wp.pl
wp.pl
Najpopularniejszy w Polsce portal o finansach i biznesie
Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 1706157 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 1706157 T3


EP 1706157 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 13.12.2004 04816270.5 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) (19) PL (11) PL/EP (13) (51) 1706157 T3 Int.Cl. A61L 27/38 (2006.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 17.08.2016 Europejski Biuletyn Patentowy 2016/33 EP 1706157 B1 Tytuł wynalazku: Sposób wytwarzania przeszczepów komórek krążka międzykręgowego i ich zastosowanie jako materiału do przeszczepów (30) (43) Pierwszeństwo: 12.12.2003 DE 10359830 17.02.2004 US 544315 P 06.09.2004 DE 102004043449 Zgłoszenie ogłoszono: 04.10.2006 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/40 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 28.02.2017 Wiadomości Urzędu Patentowego 2017/02 (73) Uprawniony z patentu: co.don AG, Teltow, DE PL/EP 1706157 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: OLIVERA JOSIMOVIC-ALASEVIC, Berlin, DE JEANETTE LIBERA, Berlin, DE VILMA METHNER, Kleinmachnow, DE HANS-JÖRG MEISEL, Berlin, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Teresa Sztandke PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). EP 1 706 157 B1 Sposób wytwarzania przeszczepów komórek krążka międzykręgowego i ich zastosowanie jako materiału do przeszczepów Opis [0001] Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania autologicznych przeszczepów mieszanych komórek krążka międzykręgowego, jak opisane w zastrzeżeniach oraz otrzymywanego tym sposobem autologicznego przeszczepu mieszanych komórek krążka międzykręgowego. [0002] Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania in vitro przeszczepów komórek chrzęstnych krążka międzykręgowego z chorej tkanki krążka międzykręgowego pacjentów oraz ich zastosowania jako materiału do przeszczepu do leczenia chorych krążków międzykręgowych. Wynalazek dotyczy ponadto trójwymiarowej, żywotnej i stabilnej mechanicznie tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego i jej zastosowania jako materiału do przeszczepu do leczenia chorych krążków międzykręgowych, jak również do badania substancji czynnych. Przedmiotem wynalazku są ponadto wytworzone przeszczepy komórek krążka międzykręgowego i technika przeszczepu oraz wytworzona tkanka chrzęstna krążka międzykręgowego i preparaty lecznicze, np. roztwory do iniekcji, które zawierają tę tkankę i przeszczepy komórek. [0003] Degeneracja krążków międzykręgowych rozpoczyna się podczas starzenia lub wskutek urazu i wywołuje ostre i przewlekłe bóle oraz niestabilność kręgosłupa. Ponad 300 000 pacjentów w Europie cierpi z powodu schorzeń krążków międzykręgowych. Około 70% pacjentów, którzy cierpią na przepuklinę krążka międzykręgowego i są leczeni metodą dyscektomii, nadal cierpi z powodu bólu pleców. Uporczywe silne bóle sprawiają, że u 10% tych pacjentów konieczne jest dalsze leczenie chirurgiczne (Yorimitsu i wsp., 2001). Przyczyną tego jest powodowane przez operację zmniejszenie grubości krążka międzykręgowego, związane z tym zwiększenie miejscowego obciążenia tkanki krążka międzykręgowego (Brinckmann i Grootenboer, 1991), a zwłaszcza brak gojenia i regeneracji zniszczonej i usuniętej tkanki krążka międzykręgowego (Lundon i Bolton, 2001, Meakin i wsp., 2001). Wraz z upływem czasu ta niestabilność dotkniętego zmianą krążka międzykręgowego skutkuje zmianami zwyrodnieniowymi sąsiednich krążków międzykręgowych, co dodatkowo powoduje konieczność interwencji chirurgicznych, a w najgorszym wypadku połączenie trzonu kręgowego lub wszczepienie protezy. Dlatego też biologiczna naprawa lub regeneracja krążka międzykręgowego jest przyszłością w leczeniu zdegenerowanych krążków międzykręgowych. [0004] Znanym sposobem biologicznej regeneracji tkanki jest przeszczep komórek chrzęstnych z użyciem własnych komórek organizmu, który jest stosowany do leczenia uszkodzeń komórek chrząstki stawowej. Wykorzystuje się do tego potencjał komórek chrząstki stawowej do odbudowy nowej tkanki in vivo po przeszczepie komórek. W tym celu od pacjenta pobiera się biopsję chrząstki stawowej, izoluje z tego komórki chrzęstne, namnaża w hodowli komórkowej, a następnie przeszczepia pacjentowi w obszar ubytku tkanki, np. przez wstrzyknięcie. Tam tworzą one nową tkankę i w ten sposób całkowicie wypełniają ubytek. Tym sposobem osiąga się to, że po aplikacji przeszczepu komórek tkanka budowana jest w organizmie. W zasadzie, ta procedura nie ma zastosowania do leczenia degeneracji krążka międzykręgowego, ponieważ pacjentowi ze względów etycznych nie można pobrać żadnego materiału wyjściowego z nienaruszonego sąsiedniego krążka międzykręgowego, zaś chora tkanka z założenia nie jest użyteczna. 1 EP 1 706 157 B1 [0005] Pierwsze podejścia do biologicznego zastąpienia krążka międzykręgowego opierają się na wykorzystaniu zdrowej tkanki krążka międzykręgowego. I tak Handley (US 6,080,579) i Ferree (US 6,340,369 B1) opisują wykorzystanie normalnej tkanki krążka międzykręgowego do izolacji komórek krążka międzykręgowego oraz połączenie tych komórek z bioresorbowalnym nośnikiem. Wiele prac naukowych opiera się również na zastosowaniu normalnej tkanki krążka międzykręgowego: Okuma i wsp., 2000, Gruber i wsp., 2000, Chelberg i wsp., 1995. Jednak zdrowy krążek międzykręgowy pacjenta nie może służyć jako źródło tkanki do leczenia innego krążka międzykręgowego, ponieważ usunięcie tkanki prowadzi do zniszczenia, degeneracji, a więc utraty funkcji tego krążka międzykręgowego. Innym podejściem jest zastosowanie zdegenerowanej tkanki jądra miażdżystego, która jest usuwana z wnętrza zdegenerowanego krążka międzykręgowego i poddawana obróbce. W tym zabiegu operacyjnym zdegenerowany i zniszczony już krążek międzykręgowy ulega dalszemu zniszczeniu. Obróbkę tkanki proponuje się z jednej strony jako odwodnienie (US 6,648,918) lub połączenie znajdujących się tam komórek z materiałem nośnikowym (US 6,569,442; US2001/0020476 A1), po czym wszczepienie z powrotem do zwyrodniałych krążków międzykręgowych. Jednakże, odwodniona tkanka nie zawiera żyjących komórek, a zatem nie stanowi metody regeneracji biologicznej. Proponowane połączenie komórek jądra lub innych komórek z materiałem nośnikowym także nie stanowi czysto biologicznej metody i wymaga zastosowania odpowiedniego materiału nośnikowego, który przykładowo musi być odpowiedni pod względem biomechanicznym, który powinien odbudowywać się i ulegać degradacji w taki sam sposób jak nowa tkanka, który nie powinien utrudniać tworzenia nowej tkanki lub przykładowo, nie powinien wywoływać żadnych reakcji immunologicznych ze względu na użyte syntetyczne, allogeniczne lub ksenogeniczne materiały. Inną możliwością leczenia byłoby wykorzystanie krażków międzykręgowych innych pacjentów, przy czym chodzi tu o przeszczep allogeniczny (6,344,058; Keith DK i wsp., 2003). Tu jednak problem stanowią reakcje immunologiczne i wprowadzenie jedynie krążka międzykręgowego dawcy także prawdopodobnie nie spowodowałoby biologicznej regeneracji dotkniętego schorzeniem krążka międzykręgowego. [0006] US2003165473 opisuje wytwarzanie tkanki krążka międzykręgowego z komórek pierścienia włóknistego, jądra miażdżystego i płytki końcowej. [0007] Konsekwencją wymienionych problemów są ogólne cele w aspekcie leczenia zdegenerowanych krażków międzykręgowych i regeneracji krążków międzykręgowych: stosowanie medycznie i etycznie dopuszczalnej tkanki wyjściowej lub - próbki komórek, nie zniszczenie żadnego innego lub tego dotkniętego zmianą, chorego krążka międzykręgowego pacjenta, stosowanie wyłącznie materiałów własnych pacjenta (terapia autologiczna), znalezienie optymalnych warunków izolacji komórek i ? warunków hodowli celem namnażania komórek krążka międzykręgowego i późniejszego tworzenia macierzy krążka międzykręgowego, rezygnacja z materiałów nośnikowych celem uniknięcia reakcji immunologicznych. Problemy te mogą być rozwiązane dzięki przeszczepowi specjalnych autologicznych przeszczepów komórek lub dzięki przeszczepowi uprzednio przygotowanej poza organizmem 3-wymiarowej tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego. [0008] Celem niniejszego wynalazku było zatem dostarczenie sposobów wytwarzania przeszczepów komórek chrzęstnych krążka międzykręgowego i stabilnej żywotnej tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego, które są odpowiednie do autologicznego przeszczepu, do szybkiej odbudowy i zachowania funkcji krążka międzykręgowego. Istotne jest przy tym, aby materiał wyjściowy do wytwarzania przeszczepów komórkowych mógł być pobrany w sposób medycznie i etycznie dopuszczalny i aby 2 EP 1 706 157 B1 autologiczne hodowane komórki krążka międzykręgowego nie zmieniały swoich właściwości w okresie od pobrania do przeszczepu oraz aby wykazywały wysoką zdolność proliferacji i różnicowania. [0009] Nieoczekiwanie wykazano, że jako materiał wyjściowy można zastosować chorą tkankę krążka międzykręgowego. Dotychczas zakładano, że nie jest to możliwe, aby ze zdegenerowanej tkanki wyizolować dorosłe komórki w wystarczającej ilości, takie, które są żywotne, wystarczająco proliferują i w końcu nadal są zdolne do tkankowo specyficznego różnicowania i odbudowy tkanki krążka międzykręgowego, ponieważ w tkankach, które ulegają degeneracji, komórki tkankowo specyficzne zmieniają swoje właściwości w aspekcie syntezy macierzy, a także obumierają i są zastępowane przez inne komórki o innych niespecyficznych tkankowo właściwościach. Niespodziewanie jednak możliwe było wyizolowanie w szczególności z wypadniętej, zdegenerowanej tkanki krążka międzykręgowego wystarczającej liczby żywotnych komórek. Wypadnięta i zdegenerowana tkanka krążka międzykręgowego składa się z części krążka międzykręgowego: pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego, przy czym później komórki wyizolowane z obydwu obszarów tkankowych (komórki pierścienia włóknistego i komórki jądra miażdżystego) w danych warunkach hodowli autologicznej wciąż proliferują i szczególnie specyficznie ulegają tkankowo specyficznemu różnicowaniu. Z tego względu te przeszczepy mieszanych komórek są odpowiednie do terapii opartej na komórkach w celu przywrócenia funkcji krążka międzykręgowego. [0010] Po raz pierwszy opisano zatem sposób, którym mogą być wytworzone specjalne autologiczne przeszczepy mieszanych komórek krążka międzykręgowego, które po przeszczepie do uszkodzonego/ chorego krążka międzykręgowego, dzięki odbudowie nowej tkanki krążka międzykręgowego umożliwiają utrzymywanie krążka, a tym samym przywrócenie neurologicznej i mechanicznej funkcji kręgosłupa w przypadku schorzenia krążka międzykręgowego lub po przepuklinie krążka międzykręgowego. [0011] Nawet przy zaawansowanej degeneracji krażka międzykręgowego, tzn. nawet w przypadku zwyrodnienia lub urazowego uszkodzenia zewnętrznej warstwy krążka międzykręgowego (pierścień włóknisty), możliwe jest dzięki niniejszemu wynalazkowi przywrócenie i utrzymanie neurologicznej, biologicznej i mechanicznej funkcji krążka międzykręgowego, gdy z wypadniętych, zdegenerowanych krążków międzykręgowych wyizoluje się mieszane komórki tkanki, które następnie podda się hodowli z wytworzeniem 3-wymiarowej tkanki bez użycia materiałów nośnikowych. Wyizolowana tkanka krążka międzykręgowego, tzn. komórki krążka międzykręgowego, namnażana jest w warunkach hodowli autologicznej tylko z dodatkiem własnej surowicy pacjenta w pożywce do hodowli komórek w monowarstwie. Korzystnie, komórki krążka międzykręgowego wyizolowane z wypadniętej, zdegenerowanej tkanki krążka międzykręgowego w czasie namnażania hodowane są w pożywce do hodowli komórkowej zawierającej 1-20% surowicy autologicznej, w której stosunek pożywki alfa-MEM i pożywki HAM-F12 wynosi od 2:1 do 1:2, oraz w 36,8-37°C, przy 5%-owym udziale dwutlenku węgla w powietrzu i przy wilgotności powierza 85-95%, przy czym synteza przez nie macierzy i białek markerowych nie zmienia się. [0012] Korzystne jest również, gdy wyizolowane komórki krążka międzykręgowego po ich namnażaniu w monowarstwie, hodowane są w pożywce do hodowli komórkowej, która zawiera 1-20% surowicy autologicznej i w której stosunek pożywki alfa-MEM do pożywki HAM-F12 wynosi od 2:1 do 1:2 i w 36,837°C, przy 5%-owej zawartości dwutlenku węgla w powietrzu i wilgotności powietrza 85-95%, i dzięki temu są zdolne do różnicowania i tworzą struktury macierzy, które zawierają specyficzne białka macierzy krążków międzykręgowych. 3 EP 1 706 157 B1 [0013] Korzystne jest ponadto, gdy wyizolowane komórki krążka międzykręgowego po ich namnażaniu w monowarstwie, zostaną zamrożone w roztworze 10% DMSO, 20% surowicy i 70% pożywki hodowlanej i ponownie rozmrożone, przy czym ich właściwości w aspekcie syntezy specyficznych składników macierzy i markerów nie zmieniają się i struktury tkankowe składające się z białek macierzy specyficznych dla krążków międzykręgowych, odbudowują się in vitro i in vivo. [0014] Opisane cechy nie zmienionej syntezy białek markerowych i macierzowych nie stanowią celu lub pożądanej funkcji, które należy osiągnąć, lecz są konsekwencją etapów hodowli. Wymienianie tych cech ma na celu wyłącznie wyjaśnienia. Dzięki ujawnieniu tych cech powinno stać się jasne, jakie są konsekwencje etapów stosowania lub etapów sposobu według wynalazku. [0015] Tworzenie się struktur macierzowych, które zawierają specyficzne białka macierzy krążków międzykręgowych, nie jest więc pożądaną właściwością, lecz tworzenie się wspomnianych struktur macierzowych wynika z warunków hodowli. [0016] Korzystnie, komórki wyizolowane z tkanki krążka międzykręgowego hoduje się w naczyniu do hodowli o powierzchni hydrofobowej i zwężającym się dnie, dzięki czemu otrzymuje się trójwymiarowe agregaty komórek. [0017] Przy leczeniu za pomocą przeszczepów komórek krążka międzykręgowego według wynalazku, korzystne jest, gdy przed przeszczepieniem zewnętrzna otoczka krążka międzykręgowego, pierścień włóknisty, który uległ uszkodzeniu wskutek wypadnięcia tkanki krążka międzykręgowego, leczony jest w taki sposób, że żaden płyn, jak wytworzony przeszczep komórkowy, nie może już wypływać z wnętrza krążka międzykręgowego. Okres ten jest zależny od pacjenta. Podczas tego okresu, wytwarza się przeszczepy komórek krążka międzykręgowego, przy czym mieszane komórki krążka międzykręgowego podczas namnażania w hodowli komórkowej utrzymują swoje specyficzne właściwości w aspekcie potencjału różnicowania i tym samym zapewniają powodzenie przeszczepu. Natomiast potencjał ten przy oddzielnej hodowli komórek pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego obniża się, przez co po przeniesieniu do środowiska 3-wymiarowego, niektóre markery specyficzne dla krążków międzykręgowych nie są ekspresjonowane. Dlatego tylko mieszane hodowle są szczególnie odpowiednie do budowania tkanki krążka międzykręgowego po ich przeszczepieniu do zdegenerowanego krążka międzykręgowego. [0018] Ponadto, wytworzone in vitro przeszczepy komórek i tkanek nie powinny wywoływać reakcji immunologicznych w organizmie, który otrzyma przeszczep. Nieoczekiwanie stwierdzono, że te zgodnie z wynalazkiem autologicznie wytworzone komórki i tkanki nie wywałują żadnych immunologicznych reakcji. [0019] Pobrana, własna chora tkanka krążka międzykręgowego pacjenta może być dalej przetwarzana na różne sposoby: (a) Z biopsji konwencjonalnymi metodami izoluje się mieszane komórki krążka międzykręgowego poprzez enzymatyczny rozkład tkanki, drogą migracji lub z użyciem odczynników, które rozpoznają komórki docelowe. Komórki te namnaża się następnie tylko z dodatkiem endogennej surowicy i bez dodawania egzogennych pobudzających wzrost związków i bez dodatku antybiotyków, w standardowej pożywce hodowlanej w naczyniach do hodowli komórkowej oraz przez tak długi czas, aż uzyska się wystarczającą ilość komórek do dyspozycji (Fig. 2). Czas ten jest tak krótki, jak to możliwe, tak aby uniknąć zmiany właściwości fenotypowych komórek. Po dostatecznym namnożeniu komórek, są one zbierane i przeszczep komórkowy składający się z zawiesiny komórek krążka międzykręgowego jest 4 gotowy do zastosowań terapeutycznych. EP 1 706 157 B1 Zgodnie z wynalazkiem, wyizolowane komórki krążka międzykręgowego stosowane są w mieszaninie, tzn. komórki nie są rozdzielane na komórki pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego, których proporcje w tkance uległej wypadnięciu tkance krążka międzykręgowego zostają zachowane, i hodowane oddzielnie lub jako jeden rodzaj komórek. Tylko w tych warunkach mieszanych uzyskuje się później lepsze specyficzne różnicowanie w komórki krążka międzykręgowego (zob. Fig. 3). Ta autologiczna technika hodowli mieszanej do namnażania komórek krążka międzykręgowego dzięki temu po raz pierwszy umożliwia specyficzne dla krążka międzykręgowego różnicowanie komórek hodowanych tym sposobem, po przeniesieniu ich do 3-wymiarowego środowiska. (b) W kolejnym sposobie, wyizolowane komórki krążka międzykręgowego są wstępnie hodowane i namnażane krótko bez pasażowania komórek. Następnie, wstępnie hodowane komórki zbiera się i zamraża oraz przechowuje w stanie zamrożonym do czasu przeszczepu. Przed przeszczepem, komórki są rozmrażane i dalej hodowane wraz z autologiczną surowicą i w konwencjonalnej pożywce do hodowli komórek aż do uzyskania wystarczającej ilości komórek. Po wystarczającym namnożeniu się komórek, zbiera się je i dostarcza przeszczep komórkowy składajacy się z zawiesiny komórek krążka międzykręgowego. Nieoczekiwanie stwierdzono, że komórki krążka międzykręgowego po zamrożeniu i rozmrożeniu nie tracą swoich specyficznych właściwości w odniesieniu do syntezy specyficznych białek markerowych i macierzowych (patrz: Fig. 5), (c) W innym korzystnym sposobie, jako materiał wyjściowy stosuje się również własną chorą tkankę krążka międzykręgowego pacjenta. Z biopsji konwencjonalnymi metodami izoluje się tworzące tkankę komórki z pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego poprzez enzymatyczny rozkład tkanki, drogą migracji lub z użyciem odczynników, które rozpoznają komórki docelowe. Te mieszane komórki namnaża się następnie w autologicznych warunkach i w standardowej pożywce hodowlanej, a następnie przenosi do naczyń do hodowli komórkowej o hydrofobowej powierzchni i zwężającym się dnie i tam hoduje przez tak długi czas, aż powstanie trójwymiarowy agregat komórek, zawierający co najmniej 40% objętościowych, korzystnie co najmniej 60% objętościowych, co najwyżej 99% objętościowych zewnątrzkomórkowej zsyntetyzowanej od nowa macierzy (ECM), w której osadzone są zróżnicowane komórki. Znawca może określić te wartości poprzez pobranie mniejszych próbek. Powstały agregat komórek posiada obszar zewnętrzny, gdzie obecne są komórki zdolne do proliferacji i migracji (patrz: Fig. 1), [0020] Zgodnie z wynalazkiem, wyizolowane komórki krążka międzykręgowego stosowane są w mieszaninie, tzn. komórki nie są rozdzielane na komórki pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego, i hodowane oddzielnie lub jako jeden rodzaj komórek. Tylko te mieszane warunki sprzyjają 3-wymiarowej hodowli i dzięki temu poprzez tworzenie 3-wymiarowej tkanki krążka międzykręgowego sprzyjają specyficznemu dla krążków międzykręgowych różnicowaniu mieszanych komórek, przy czym ekspresja markerów specyficznych dla krążków międzykręgowych może być uzyskana tylko w tych kulturach, a tworzenie 3-wymiarowej tkanki krążka międzykręgowego wspierane jest dzięki zastosowaniu mieszanych kultur (patrz: Fig. 3). Ta autologiczna technika hodowli mieszanej tym samym pozwala po raz pierwszy na 5 EP 1 706 157 B1 wytwarzanie i stosowanie specyficznego dla krążków międzykręgowych przeszczepu tkanki, który został przygotowany autologicznie z wypadniętej zdegenerowanej tkanki krążka międzykręgowego. [0021] Komórki mieszane krążka międzykręgowego, które są wyizolowane z chorej tkanki krążka międzykręgowego i z których wytwarza się autologiczne 3-wymiarowe agregaty komórek krążka międzykręgowego tak, że pobrane komórki są zintegrowane ze zsyntezowaną od nowa tkanką, przeżywają nawet po wydłużeniu czasu hodowli, tzn. komórki wewnątrz agregatów nie obumierają. Wraz z wydłużeniem czasu trwania hodowli komórki wewnątrz agregatów ulegają różnicowaniu i tworzy się tkanka chrzęstna krążka międzykręgowego, która składa się z ECM, zróżnicowanych komórek i strefy proliferacji na krawędzi (patrz: Fig.1). W czasie różnicowania w autologicznej hodowli komórek, odległość pomiędzy zagregowanymi komórkami zwiększa się wskutek tworzenia tkankowo specyficznej macierzy (patrz: Fig. 3 porównanie (3c) z (3d)). We wnętrzu wytworzonej in vitro tkanki krążka międzykręgowego powstaje tkanka o histologii bardzo podobnej do naturalnej tkanki. Podczas dalszego przygotowywania tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego na jej krawędzi tworzy się "strefa proliferacji". Strefa ta posiada tę ogromną zaletę, że po wprowadzeniu otrzymanej w ten sposób tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego do zdegenerowanych krążków międzykręgowych, znajdujace się w tej strefie na krawędzi komórki są zdolne do migracji i aktywnego tworzenia kontaktu z otaczającą tkanką, względnie umożliwiają integrację wytworzonej in vitro tkanki chrzęstnej krażka międzykręgowego z jej otoczeniem. Zatem wytworzone specyficzne tkankowo agregaty komórek doskonale nadają się do budowy od nowa tkanki krążka międzykręgowego in vivo. [0022] Ze względu na obciążenie biomechaniczne krążków międzykręgowych zaraz po leczeniu oraz celem przywrócenia krążkowi miedzykręgowemu jego wysokości za pomocą przeszczepu tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego, korzystny może być przeszczep jeszcze większych i mechanicznie stabilnych fragmentów tkanki. W tym przypadku, co najmniej dwa, a korzystnie więcej otrzymanych in vitro tkanek chrzęstnych krążka międzykręgowego łączy się, kontynuując ich hodowlę wspólnie w takich samych warunkach i w tych samych naczyniach hodowlanych, jak opisano powyżej, aż do pożądanej wielkości (patrz również: Fig. 4). [0023] Jako pożywkę do hodowli komórkowej można stosować pożywkę typową zarówno dla zawiesiny, jak również dla hodowli w monowarstwie, np. MEM Dulbecco z dodatkiem surowicy. Korzystnie stosuje się DMEM i Ham w stosunku 1:1. Jednak w celu zapobieżenia reakcjom immunologicznym pacjenta na tkankę uzyskaną in vitro, jako surowicę stosuje się autologiczną surowicę pacjenta. [0024] Do pożywki hodowlanej zgodnie z wynalazkiem nie dodaje się antybiotyków, fungistatyków lub innych substancji pomocniczych. Okazało się, że tylko autologiczna hodowla komórek i agregatów komórek oraz hodowla bez stosowania antybiotyków i fungistatyków umożliwia niewpływanie na proliferację oraz różnicowanie komórek w hodowli w monowarstwie oraz niezakłócone tworzenie specyficznej macierzy w agregatach komórek. Ponadto dzięki zrezygnowaniu z substancji dodatkowych podczas wytwarzania i wprowadzania wytworzonej in vitro tkanki do ludzkiego, lecz także zwierzęcego organizmu, wyeliminowane są reakcje immunologiczne. [0025] Wielkość wytworzonej tkanki krążka międzykręgowego zależy od liczby zastosowanych komórek na objętość pożywki hodowlanej. Na przykład, gdy wprowadzi się 1 x 107 komórek do 300 ?l pożywki hodowlanej, wówczas w czasie 1 tygodnia powstają trójwymiarowe agregaty komórek krążka międzykręgowego o średnicy ok. 500-700 ?m. Inną możliwością jest fuzja in vitro małych agregatów komórek z utworzeniem większych - jak opisano powyżej - i wprowadzenie ich do krążka 6 EP 1 706 157 B1 międzykręgowego. Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem stosuje się w zakresie od 1 x 104 do 1 x 107 komórek w 300 ?l pożywki hodowlanej do wytwarzania małych agregatów komórek, szczególnie korzystnie 1 x 105 komórek. Utworzone po kilku dniach in vitro tkanki krążka międzykręgowego są następnie hodowane w odpowiedniej pożywce hodowlanej przez co najmniej 2-4 tygodnie, w zależności od typu komórki i specyficznych cech pacjenta, w celu indukcji wytwarzania tkankowo specyficznej macierzy. W szczególnym przypadku pojedyncze tkanki krążka międzykręgowego, począwszy od ok. 1 tygodnia hodowli, można potem poddawać fuzji in vitro tak, aby zwiększyć wielkość fragmentu tkanki. [0026] Jako naczynia do hodowli komórkowej w zawiesinie według wynalazku stosuje się takie o hydrofobowej, a zatem eliminującej adhezję powierzchni, jak np. polistyrenowe lub teflonowe. Naczynia do hodowli komórkowej o niehydrofobowej powierzchni mogą być hydrofobizowane przez powlekanie agarem lub agarozą. Inne dodatki nie są wymagane. Korzystnie jako naczynia do hodowli komórkowej stosuje się płytki studzienkowe. Do wytwarzania małych agregatów komórkowych można przy tym zastosować na przykład płytki 96-studzienkowe, a do wytwarzania fuzjowanych agregatów ? płytki 24-studzienkowe. [0027] Opisana jest również technika chirurgicznego przeszczepiania komórek krążka międzykręgowego i wytwarzanej in vitro 3-wymiarowej tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego do uszkodzonego krążka międzykręgowego. Przeszczep jest przeprowadzany przez iniekcję komórek krążka międzykręgowego z kontrolą fluoroskopiową, po dezynfekcji skóry, sterylnym przykryciu powierzchni skóry i przy miejscowym znieczuleniem, korzystnie ściśle unikając stosowania środków kontrastowych. W tym celu, przeszczepy komórek krążka międzykręgowego, zwłaszcza po ich wytworzeniu w laboratorium, wprowadza się do specjalnych rurek transportujących o zwężającym się końcu, zaokrąglonym lub zaostrzonym, i w sali operacyjnej wciąga do strzykawki za pomocą np. igły punkcyjnej z np. skośną końcówką kaniuli. Zwłaszcza dzięki skośnemu dnu naczynia do transportu i skośnej końcówce kaniuli możliwe jest całkowite pobranie roztworu zawierającego komórki. W celu zapewnienia doprowadzania komórek do krążka międzykręgowego bez uszkodzenia komórek i przy najmniejszej możliwej utracie płynu, a zatem i komórek, igła punkcyjna ma zasadniczo średnicę wewnętrzną od 0,4 do 2 mm. Przeszczep drogą iniekcji komórek krążka międzykręgowego do przeznaczonego do leczenia krążka międzykręgowego przeprowadza się w szczególności po przeciwległej stronie względem wcześniej operowanej strony krążka międzykręgowego (usunięcia wypadniętego krążka międzykręgowego) za pomocą igły punkcyjnej ze skośną końcówką. Iniekcja przeszczepu komórek odbywa się pod kontrolą fluoroskopową, ponieważ rzeczywiste dostarczenie komórek do przestrzeni wewnętrznej krążka międzykręgowego musi być kontrolowane. Typowo można zastosować środki kontrastowe, które jednak uszkadzają komórki, co może uniemożliwić powodzenie przeszczepu. Po dostarczeniu komórek krążka międzykręgowego do obszaru krążka międzykręgowego, wyciąga się igłę punkcyjną z krążka międzykręgowego. Pacjent pozostaje w łóżku bezwzględnie przez korzystnie 12 godzin, po czym następuje 12-24 godzin zwykłego pozostawania w łóżku i 24-48 godzin pozostawania w łóżku z ćwiczeniami fizjoterapeutycznymi. Potem następuje np. kilkutygodniowa stabilizacja kręgosłupa przy pomocy konwencjonalnej odpowiedniej ortezy. [0028] Przeszczepienie 3-wymiarowych, wytworzonych in vitro przeszczepów chrząstki krążka międzykręgowego odbywa się jak dla komórek krążka międzykręgowego, w szczególności za pomocą igły punkcyjnej. Aby zapewnić uniknięcie mechanicznego i w ten sposób biologicznego uszkodzenia przeszczepów chrząstki krążka międzykręgowego podczas wstrzykiwania, stosuje się igłę punkcyjną posiadające średnicę wynoszącą co najmniej 500 ?m. Ponadto celem uniknięcia uszkodzenia mechanicznego przeszczepów chrząstki krążka międzykręgowego prowadzi sie tylko jednokrotny pasaż 7 EP 1 706 157 B1 przez iglę punkcyjną. W związku z tym przeszczepy chrząstki krążka międzykręgowego po ich wytworzeniu w laboratorium są przenoszone do strzykawki, na której potem w sali operacyjnej zamocowuje się jeszcze tylko igłę punkcyjną. Również w tym przypadku igła punkcyjna zgodnie z wynalazkiem musi posiadać skośną końcówkę, aby przez powiększoną powierzchnię wyjścia umożliwić szybkie dostarczenie przeszczepów chrząstki krążka międzykręgowego w najmniejszej możliwej objętości cieczy (objętości dostarczania). Potem następuje iniekcja, jak opisana powyżej dla przeszczepów komórek. [0029] Przedmiotem wynalazku są również preparaty lecznicze, które zawierają przeszczepy komórek krążka międzykręgowego według wynalazku i tkankę chrzęstną krążka miedzykręgowego, np. roztwory do iniekcji. [0030] Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego według wynalazku do badania substancji czynnych, które np. wpływają na tworzenie i różnicowanie macierzy i komórek. W tym celu, wytwarzane są agregaty komórek krążka międzykręgowego według wynalazku i w różnych stadiach dojrzałości dodawane są testowane leki i charakteryzowane są różne parametry wytwarzania in vitro i dojrzewania tkanki krążka międzykręgowego. Badania te w porównaniu z konwencjonalnym testowaniem leków na zwierzętach lub układach komórek nowotworowych, dzięki zastosowaniu jedynie autologicznego materiału są specyficzna dla pacjenta i umożliwiają indywidualną diagnozę. [0031] Wynalazek zostanie poniżej objaśniony bardziej szczegółowo w przykładach wykonania, do których nie jest on jednak ograniczony. Przykłady wykonania Przykład 1: Wytwarzanie przeszczepów komórek krążka międzykręgowego [0032] Z chorej tkanki krążka międzykręgowego za pomocą trawienia enzymatycznego drogą inkubacji z roztworem kolagenazy, z pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego wyizolowano komórki chrzęstne krążka międzykręgowego. Po oddzieleniu wyizolowanych komórek z niestrawionej tkanki, przenosi sie je jako populacje komórek mieszanych do butelek do hodowli komórkowych i dodając pożywkę hodowlaną DMEM/Hams F12 (1/1) oraz 10% autologicznej surowicy pacjenta inkubuje w 37°C i 5% CO2. Dwa razy w tygodniu zmienia się pożywkę. Po osiągnięciu stanu konfluencji warstwę komórek przemywa się roztworem soli kuchennej i zbiera przy pomocy trypsyny z powierzchni hodowli komórkowej. Po kolejnym przemyciu komórki krążka międzykręgowego przenosi się do roztworu soli kuchennej i udostępnia do przeszczepu. [0033] W modelu in vitro można było wykazać potencjał różnicowania komórek krążka międzykręgowego zawartego w przeszczepie komórkowym. Ekspresjonowane są specyficzne dla krążków międzykręgowych białka macierzy i białka markerowe (Fig. 3), a tym samym tworzy się specyficzna dla krążków międzykręgowych struktura tkankowa. Przykład 2: Przeszczep komórek chrzęstnych krążka międzykręgowego [0034] Przeszczepy komórek krążka międzykręgowego wytworzone w Przykładzie 1 (min. 1000 komórek, maks. 100 milionów komórek), korzystnie ok. 1 milion komórek chrzęstnych krążka międzykręgowego wprowadzono do roztworu soli kuchennej i wstrzyknięto do chorego krążka międzykręgowego. Stwierdzono 8 EP 1 706 157 B1 między innymi, że w leczonym krążku międzykręgowym zawartość wody znowu wzrasta, a wysokość przestrzeni pomiędzy kręgami może być utrzymana na właściwym poziomie, co w obydwu przypadkach można przypisać białkom macierzy zsyntetyzowanym przez komórki chrzęstne krążka międzykręgowego. [0035] Wytworzone in vitro przeszczepy komórek krążka międzykręgowego przyjęły się u pacjentów, zapewniając szybkie włączenie zdolnych do proliferacji i migracji komórek oraz regenerację tkanki krążka międzykręgowego dzięki zdolności do różnicowania zawartych w nich komórek. Zatem przeszczepy komórek krążka międzykręgowego umożliwiają szybką odbudowę tkanki krążka międzykręgowego, szybki powrót do zdrowia pacjentów oraz przywrócenie funkcji krążka międzykręgowego. Przykład 3 Wytwarzanie in vitro tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego [0036] Z wypadniętej tkanki krążka międzykręgowego za pomocą trawienia enzymatycznego drogą inkubacji z roztworem kolagenazy z pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego wyizolowano komórki chrzęstne krążka międzykręgowego. Po oddzieleniu wyizolowanych komórek z niestrawionej tkanki, przenosi się je jako kulturę mieszaną do butelek do hodowli komórkowych i dodając pożywkę hodowlaną DMEM/Hams F12 (1/1) oraz 10% autologicznej surowicy pacjenta inkubuje w 37°C i 5% CO2. Dwa razy w tygodniu zmienia się pożywkę. Po osiągnięciu stanu konfluencji warstwę komórek przemywa się roztworem soli kuchennej i zbiera przy pomocy trypsyny z powierzchni hodowli komórkowej. Po kolejnym przemyciu 1 x 105 komórek przenosi się każdorazowo do jednego naczynia do hodowli komórek, pokrytego agarozą. Po jednym dniu pierwsze komórki organizują się w agregaty. Agregaty te są regularnie zaopatrzane w świeżą pożywkę i hodowane przez co najmniej 2 tygodnie. [0037] Strukturę otrzymanej tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego obrazuje zdjęcie mikroskopowe na Fig. 1, które przedstawia przekrój wytworzonej zgodnie z wynalazkiem tkanki krążka międzykręgowego z ECM jako strefą o zmniejszonej proliferacji i tworzenia specyficznych tkankowo białek macierzy oraz P jako zewnętrzną strefą proliferacji. [0038] W tych tkankach krążka międzykręgowego in vitro wykryto ekspresję i deponowanie specyficznych dla krążka międzykręgowego składników macierzy i białek regulatorowych, takich jak agrekan (Fig. 3a), specyficznych względem hialiny proteoglikanów (Fig. 3b), kolagen typu I (Fig. 3c), kolagen typu II (Fig. 3d) i kolagen typu III (Fig. 3e). Są to składniki natywnej tkanki chrzęsnej krążka międzykręgwego in vivo i stanowią główne białka strukturalne, które mają decydujące znaczenie dla funkcji chrząstki krążka międzykręgowego. [0039] Zaskakujące było to, że wyizolowane z chorej tkanki krążka międzykręgowego komórki krążka międzykręgowego, gdy hodowane są jako mieszanina pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego, wykazują wysoką zdolność proliferacji (Fig. 2), a także bardzo wysoki potencjał różnicowania w kierunku tworzenia specyficznych dla krążka międzykręgowego białek macierzy i białek regulatorowych (patrz także: Fig. 3), a ich właściwości po procedurze zamrażania i rozmrażania mogą zostać zachowane (patrz także: Fig. 5), Przykład 4: Przeszczepianie tkanki chrzęstnej krążka międzykręgowego [0040] Wytworzone w Przykładzie 3 tkanki chrzęstne krążka międzykręgowego (ok. 10 do 1000 fragmentów tkankowych po 1*105 komórek każdy), korzystnie 100 fragmentów tkankowych w roztworze 9 EP 1 706 157 B1 soli kuchennej pobrano do strzykawki już w laboratorium i wstrzyknięto do przestrzeni międzykręgowej chorego lub uszkodzonego krążka międzykręgowego przy pomocy igły punkcyjnej o skośnym końcu. Wytworzona zgodnie z wynalazkiem in vitro tkanka chrzęstna krążka miedzykręgowego przyjęła się u pacjentów, zapewniając poza spełnianiem mechanicznej funkcji przez wytworzoną tkankę, szybkie włączenie wytworzonych fragmentów tkanki poprzez zdolne do proliferacji i migracji komórki w zewnętrznej warstwie agregatów oraz regenerację tkanki krążka międzykręgowego dzięki zdolności do różnicowania zawartych tam komórek. Zatem struktura i funkcja fragmentów tkankowych umożliwiają szybką odbudowę tkanki krążka międzykręgowego, szybki powrót do zdrowia pacjentów oraz przywrócenie funkcji krążka międzykręgowego. [0041] Fig. 4 przedstawia pięć połączonych tkanek krążka międzykręgowego. Można zauważyć, że kulki tkanki trzymają się razem i w pewien sposób stapiają się, granica między dwiema tkankami krążka międzykręgowego nie jest już widoczna. Po dłuższym czasie hodowli tkanki krążka miedzykręgowego ulegają fuzji całkowicie i powstaje in vitro duży fragment tkanki. Budowa tak otrzymanych większych agregatów komórek jest porównywalna z tkanką krążka międzykręgowego in vitro. Mogą one zawierać maksymalnie 99% ECM i komórki tam zawarte są żywotne. 10 EP 1 706 157 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania autologicznych przeszczepów mieszanych komórek krążka międzykręgowego znamienny tym, że ze zdegenerowanej, wypadniętej tkanki krążka międzykręgowego i/lub chorej tkanki krążka międzykręgwoego izoluje się żywotne komórki jako mieszaninę części krążka międzykręgowego z pierścienia włóknistego i jądra miażdżystego, hoduje się jako monowarstwę tylko z dodatkiem własnej surowicy organizmu w pożywce hodowlanej i bez dodatku egzogennych związków stymulujących wzrost oraz bez dodatku antybiotyków, i w ten sposób uzyskuje się przeszczepy komórek krążka międzykręgowego, które składają się z zawiesiny komórek krążka międzykręgowego. 2. Sposób wytwarzania autologicznych przeszczepów mieszanych komórek krążka międzykręgowego według zastrz. 1, dodatkowo znamienny tym, że że wymienione przeszczepy komórek krążka międzykręgowego są następnie hodowane z wytworzeniem autologicznej 3-wymiarowej tkanki bez użycia materiałów nośnikowych. 3. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1 albo 2, dodatkowo znamienny tym, że podczas namnażania wyizolowane ze zdegenerowanej, wypadniętej tkanki krążka międzykręgowego komórki krążka międzykręgowego hodowane są w pożywce do hodowli komórkowej, która zawiera 1-20% dodatku autologicznej surowicy i w której stosunek pożywki alfa-MEM i pożywki HAM-F12 wynosi od 2:1 do 1:2, w 36,8 - 37°C, przy zawartości dwutlenku węgla w powietrzu 5% i przy wilgotności powietrza 85-95%. 4. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że wyizolowane komórki krążka międzykręgowego po ich namnażaniu w monowarstwie, hodowane są w pożywce do hodowli komórkowej, która zawiera 1-20% dodatku autologicznej surowicy i w której stosunek pożywki alfaMEM do pożywki HAM-F12 wynosi od 2:1 do 1:2 i w 36,8-37°C, przy 5%-owej zawartości dwutlenku węgla w powietrzu i wilgotności powietrza 85-95%, i dzięki temu są zdolne do różnicowania i tworzą struktury macierzy, które zawierają specyficzne białka macierzy krążków międzykręgowych. 5. Sposób według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że wyizolowane komórki krążka międzykręgowego po ich namnażaniu w monowarstwie zostają zamrożone w roztworze 10% DMSO, 20% surowicy i 70% pożywki hodowlanej i ponownie rozmrożone, przy czym ich właściwości w aspekcie syntezy specyficznych składników macierzy i markerów nie zmieniają się, a struktury tkankowe składające się z białek macierzy specyficznych dla krążków międzykręgowych odbudowują się in vitro i in vivo. 6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 2 do 5, znamienny tym, że komórki wyizolowane z tkanki krążka międzykręgowego hoduje się w naczyniu hodowlanym o hydrofobowej powierzchni i zwężającym się dnie. 7. Autologiczny przeszczep mieszanych komórek krążka międzykręgowego dający się otrzymać tak, jak określono w którymkolwiek z zastrz. 1 do 6. 8. Autologiczny przeszczep mieszanych komórek krążka międzykręgowego według zastrz. 7, znamienny tym, że jest dostarczany do przeszczepu w strzykawce. 11 EP 1 706 157 B1 9. Zastosowanie autologicznego przeszczepu mieszanych komórek krążka międzykręgowego określonego w zastrz. 7, do badania in vitro substancji czynnych. 10. Komórkowe preparaty lecznicze zawierające autologiczne przeszczepy mieszanych komórek krążka międzykręgowego określone w zastrz. 7. 11. Autologiczny przeszczep mieszanych komórek krążka międzykręgowego określony w którymkolwiek z zastrz. 7 do 8 do stosowania w leczeniu uszkodzeń krążka międzykręgowego. 12 EP 1 706 157 B1 13 EP 1 706 157 B1 14 EP 1 706 157 B1 15 EP 1 706 157 B1 DOKUMENTY ZWIĄZANE CYTOWANE W OPISIE Niniejsza lista dokumentów przytoczonych przez Zgłaszającego podana jest czytającemu jedynie dla udogodnienia i nie tworzy ona części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo podjęcia największej staranności przy sporządzaniu tej listy, nie można wykluczyć błędów i opuszczeń. Europejski Urząd Patentowy nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe przytoczone w opisie ? US 6080579 A [0005] ? US 6340369 B1 [0005] ? US 6648918 B [0005] ? US 6569442 B [0005] ? US 20010020476 A1 [0005] ? US 6344058 B [0005] ? US 2003165473 A [0006] 16
















Grupy dyskusyjne