymieniono do 10 mM Buforu Fosforanowego, pH 7.2. [0304] Małą część mieszaniny reakcyjnej przed wymianą do 10 mM Buforu Fosforanowego, pH 7.2 przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. Główne produkty oczyszczono za pomocą HPLC i analizowano za pomocą spektroskopii masowej. Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC i analizy widm masowych. W ten sposób otrzymano Insulinę, LysB29-Fenylokarbaminian Insuliny i Lys64-Fenylokarbaminian peptydu C. W celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu wykorzystano czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widm masowych. (c) Rozcięcie Karbonylowanej Insuliny za pomocą Enzymu Elastazy Trzustkowej. Porcję 0,01M roztworu buforu fosforanowego mieszaniny produktów analizowano za pomocą HPLC w celu wyznaczenia stężenia polipeptydu. Roztwór Elastazy Trzustkowej (Typ III; z trzustki świńskiej) przygotowano w 10 mM Buforze fosforanowym, pH 7.2. Mieszaninę produktów (5x10-3M) następnie poddano reakcji z elastazą trzustkową (2.56x10-4M) w temperaturze pokojowej. Po 60 minutach reakcję wygaszono przez dodanie równej objętości 0,02 M kwasu cytrynowego. Ten etap może być osiągnięty przez hydrolizę zasadową, taką jak za pomocą buforu zasadowego np. w pH 10 lub wyższym w kontrolowanych warunkach. [0305] Główne produkty zidentyfikowano za pomocą czasu retencji HPLC i 138 EP 1 613 343 B1 analizy widm masowych. Otrzymano insulinę i Lys64-peptyd C. Mieszaninę produktów z reakcji przetworzono i analizowano za pomocą HPLC. W celu wyznaczenia identyczności i czystości każdego produktu wykorzystano czas retencji HPLC w odniesieniu do tego referencyjnych wzorców i analizę widm masowych. Przykład 39 Optymalizacja procesu transformacji enzymatycznej [0306] W jednym przykładzie wykonania niniejszego wynalazku stężenie enzymu potrzebne do odcięcia peptydów od cząsteczki polipeptydu proinsuliny w celu wytworzenia insuliny może być zmniejszone aż do 4000X zachowując skuteczną i specyficzną aktywność rozcinającą. Stosowany jest koktajl Trypsyna-CPB zgodnie z protokołami opisanymi w niniejszym zgłoszeniu do odcięcia polipeptydów w celu wytworzenia insuliny, gdzie enzym trypsyna występuje w ilości, która jest >700 moli trypsyny dla każdego mola proinsuliny i może występować proinsuliny:1/2000 na mol przykład trypsyny. w następującym Karboksypeptydaza stosunku: B (CPB) 1 mol może występować w koktajlu w ilości, która jest >2000-2200 moli CPB w porównaniu do proinsuliny i może występować na przykład w następującym stosunku: 1 mol proinsuliny:1/4000 mola CPB. Zatem można zastosować następujący koktajl enzymów składający się z trypsyny i CPB: 1 mol substratu:1/>700 mol trypsyny:1/>2000-2200 mol CPB i może wynosić na przykład 1 mol substratu:1/2000 mol trypsyny:1/4000 mol CPB. Stosunek substratu takiego jak proinsulina do trypsyny i CPB może stanowić jakąkolwiek wartość powyżej lub poniżej wartości opisanych w niniejszym zgłoszeniu i może wynosić na przykład 1 mol substratu:1/750 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/800 moli trypsyny, 1 mol substratu/850 moli trypsyny 1 mol substratu/900 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/950 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/1000 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/1200 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/1400 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/1500 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/1600 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/1700 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/1800 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/1900 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/2000 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/2200 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/2400 moli trypsyny, 1 mol 139 EP 1 613 343 B1 substratu:1/2500 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/2600 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/2800 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/3000 moli trypsyny, 1 mol substratu:1/2100 moli CPB, 1 mol substratu:1/2200 moli CPB, 1 mol substratu:1/2400 moli CPB, 1 moli substratu:1/2500 moli CPB, 1 mol substratu:1/2600 moli CPB, 1 mol substratu:1/2800 moli CPB, 1 mol substratu:1/3000 moli CPB, 1 mol substratu: 1/3200 moli CPB, 1 mol substratu:1/3400 moli CPB, 1 mol substratu:1/3600 moli CPB, 1 mol substratu:1/3800 moli CPB, 1 mol substratu:1/4000 moli CPB, 1 mol substratu: 1/4200 moli CPB, 1 mol substratu:1/4400 moli CPB, 1 mol substratu:1/4600 moli CPB, 1 mol substratu:1/4800 moli CPB, 1 mol substratu:1/5000 moli CPB, itp.,i jakiekolwiek ich połączenie w odniesieniu do stosunku substratu, trypsyny i CPB. [0307] Tym samym niniejszy wynalazek także dostarcza sposób wytwarzania insuliny z polipeptydu proinsuliny obejmujący zetknięcie polipeptydu proinsuliny z enzymatycznym koktajlem w celu odcięcia peptydu C i peptydu wiodącego od polipeptydu proinsuliny, gdzie koktajl enzymatyczny zawiera enzym trypsynopodobny (np. trypsynę, trombinę, enzymy z Achronabacter lyticus) i enzym karboksypeptydazo-podobny (np. karboksypeptydazę A, karboksypeptydazę B), w warunkach w których c) stosunek molowy enzymu trypsyno-podobnego do enzymu karboksypeptydazo-podobnego wynosi 1/>700:1/>2000. [0308] W pewnych przykładach wykonania niniejszego wynalazku, gdy substratem jest polipeptyd proinsuliny, stosunek enzymu trypsyny do enzymu CPB jest stosunkiem enzymów, przy którym odcięcie polipeptydów proinsuliny występuje w Arg31 i resztach Arg łączących łańcuch B i peptyd wiodący i łączących łańcuch B i peptyd C i łączących łańcuch A i peptyd C ale nie występuje w istotnym stopniu (np. jest mniejszej niż 1%, 5% lub 10%) w ArgB22 polipeptydu proinsuliny. Przykład 40 Zastosowanie jednołańcuchowych prekursorów insuliny do wytworzenia pochodnej insuliny bez procesu transpeptydacji [0309] Sprzężenie (acylacja) insuliny w reszcie aminowej B-29 Lys łańcucha B 140 EP 1 613 343 B1 jest przeprowadzane za pomocą reakcji natywnej insuliny z aktywowaną jednostką (np. Estrem N-hydroksysukcynoimidowym Oligomeru) (Figura 33) w wybranym podłożu reakcyjnym. Wybiórczość reakcji w kierunku B-29 Lys jest zmniejszona głównie z powodu acylacji w A-1 Gly jak również grup aminowych B-1 Phe w kierunku estru N-hydroksysukcynoimidowego. W tych warunkach reakcja prowadzi do powstania mieszaniny koniugatów insuliny składającej się z modyfikacji w B-29 Lys jak również A-1 Gly i B-Phe. Następnie koniugat B-29 Lys jest oczyszczony z innych produktów za pomocą chromatografii przy niskiej wydajności. Przedstawiono, że zastosowanie zoptymalizowanych warunków obejmujących organiczne podłoże i organiczną zasadę i stechiometryczną ilość N-hydroksysukcynoimidu poprawiło wybiórczość acylacji w B-29 Lys w porównaniu do A-1 Gly. Jednak problem modyfikacji w innych miejscach nie może zostać uniknięty z zastosowaniem niezabezpieczonej insuliny. [0310] Przedstawiono w niniejszym wynalazku, że zastosowanie naturalnych i sztucznych proinsulin (Figury 34 i 35) dostarcza wyjątkowy sposób do wytwarzania pochodnych insulin zmodyfikowanych lub sprzężonych w łańcuchu bocznym Lys łańcucha B z wybiórczością większą niż w przypadku insuliny. W proinsulinie (-ach) aminowy koniec łańcucha A insuliny, A-1 Gly, jest połączony z karboksylowym końcem łańcucha B za pomocą peptydu C. Ponieważ aminowy łańcuch boczny A-1 Gly jest zabezpieczony przez peptyd C reakcja (acylacja) proinsuliny z estrem N-hydroksysukcynoimidowym będzie wybiórczo modyfikować aminowy łańcuch boczny Lys łańcucha B (np. B-29, ludzkiej insuliny). Po rozcięciu karboksypeptydazy koniugat enzymatycznym dostarczy B-29 za Lys pomocą trypsyny acylowaną i insulinę. Proinsulina zostanie wykorzystana jako materiał wyjściowy zamiast insuliny ponieważ nawet jeśli Lys (np. Lys 64 naturalnej proinsuliny) na peptydzie C jest acylowana razem z B-29 Lys, enzymatyczne rozcięcie za pomocą trypsyny i karboksypeptydazy N-końca peptydu wiodącego, będzie wciąż występować w Arg63, Arg32 i Arg31 dostarczając insulinę z acylowanym łańcuchem B Lys. [0311] Nowe sekwencje także mogą być ekspresjonowane z układów drożdży (np. Pichia, P. morpha, itp.) jako wynik krótkiego peptydu C (C = 0, -1, -2, -3, -4, -5, itp.). 141 EP 1 613 343 B1 [0312] Korzyści zastosowania tych nowych sekwencji jako materiału wyjściowego w celu dostarczenia insuliny modyfikowanej w Lys (Figury 36 i 37) są następujące: 1. Ponieważ aminowy koniec A-1 Gly jest zabezpieczony przed acylacją, zastosowanie proinsuliny zapewnia wysoką wybiórczość w kierunku modyfikacji B-29 Lys. 2. Miejsca B-1 Phe mogą także być zablokowane przed sprzężeniem w obecności sekwencji wiodącej w B-1. 3. Sprzężenie w B-29 Lys zabezpiecza przed usunięciem B-30 Thr przez trypsynę i dlatego też nie będzie potrzebny żaden proces transpeptydacji, aby wprowadzić Thr w B-30. 4. Oba koniugaty, monokoniugat B-29 Lys i dikoniugat B-29 i L-1 (wiodący peptyd ? 1) dają pojedynczy produkt, B-29 modyfikowaną insulinę po rozcięciu. 5. Dikoniugat, sprzężony w B-29 Lys i B-1 Phe z zastosowaniem prekursora insuliny o pojedynczym łańcuchu bez peptydu wiodącego daje pojedynczy produkt B-29 i B-1 modyfikowaną insulinę po rozcięciu. 6. Ten szlak zapewnia duże przekształcenie do produktu B-29 (>80%) w porównaniu do tego otrzymanego przez sprzężenie przy zastosowaniu insuliny. 7. Ten szlak może być zastosowany z jakimkolwiek rodzajem proinsuliny bez względu na sekwencję nieulegającej rozcięciu części rozdzielającej (mini peptydu C) pomiędzy łańcuchem A i B lub peptydu wiodącego. 8. Ten szlak może być zastosowany do wytworzenia modyfikacji w łańcuchu bocznym Lys bez względu na pozycję Lys na łańcuchu B. Dlatego też może być zastosowany z jakimkolwiek rodzajem preproinsuliny (proinsulina z peptydem wiodącym lub białkiem fuzyjnym) lub miniproinsuliny (proinsulina z małymi łańcuchami peptydu C) lub cząsteczek podobnych do proinsuliny (np. pro LysPro). 9. Ten szlak dostarcza bezpośredni szlak do otrzymania B-29Lys, B-1 Phe di-acylowanej (modyfikowanej) insuliny wykorzystujący prekursora insuliny o pojedynczym łańcuchu bez peptydu wiodącego (konstrukt 1). 142 EP 1 613 343 B1 10. Ten szlak dostarcza schemat wytwarzania komercyjnie tańszy i o większej wydajności do wytwarzania insuliny modyfikowanej w B-29 Lys (np. HIM2) w porównaniu do zastosowania insuliny lub jednołańcuchowych prekursorów insuliny nie zawierających Thr. [0313] Sekwencje jednołańcuchowych prekursorów insuliny nie poddane transpeptydacji: Konstrukt 1: Łańcuch B-Arg-Łańcuch A Konstrukt 2: His-Gly-Arg-Łańcuch B-Arg-Łańcuch A Konstrukt 3: His-Gly-Arg-Łańcuch B-Arg-Arg-Łańcuch A Konstrukt 3: Peptyd wiodący-Arg-Łańcuch B-Arg-Ala-Lys-Arg-Łańcuch A Konstrukt 4: Peptyd wiodący-Arg-Łańcuch B-Arg-Pro-Arg-Łańcuch A Konstrukt 5: Łańcuch B-Arg-Arg-Łańcuch A [0314] Łańcuch B i łańcuch A: Łańcuchy B i A ludzkich lub innych (bydlęcych, świńskich, mysich, itp.) sekwencji insulinowych lub modyfikacji jakiejkolwiek sekwencji insulinowej (np. insulina Lys28Pro29) lub analogów insuliny bez jednego (np. łańcucha B desThr) lub więcej aminokwasów lub zastąpieniem jednego lub więcej aminokwasów. [0315] Niniejszy wynalazek zostały opisany w niniejszym zgłoszeniu w odniesieniu do różnych przykładów wykonania. Zakres wynalazku jest określony za pomocą następujących zastrzeżeń. 143 EP 1 613 343 B1 1 EP 1 613 343 B1 2 EP 1 613 343 B1 3 EP 1 613 343 B1 4 EP 1 613 343 B1 5 EP 1 613 343 B1 6 EP 1 613 343 B1 7 EP 1 613 343 B1 8 EP 1 613 343 B1 9 EP 1 613 343 B1 10 EP 1 613 343 B1 11 EP 1 613 343 B1 12 EP 1 613 343 B1 13 EP 1 613 343 B1 14 EP 1 613 343 B1 15 EP 1 613 343 B1 16 EP 1 613 343 B1 17 EP 1 613 343 B1 18 EP 1 613 343 B1 19 EP 1 613 343 B1 20 EP 1 613 343 B1 21 EP 1 613 343 B1 22 EP 1 613 343 B1 23 EP 1 613 343 B1 24 EP 1 613 343 B1 25 EP 1 613 343 B1 26 EP 1 613 343 B1 27 EP 1 613 343 B1 28 EP 1 613 343 B1 29 EP 1 613 343 B1 30 EP 1 613 343 B1 31 EP 1 613 343 B1 32 EP 1 613 343 B1 33 EP 1 613 343 B1 34 EP 1 613 343 B1 35 EP 1 613 343 B1 36 EP 1 613 343 B1 37 EP 1 613 343 B1 38 EP 1 613 343 B1 39 EP 1 613 343 B1 40























































































































































































Grupy dyskusyjne