wp.pl
wp.pl
Najpopularniejszy w Polsce portal o finansach i biznesie
Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 1788077 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 1788077 T3


EP 1788077 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 17.11.2006 06255896.0 (19) PL (11) PL/EP (13) (51) 1788077 T3 Int.Cl. C12N 5/00 (2006.01) A61L 27/00 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 14.09.2016 Europejski Biuletyn Patentowy 2016/37 EP 1788077 B1 C12N 5/071 (2010.01) Tytuł wynalazku: Sposób tworzenia klastrów komórek (30) (43) Pierwszeństwo: 18.11.2005 US 738171 P Zgłoszenie ogłoszono: 23.05.2007 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/21 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.03.2017 Wiadomości Urzędu Patentowego 2017/03 (73) Uprawniony z patentu: PL/EP 1788077 T3 LifeScan, Inc., Wayne, US (72) Twórca(y) wynalazku: RAGAE M. GHABRIAL, Helmetta, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Karina Kaczkowska KULIKOWSKA & KULIKOWSKI ul. Nowogrodzka 47A 00-695 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). 26825/PE/16 EP 1 788 077 B1 Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek dotyczy sposobu indukowania komórek do tworzenia trójwymiarowych klastrów komórek in vitro. Ponadto, wynalazek dotyczy również sposobu kontrolowania rozmiaru i jednorodności takich klastrów. TŁO [0002] W ssaczych tkankach in vivo komórki występują w złożonym trójwymiarowym (3-D) środowisku, w którym komórki rosną, jednorodnie lub niejednorodnie, w trzech wymiarach wokół centralnej komórki lub grupy komórek. Komórki znajdują się w bliskim kontakcie z sąsiednimi komórkami, a także są połączone z siecią macierzy pozakomórkowej (ECM, ang. extracellular matrix) zapewniającą tym komórkom wsparcie. Decyzje o losie komórek zależą od złożonego wzajemnego oddziaływania pomiędzy autonomicznymi sygnałami komórkowymi oraz bodźcami pochodzącymi od komórek otaczających. Uważa się, że kontakt komórek z ECM poprzez integryny wpływa na wiele funkcji komórkowych, takich jak proliferacja, różnicowanie, migracja, apoptoza i kształt komórek. Podsumowując na przykład wcześniejsze badania nad funkcją trzustki, w opisie patentowym US 6703017 doniesiono o niezwykłej strukturze wysepek trzustkowych oraz ich komórkowej organizacji, które idealne nadają się do szybkich, jeszcze precyzyjniej kontrolowanych odpowiedzi na zmiany poziomów glukozy we krwi. [0003] Riedl i in. (Journal of Immunology, 2000, 165:1381-1386) donosi, że rozwój nabłonkowych komórek langerhansa z ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+ w odpowiedzi na kostymulację TGF-?1 wiąże się z wyraźnym tworzeniem klastrów rozwijających się komórek prekursorowych LC. Nabłonkowe komórki langerhansa tworzą trójwymiarową sieć w ponadpodstawnych warstwach naskórkowych in vivo oraz pozostają w naskórku przez długi okres, co pozwala im pełnić funkcję strażników, w ramach której filtrują one otaczającą tkankę względem obcych antygenów. [0004] W celu badania tych procesów komórkowych in vitro, komórki zazwyczaj jednak izoluje się z tkanek i hoduje w monowarstwach, które można przyrównać do dwuwymiarowych (2D) układów hodowlanych, w których komórki hodowane są w warstwach o grubości zaledwie jednej lub dwóch komórek. Tworzenie tego rodzaju warstwy komórek zmienia jednak oddziaływania międzykomórkowe i ECM oraz zmienia złożone współoddziaływanie pomiędzy integrynami a cząsteczkami cytoszkieletu. [0005] Hodowanie komórek w środowisku in vitro, które przypomina środowisko 3-D obserwowane in vivo, jest szczególnie korzystne do umożliwienia bliskiego kontaktu podobnego do prawdziwego środowiska in vivo. To z kolei ma znaczący wpływ na funkcję komórkową. Na następstwa tego zjawiska wyraźnie odpowiadają embrionalne komórki macierzyste (ESC, ang. embryonic stem cells). Gdy umożliwi się komórkom ESC różnicowanie się w hodowli zawiesinowej, to po pewnym czasie spontanicznie utworzą one sferyczne wielokomórkowe agregaty lub ciała embrioidalne (EB, ang. embryoid bodies). Uważa się, że komórki w obrębie EB są zaangażowane w komunikację i organizację na wysokim poziomie, co inicjuje ich różnicowanie do wszystkich trzech listków zarodkowych. [0006] Hodowanie komórek na stałym wsporniku 3-D, takim jak na przykład rusztowanie, jest jedną z metod sztucznego przywracania środowiska 3-D in vivo. Komórki początkowo rosną jednak w monowarstwie po powierzchni wspornika, preferencyjnie przytwierdzając się do podłoża zanim przytwierdzą się one do siebie nawzajem. [0007] Klastry wielokomórkowe były szeroko stosowane w układach in vitro w ciągu ostatnich czterech dekad w celu zbadania na przykład mechanizmów leżących u podstaw organogenezy, odpowiedzi komórek nowotworowych na leczenie oraz interakcji komórek nabłonkowych-mezenchymalnych w nowotworach. Te ponownie zagregowane hodowle komórek wprowadzono po raz pierwszy jako sposób zrozumienia morfogenezy. Zawiesinę pojedynczych komórek uzyskuje się poprzez enzymatyczną i/lub mechaniczną dysocjację oraz poddaje re-agregacji do postaci klastrów 3-D różnymi sposobami. Następnie zapewnia się takie warunki hodowli tkankowej, że siły adhezyjne pomiędzy komórkami są większe niż te względem podłoża, na którym komórki zostały wysiane. W stanie techniki, sposoby namnażania klastrów obejmują wysiewanie komórek w wytrząsarkach obrotowych, butelkach walcowatych lub butelkach wirówkowych, które poruszają się w sposób ciągły, a tym samym uniemożliwiają przyleganie komórek do ścian naczynia. [0008] W US20040096967 przedstawiono na przykład sposób tworzenia EB poprzez hodowanie komórek w hodowli zawiesinowej z zastosowaniem wytrząsania obrotowego. Wadą tej techniki jest destrukcyjny wpływwywierany na komórki przez naprężenia ścinające generowane przez ruch obrotowy. [0009] Klastry komórek mogą się również spontanicznie tworzyć in vitro. W opisie patentowym US 6703017 stwierdzono, że struktury podobne do Wysepek lub wysepki pochodzące od komórek progenitorowych wysepek są wysoce zorganizowanymi strukturami komórek, powstającymi w hodowli pośrednio z komórek macierzystych wytwarzających wysepki. [0010] Inna technika obejmuje po prostu powlekanie powierzchni hodowli tkankowych cienką warstwą agarozy lub innej nieadhezyjnej substancji. W tych warunkach komórki nie są zdolne do przylegania do powierzchni naczyń hodowlanych; w rezultacie wiele typów komórek ulega agregacji homotypowej. [0011] Na przykład w badaniach nad uzyskaniem terapii komórkowej w cukrzycy, Zayas i in. (EP 0 363 125, 1990) ujawnia metodę proliferacji komórek wewnątrzwydzielniczych trzustki. Proces ten polega na zastosowaniu płodowej tkanki trzustki oraz struktury syntetycznej, w tym kolagenu, którą przygotowuje się do osadzenia tych komórek w celu implantacji. [0012] Komórki mogą również tworzyć klastry w odpowiedzi na dodanie składnika do podłoża hodowlanego. Riedl i in. twierdzi na przykład, że ?cytokina TGF-?1 odgrywa kluczową rolę podczas rozwoju i różnicowania nabłonkowych komórek langerhansa. Stosując model różnicowania in vitro hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+ wykazano niedawno, że rozwój LC z komórek progenitorowych CD34+ w systemie hodowlanym wolnym od surowicy jest całkowicie zależny od stymulacji TGF-?1?. [0013] Te techniki, chociaż skuteczne w ułatwianiu tworzeniaklastrów, nie mają jednak możliwości kontrolowania wielkości klastrów ani ich jednorodności. Kiedy w zawiesinie powstaną już klastry, to kontynuują one zwiększanie rozmiaru poprzez dodawanie innych komórek lub agregację z sąsiednimi klastrami. To ostatecznie redukuje dyfuzję tlenu i składników odżywczych do wewnętrznej części klastra i inicjuje kaskadę zdarzeń prowadzących do śmierci komórek w rdzeniu klastra. 2 STRESZCZENIE [0014] Wynalazek obejmuje, między innymi, sposób kontrolowanego tworzenia klastrów komórek in vitro. Klastry według wynalazku mogą być tworzone z grup pojedynczych komórek, klastrów komórek lub ich kombinacji. Komórki tworzące klaster mogą być jednego typu lub kilku typów. Mogą być one komórkami macierzystymi lub pierwotnymi lub namnożonymi komórkami niezróżnicowanymi lub komórkami częściowo do w pełni zróżnicowanymi i/lub genetycznie zaprojektowanymi. Komórki można indukować do inicjacji grupowania się, gdy są one w monowarstwie lub w zawiesinie. [0015] Sposób in vitro według wynalazku obejmuje dodatkowo etapy kontrolowania optymalnego rozmiaru klastra oraz zapobiegania dalszej agregacji, która może zachodzić pomiędzy uformowanymi klastrami. Sposób może ponadto obejmować etapy manipulacji komórkami tworzącymi klastry przed, w trakcie lub po utworzeniu klastrów. [0016] W jednym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób tworzenia klastrów komórek in vitro, obejmujący: a) selekcję grupy komórek do utworzenia klastrów, gdzie komórkami są komórki trzustkowe, komórki pochodzące z płynu owodniowego lub kohodowla komórek trzustkowych i komórek pochodzących z płynu owodniowego; b) namnożenie komórek w monowarstwie; c) utworzenie zawiesiny komórek w płynnym podłożu zawierającym surowicę w stężeniu od około 2% do około 10%; d) inkubację podłoża zawierającego komórki w przestrzeni objętościowej związanej przez powierzchnię, oraz; e) ograniczenie przytwierdzania komórkowego do powierzchni; gdzie powierzchnia posiada obszar powierzchni, a etap ograniczenia przytwierdzania komórkowego do powierzchni obejmuje ograniczenie obszaru powierzchni dostępnego dla przytwierdzania komórkowego. [0017] W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób tworzenia klastrów komórek in vitro, obejmujący: a. selekcję grupy komórek do utworzenia klastrów, gdzie komórkami są komórki trzustkowe, komórki pochodzące z płynu owodniowego lub kohodowla komórek trzustkowych i komórek pochodzących z płynu owodniowego; b. namnożenie komórek w monowarstwie; c. utworzenie zawiesiny podgrupy komórek w płynnym podłożu zawierającym surowicę w stężeniu od około 2% do około 10%; d. wprowadzenie podłoża zawierającego podgrupę komórek do przestrzeni objętościowej związanej przez powierzchnię; e. umożliwienie podgrupie komórek przylgnięcia do powierzchni; f. usunięcie komórek z podgrupy komórek, które nie przylgnęły do powierzchni; g. wprowadzenie pozostałych komórek; oraz h. umożliwienie pozostałym komórkom przylgnięcia do komórek przylegających do powierzchni; gdzie powierzchnia posiada obszar powierzchni, a etap umożliwienia podgrupie komórek przylgnięcia do powierzchni obejmuje etap ograniczenia obszaru powierzchni dostępnego dla adherencji komórkowej. [0018] Tworzenie klastra według tego sposobu obejmuje etapy ograniczenia lub całkowitej eliminacji przytwierdzania komórek do powierzchni poprzez 3 modyfikację tej powierzchni. Ograniczenie przytwierdzania można zatem wykonać poprzez modyfikację podłoża do hodowli komórek w celu dalszego zwiększenia lub zmniejszenia przytwierdzania komórek. Alternatywnie, może to zostać wykonane poprzez wprowadzenie komórek na powierzchnię traktowaną, która została zmodyfikowana w celu umożliwienia przytwierdzenia komórek tylko do wybranych miejsc na tej powierzchni. [0019] W jeszcze innym wykonaniu, zaaplikowanie do podłoża hodowlanego w sposób zależny od czasu pewnych składników, które nie na początku, ale ostatecznie ograniczą lub zapobiegną przytwierdzaniu komórek do powierzchni, a tym samym zaindukują tworzenie klastrów. Jako pierwsze można zastosować na przykład składniki zwiększające przytwierdzanie komórek, a następnie, w celu uniemożliwienia dalszej agregacji pomiędzy już utworzonymi klastrami, kolejno inne czynniki, które zmniejszają przytwierdzanie komórek. [0020] Przedmiotem tego wynalazku jest również sposób kontrolowania rozmiaru klastra in vitro. W jednym wykonaniu, w celu kontroli rozmiaru klastra dostosowuje się stężenie surowicy w podłożu hodowlanym. [0021] W innym wykonaniu, początkowa gęstość wysiewania komórek stanowi element wykorzystywany do kontroli rozmiaru klastra. [0022] Wynalazek ten obejmuje również sposób in vitro zastosowania komórek lub grupy komórek lub klastra komórek posiadających pewne właściwości modyfikujące inne komórki, które mogą być dodawane do klastra. OPIS RYSUNKU [0023] Figura 1 przedstawia typową morfologię komórek pochodzenia trzustkowego rosnących w hodowli jednowarstwowej. Figura 2 przedstawia morfologię komórek pochodzących z płynu owodniowego rosnących w hodowli jednowarstwowej. Figura 3 przedstawia klastry komórek pochodzenia trzustkowego utworzone w hodowli zawiesinowej z surowicą na poziomie 2%. Figura 4 przedstawia klastry komórek pochodzenia trzustkowego utworzone w hodowli zawiesinowej z surowicą na poziomie 10%. Figura 5 przedstawia klastry komórek pochodzenia trzustkowego utworzone w hodowli zawiesinowej zawierającej 0,5E6 komórek z surowicą na poziomie 2%. Figura 6 przedstawia klastry komórek pochodzenia trzustkowego utworzone w hodowli zawiesinowej zawierającej 1,0E6 komórek z surowicą na poziomie 2%. Figura 7 przedstawia klastry komórek rosnących na zewnątrz od krawędzi, która została utworzona sterylnym skalpelem na pokrytej hydrożelem słabo przytwierdzającej płytce. Figura 8 przedstawia ko-klaster złożony z komórek pochodzenia trzustkowego na czerwono oraz z komórek pochodzenia owodniowego na zielono, utworzony w hodowli zawiesinowej zawierającej oba typy komórek w stosunku 1:1. Figura 9 przedstawia komórki przytwierdzone do wyspy pokrytej kolagenem IV w 12 godzin po inkubacji. Figura 10 przedstawia tworzenie klastrów przez komórki przytwierdzone do wyspy pokrytej kolagenem IV w 24 godziny po inkubacji. 4 Figura 11 przedstawia pływający klaster utworzony po 48 godzinach od początkowego przytwierdzenia komórek do wyspy pokrytej kolagenem IV. Figura 12 przedstawia dane PCR w czasie rzeczywistym pokazujące poziom ekspresji wybranych genów w komórkach pochodzenia trzustkowego rosnących w monowarstwie (białe słupki) oraz w komórkach pochodzenia trzustkowego rosnących w klastrze (czarne słupki). Przedstawione dane znormalizowano do poziomów ekspresji obserwowanych w trzustce dorosłego człowieka. OPIS SZCZEGÓŁOWY [0024] Wynalazek obejmuje sposób indukowania grupowania się komórek in vitro. Klaster komórek można traktować jako trójwymiarowe skupisko więcej niż jednej komórki, w którym komórki nie tworzą monowarstwy. Klaster może mieć dowolny kształt, taki jak na przykład kształt sferoidy, elipsoidy, sześcianu i tym podobny. Ponadto, mogą być one niejednorodnymi, nieasymetrycznymi skupiskami, które tworzą się w trzech wymiarach wokół centralnej komórki lub małej centralnej grupy komórek. [0025] Monowarstwę można traktować jako pojedynczą ciągłą warstwę komórek, która ma grubość jednej komórki lub co najwyżej dwóch komórek. Komórki w monowarstwie mogą tworzyć grupy lub kolonie więcej niż jednej komórki, jednak kolonie te mają zazwyczaj grubość jednej komórki. [0026] Komórkami według wynalazku mogą być komórki trzustkowe, pochodzące z płynu owodniowego lub kohodowla komórek pochodzenia trzustkowego i z płynu owodniowego. Komórkami do celów implantacji mogą być komórki autologiczne, allogeniczne lub ksenogeniczne w stosunku do siebie i/lub w stosunku do gospodarza in vivo. Komórkami mogą być komórki pierwotne zastosowane bezpośrednio po wyizolowaniu od dawcy. Przed wykorzystaniem są one namnażane w monowarstwie. Komórkami mogą być komórki niezróżnicowane lub częściowo do w pełni zróżnicowane i/lub genetycznie zaprojektowane. [0027] Klaster według wynalazku może zawierać materiały wyjściowe składające się z homogenicznej populacji komórek jednego typu lub heterogenicznej populacji komórek różnych typów. W celu optymalizacji pewnych cech lub w celu zahamowania pewnych cech klastra jako całości, można zmieniać stosunek różnych typów komórek składających się na jeden klaster. Materiałami wyjściowymi mogą być pojedyncze komórki lub klastry komórek, lub ich kombinacje. Wszystkie komórki składające się na klaster można wprowadzić jednocześnie podczas procesu indukowania. Alternatywnie, można wprowadzać dodatkowe komórki po początkowym wysianiu komórek i utworzeniu klastra. Po utworzeniu klastra wyjściowego można ponadto wprowadzać dodatkowe klastry, przy czym agregacja lub fuzja klastrów może prowadzić do utworzenia klastrów złożonych. [0028] W jednym wykonaniu, klaster komórek może zawierać komórkę zmodyfikowaną genetycznie, która posiada wysoki poziom ekspresji określonego genu lub danego zestawu genów. Ten wysoki poziom ekspresji może następnie indukować zwiększenie ekspresji danych genów w innych typach komórek w obrębie klastra. Zwiększenie ekspresji genów dla danego białka w jednym typie komórek może również wywoływać pożądany wpływ na geny odpowiadające oraz szlaki sygnałowe sąsiednich komórek w obrębie klastra. [0029] W jeszcze innym wykonaniu, klaster komórek może zawierać ksenogeniczną komórkę określonego fenotypu, która może posiadać związane ligandy lub receptory powierzchniowe, wydzielać czynniki wzrostu lub cytokiny zdolne do wpływania na sąsiednie komórki w obrębie klastra lub jego bezpośredniego otoczenia po implantacji. W takich oddziaływaniach może częściowo lub w całości 5 pośredniczyć odtwarzanie prawidłowych szlaków sygnałowych i wiązania pomiędzy podobnymi jednostkami molekularnymi różnych gatunków. Komórka ksenogeniczna może pozostawać na miejscu lub zostać przed implantacją selektywnie usunięta z zastosowaniem unikalnych cytotoksycznych przeciwciał i dopełniacza. Alternatywnie, jeśli komórka ksenogeniczna (lub przeciwdziałająca komórka (komórki) w klastrze) została zmodyfikowana genetycznie w celu odpowiedzi na unikalny czynnik selekcyjny, to można czynnik ten dodać do podłoża hodowlanego na okres wystarczający do wywołania efektu cytotoksycznego, a następnie wypłukać czynnik selekcyjny przed implantacją. [0030] Przeżywalność komórek w klastrze jest funkcją odległości dyfuzyjnej, którą składniki odżywcze oraz tlen muszą pokonać, aby dotrzeć do najgłębszych komórek w obrębie klastra. Optymalny rozmiar klastrów według wynalazku będzie się różnił się w zależności od zastosowania, ale musi uwzględniać odległość dyfuzyjną niezbędną do podtrzymania przeżycia składowych typów komórek. Dla osób o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie jest oczywiste, że odległość ta dla jednego typu komórek jest różna niż dla innego. W jednym wykonaniu, odległość ta może być w zakresie 2-1000 mikronów. Alternatywnie, może być w zakresie od około 10 do około 500 mikronów. Alternatywnie, może być w zakresie od około 10 do około 300 mikronów. [0031] Różnić może się również całkowita liczba komórek składających się na klaster. Klaster może zawierać 10-10000 komórek. Alternatywnie, może on zawierać od około 100 do około 10000 komórek. Alternatywnie, może on zawierać od około 1000 do około 5000 komórek. [0032] W jednym wykonaniu klaster komórek może zawierać komórki zaangażowane w wydzielanie insuliny i utrzymywanie glukozy na pewnym poziomie, naśladujące funkcję znajdujących się w trzustce wysepek Langerhansa. [0033] W innym wykonaniu, klaster komórek może zawierać komórki zaangażowane w budowę nowego unaczynienia układu krwionośnego, takie jak komórki śródbłonka. Obecność naczyń krwionośnych może zwiększyć przeżywalność komórek w masie klastra po przeszczepie in vivo. Nowo utworzone naczynia krwionośne mogą umożliwić przenikanie krwi w głąb masy klastra, zmniejszając w ten sposób całkowitą odległość dyfuzyjną niezbędną do wydajnej wymiany substancji odżywczych, gazów i resztek. [0034] Zgodnie ze sposobem według tego wynalazku, grupowanie komórek można indukować za pomocą kilku technik. W jednym wykonaniu, komórki hodowane w monowarstwie zawiesza się w podłożu odpowiednim do utrzymania przeżywalności komórek. Zawiesinę komórek umieszcza się następnie w naczyniu, którego powierzchnię uprzednio traktowano tak, że hamuje lub uniemożliwiaona przytwierdzanie komórek, tworząc układ, w którym powinowactwo komórek do przylegania do powierzchni naczynia jest mniejsze niż powinowactwo komórek do przylegania do siebie nawzajem, prowadzący początkowo do powstawania luźno przylegających klastrów komórek. Wkrótce po tym, nowo przyległe komórki wytwarzają endogenną macierz pozakomórkową, ściągając tym samym komórki tworzące klaster w bardziej zwartą i stabilną strukturę. [0035] Modyfikację powierzchni w celu zapobieżenia przytwierdzania komórek można osiągnąć za pomocą różnych technik znanych specjalistom w dziedzinie. Powierzchnię można na przykład powlec substancją hydrożelową zwiększającą hydrofilowość i z kolei zmniejszającą powinowactwo błon komórkowych do przylegania do powierzchni. [0036] Przytwierdzanie komórkowe jest kontrolowane poprzez ograniczenie obszaru powierzchni dostępnego dla prawidłowego przytwierdzenia. Zawiesinę komórek następnie wprowadza się na powierzchnię dostępną dla przytwierdzenia. Po zajęciu całej powierzchni dostępnej dla przytwierdzenia, 6 komórki pozostające w zawiesinie usuwa się, a te już przytwierdzone pozostawia i umożliwia proliferację na zewnątrz z utworzeniem wysepek, które w końcu odrywają się od powierzchni i tworzą klastry. [0037] W jednym wykonaniu, minimalizacja powierzchni dostępnej dla przytwierdzenia może nastąpić poprzez generowanie wysepek do przytwierdzania komórek na powierzchni, która w innym przypadku uniemożliwia przytwierdzanie komórek. Wysepki te są określane w opisie jako mikro-punkty. Mikro-punkty można wytworzyć poprzez osadzenie kropelek roztworu białka macierzy pozakomórkowej na powierzchni. Powierzchnię pozostawia się do wyschnięcia. Alternatywnie można wykorzystać miękką litografię w celu utworzenia mikro-wzorów ECM na powierzchni, która w innym przypadku uniemożliwia przytwierdzanie komórek. Każdy mikro-punkt może prowadzić do utworzenia co najmniej jednego klastra. Osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie docenią, że istnieje wiele sposobów modyfikacji danej powierzchni w celu utworzenia mikro-punktów, które umożliwiają przytwierdzenie komórek. [0038] W innym wykonaniu, zawiesinę komórek można wprowadzić na powierzchnię, która w innym przypadku uniemożliwia przytwierdzanie komórek, z wykorzystaniem na powierzchni mikro-punktów umożliwiających takie przytwierdzanie. Po wypełnieniu przez komórki przestrzeni dostępnej dla przytwierdzania, można je usunąć oraz wprowadzić do zawiesiny nowy typ komórek posiadający powinowactwo przytwierdzania do pierwszego typu komórek, który jest z kolei przytwierdzony do mikropunktów. Technikę tę można zastosować do skonstruowania klastra 3-D złożonego z warstw różnych typów komórek naśladującego strukturę in vivo. [0039] W jednym wykonaniu, powierzchnię umożliwiającą przytwierdzanie komórek można zmodyfikować poprzez powleczenie jej substancją, która nie pozwala na przyleganie komórek, a następnie usunięcie części substancji powlekającej, a tym samym ponowne odsłonięcie powierzchni pod spodem w celu przytwierdzenia komórek. Odzwierciedleniem tej techniki jest Przykład 4, gdzie do usunięcia powłoki z hydrożelu, która zapobiega przytwierdzaniu komórek zastosowano ostrze chirurgiczne, a tym samym odsłonięto pierwotną powierzchnię polistyrenową, która w następstwie przyjęła przytwierdzanie komórek. [0040] Gęstość komórek może wpływać na indukowanie klastrów. Gęstość komórek w opisie odnosi się do liczby komórek na objętość podłoża. Im wyższa jest gęstość komórek, tym większe prawdopodobieństwo grupowania oraz większa szybkość tworzenia klastrów. W przeciwieństwie do tego, zwiększenie gęstości komórek ponad optymalną granicę może wpływać na ostateczną przeżywalność komórek i zmniejszać ogólną wydajność grupowania. Przedstawiono to wyraźnie w Przykładzie 2, gdzie podwojenie gęstości komórek od 0,5 x 106 do 1,0 x 106 komórek na 6 ml podłoża hodowlanego nie doprowadziło do istotnego wzrostu tworzenia klastrów. Osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie docenią wymaganą przez ten wynalazek równowagę pomiędzy szybkością indukowania grupowania a całkowitą wydajnością procesu wykazywaną poprzez żywotność komórek biorących udział w grupowaniu. [0041] Stężenie surowicy w podłożu hodowlanym jest kolejnym parametrem wpływającym na tworzenie klastrów. Stężenie surowicy może wahać się w zależności od wymaganego optymalnego rozmiaru klastra. Wielkość klastrów bezpośrednio koreluje ze stężeniem surowicy, co ponownie przedstawiono w Przykładzie 2. Wielkość klastrów utworzonych z komórek pochodzenia trzustkowego wzrosła dramatycznie, gdy stężenie surowicy zwiększono od 2% do 10%. W przeciwieństwie do tego, brak surowicy w podłożu hodowlanym może obniżać wydajność grupowania i prowadzić do śmierci komórek. [0042] Inny sposób obniżania tempa tworzenia klastrów oraz ograniczania rozmiaru klastra polega na czasowym wprowadzeniu czynników zmniejszających skłonność komórek do łączenia się ze sobą. 7 Dodanie tych czynników do podłoża hodowlanego w momencie wystąpienia grupowania się komórek oraz osiągnięcia optymalnego rozmiaru klastra zmniejsza dalsze przytwierdzanie się pojedynczych komórek do utworzonych klastrów a także zmniejsza agregację utworzonych klastrów. Przykład 1 Przygotowanie komórek pochodzenia trzustkowego [0043] Przygotowanie Trzustki ? nienadające się do przeszczepu klinicznego trzustki ludzkie uzyskano z The National Disease Research Interchange (Filadelfia, PA) po uzyskaniu odpowiedniej zgody na zastosowanie do celów badawczych. Przy użyciu roztworu do zabezpieczania narządów, trzustkę przeniesiono do miski ze stali nierdzewnej na lodzie i odcięto całą obcą tkankę. Przewód trzustkowy kaniulowano cewnikiem o rozmiarze 18 a trzustkę ostrzyknięto roztworem enzymów zawierającym enzym LIBERAZĘ HI ? (Roche - 0,5 mg/ml) oraz DNazę I (0,2 mg/ml) rozpuszczone w buforowanej fosforanami soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS). [0044] Stopniowa Dysocjacja Mechaniczna z Równoczesnym Trawieniem Enzymatycznym ? trzustki ostrzyknięte enzymami przetworzono według sposobów opisanych w Diabetes 37:413-420 (1988). W skrócie, trzustki oczyszczono z obcej tkanki i ostrzyknięto roztworem enzymów jak opisano powyżej. Następnie trzustki umieszczono w komorze Ricordiego z kulkami ze stali nierdzewnej i przykryto sitem z oczkami o wielkości 400-600 ?m w celu zatrzymania większych kawałków tkanki. Komorę przykryto i roztwór enzymów krążył w komorze w około 37°C, a komorę wytrząsano w celu umożliwienia kulkom zniszczenia tkanki trzustkowej, podczas gdy enzym trawił trzustkę. Trawienie zakończono a tkankę pobrano po uzyskaniu odpowiedniej dysocjacji i strawienia. [0045] Rozdział Tkanek - Zebraną tkankę odwirowano przy 150 x g w 4°C przez 5 minut. Supernatant odessano a tkankę przemyto w DPBS dodatkowe dwa razy. Po ostatnim przemyciu tkankę naniesiono na nieciągły gradient w celu oczyszczenia. Strawioną tkankę zawieszono w polisacharozie (Mediatech, VA) w gęstości 1,108 g/ml, w stosunku około 1 do około 2 ml osadu tkanki na 10 ml roztworu polisacharozy. Zawiesinę tkanki przeniesiono następnie do okrągłodennych probówek wirówkowych z poliwęglanu a roztwory polisacharozy o gęstościach odpowiednio 1,096 i 1,037 ostrożnie nawarstwiono na zawiesinę tkankową w probówkach. Nieciągły gradient do oczyszczania zakończono ostatnią warstwą z DMEM. Probówki gradientowe wirowano przy 2000 obr./min w 4°C przez 20 minut bez zastosowania hamulca. Po odwirowaniu pobrano osobno tkankę z każdej granicy faz frakcji (trzy granice faz), przemyto kilka razy w DPBS+ jak opisano powyżej i zebrano w 50 ml probówce testowej. [0046] Dalsza Dysocjacja Klastrów Komórek - Duże klastry komórek otrzymane z zastosowaniem powyższego protokołu można ewentualnie dalej rozdzielać na mniejsze klastry lub zawiesiny pojedynczych komórek. Po ostatnim przemyciu, tkankę z każdej frakcji zawieszono w 10 ml roztworu 1x trypsyna/EDTA zawierającego 200 U/ml DNazy I. Probówki umieszczono w łaźni wodnej oraz wielokrotnie zasysano i wypuszczano z 10 ml pipety serologicznej przez 5 do 6 minut aż do uzyskania zawiesiny prawie pojedynczych komórek. Trawienie przerwano poprzez dodanie DPBS+ o 4°C oraz wirowanie probówek przez 5 minut przy 800 obr./min. Zawiesiny komórek przemyto DPBS+ i hodowano jak opisano poniżej. [0047] Hodowla Komórek Trzustkowych - Po końcowym przemyciu, komórki z każdej granicy faz ponownie zawieszono w DMEM, 2% FBS, 100 U/?g penicyliny/streptomycyny, ITS, 2 mM L-glutaminy, 0,0165 mM ZnSO4 (Sigma) i 0,38 ?M 2-merkaptoetanolu (Invitrogen, CA) (zwanym dalej ?podłożem 8 selekcyjnym?). Porcje zawiesiny komórek po sześć ml wysiano w butelkach T-25 do hodowli tkankowych lub zamiennie 12 ml zawiesiny komórek wysiewano w kolbach T-75. Kolby umieszczono w inkubatorach o 37°C z 5% CO2. Po dwóch do czterech tygodniach hodowli przeprowadzono całkowitą wymianę podłoża a komórki przylegające zawrócono do hodowli w DMEM (2750 mg/l D-glukozy, 862 mg/l glutaminy) (Gibco, USA) z 5% FBS (HyClone, UT), 1% P/S, 0,0165 mM ZnSO4 (dalej ?podłoże wzrostowe?) i pozostawiono do osiągnięcia stanu bliskiego konfluencji (etap ten określono jako ?pasaż 0? lub ?P0?), w którym to momencie były pasażowane. Dalsze hodowanie komórek odbywało się w podłożu 2 wzrostowym z 5000 komórek/cm . Hodowle pasażowano raz na 7 do 10 dni po osiągnięciu około 70-90% konfluencji. Figura 1 przedstawia typową morfologię zrębową komórek pochodzenia trzustkowego. Przykład 2 Tworzenie Klastrów Komórek Trzustkowych [0048] Komórki trzustkowe wyizolowane według Przykładu 1 hodowano w zawiesinie na 6-studzienkowych słabo przytwierdzających płytkach (Corning Life Sciences). Zastosowane podłoża zawierały DMEM o niskiej zawartości glukozy suplementowane 0, 2 lub 10% FBS. Studzienki zawierały 6 6 6 0,25 x 10 , 0,5 x 10 lub 1,0 x 10 komórek. Komórki hodowano w zawiesinie przez dwa dni. Wydajność tworzenia klastrów oceniano w oparciu o wielkość, żywotność, jednorodność oraz ilość klastrów. [0049] Analiza wizualna pod mikroskopem wyraźnie wykazała, że gęstość komórek i stężenie surowicy odgrywają kluczową rolę w kształtowaniu geometrii klastrów. Surowica zwiększa zdolność komórek do przytwierdzania się do siebie, a także zdolność klastrów do agregacji i zwiększania rozmiaru. Zwiększenie poziomu FBS w podłożu z 2% (Figura 3) do 10% (Figura 4) dla gęstości wysiewania 0,5 x 106 komórek doprowadziło do znacznego wzrostu wielkości klastrów, co z kolei doprowadziło do ośrodkowej martwicy otrzymanych klastrów, jak wskazują ciemne centra klastrów. [0050] Analiza wizualna wykazała również, że gdy stężenie surowicy utrzymywano na stałym poziomie 2%, a liczba wysiewanych komórek wynosiła pomiędzy 0,5 x 106 (Figura 5) a 1,0 x 106 (Figura 6), to całkowita ilość klastrów nie różniła się istotnie. Mniejsza liczba wysiewanych komórek sprzyjała optymalnej wielkości klastrów oraz zachowaniu żywotności komórek, jak pokazano poprzez porównanie dwóch figur. Przykład 3 Badanie Żywotności 6 [0051] Klastry utworzono zgodnie z Przykładem 1, z 0,5 x 10 komórkami na studzienkę w podłożu zawierającym DMEM-LG z dodatkiem 2% FBS. Trzeciego dnia klastry usunięto ze studzienki i odpipetowano do 50 ml probówki (Falcon). Następnie studzienkę przemyto PBS i połączono z zawartością probówki w celu zapewnienia zebrania wszystkich klastrów. Klastry następnie wirowano przez 2 minuty przy 200 obr./min, supernatant usunięto i zastąpiono 5 ml TRYPLE? Express (Invitrogen, CA), następnie inkubowano przez 10 minut. Kilkukrotne pipetowanie wspomogło dalszy rozpad klastrów. Zawiesinę komórek oceniano następnie pod mikroskopem, aby zapewnić przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek. Żywotność komórek oceniano stosując układ do analizy komórek Guava PCA-96 oraz odczynnik VIACOUNT? (Guava, CA). Uzyskana liczba jest średnią z trzech oddzielnych badań. Zmierzono, że całkowita żywotność komórek wynosi 76%, wskazując, że większość komórek tworzących klastry stanowiła żywe komórki. 9 Przykład 4 Alternatywna Metoda Tworzenia Klastrów [0052] W celu usunięcia powłoki słabo przytwierdzającego hydrożelu, na powierzchni 10 cm słabo przytwierdzającej płytki utworzono krawędzie przy użyciu sterylnego skalpela. Proces ten odsłonił polistyrenową powierzchnię pod spodem. Następnie na płytkę naniesiono pipetą 5 ml roztworu 10 ?g/ml kolagenu typu IV (BD Biosciences) w PBS i pozostawiono na godzinę do inkubacji. Kolagen związał się jedynie wzdłuż krawędzi, gdzie usunięto słabo przytwierdzający hydrożel. Następnie, w celu usunięcia odessano roztwór kolagenu a na płytkę naniesiono pipetą zawiesinę pojedynczych komórek o 1,0 x 10 6 komórkach w DMEM-LG z 2% FBS. Komórki pozostawiono na noc do inkubacji w atmosferze 37°C z 5% CO2. Komórki nieprzylegające usunięto a następnie dodano świeże podłoże. Całkowitą wymianę podłoża przeprowadzano co drugi dzień. Przytwierdzone klastry pojawiły się na odsłoniętych krawędziach 10 dnia, stając się ostatecznie klastrami nieprzylegającymi (Figura 7). Przykład 5 Komórki pochodzenia owodniowego [0053] Płyn owodniowy użyty do izolacji komórek według niniejszego wynalazku pobrano z próbek uzyskanych z rutynowej amniopunkcji przeprowadzanej w 17 do 22 tygodniu ciąży w celu rutynowego kariotypowania płodu. Płyn owodniowy wirowano przez 7 minut przy 400-x g, a supernatant usunięto. Otrzymany osad komórek ponownie zawieszono w podłożu wzrostowym Amniomax? (Gibco, MD, USA). Komórki hodowano na płytkach pokrytych fibronektyną (10 ?g/ml) (BD Biosciences, CA, USA). Hodowle pozostawiono bez ingerencji na co najmniej 5 do 10 dni w warunkach niedoboru tlenu (3% O2), po czym hodowle zasilano tym samym podłożem wzrostowym i hodowano do osiągnięcia około 70 do 80% konfluencji. Komórki na tym etapie określano jako ?P0?. Komórki pochodzące z płynu owodniowego (AF, ang. amniotic fluid) wykorzystywane na potrzeby niniejszego wynalazku były w 10 pasażu namnażania. Figura 2 przedstawia typową morfologię komórek pochodzących z płynu owodniowego. Przykład 6 Tworzenie Klastrów Komórek Pochodzących z Płynu Owodniowego [0054] W tym doświadczeniu zastosowano dwie linie komórek AF. Linie założono jak pokazano w powyższym przykładzie. Tworzenie klastrów indukowano wykorzystując sposób opisany powyżej w przykładzie 2. Komórki hodowano na 6-studzienkowych słabo przytwierdzających płytkach w DMEMLG suplementowanym 2% FBS. Klastry oceniano w 48 godzinie. Jedna z dwóch linii (Linia A) utworzyła klastry. Druga linia komórkowa (Linia B) nie zareagowała na sposób indukcji klastrów, nawet gdy czas hodowli przedłużono do 1 tygodnia. Przykład 7 Kohodowla jako sposób indukcji tworzenia klastrów [0055] Doświadczenie przeprowadzono wykorzystując dwa typy komórek: komórki pochodzenia trzustkowego oraz komórki AF linii B otrzymane jak w przykładach powyżej. Tworzenie klastrów indukowano wykorzystując sposób opisany powyżej w Przykładzie 2. Komórki hodowano w 6-studzienkowych słabo przytwierdzających płytkach w DMEM-LG suplementowanym 2% FBS. Klastry 6 oceniano w 48 godz. Każda studzienka zawierała komórki w gęstości początkowej 0,5 x 10 : albo 10 wyłącznie komórki pochodzenia trzustkowego albo wyłącznie komórki AF linii B albo zmieszane razem dwa typy komórek w stosunku 1:1. Zgodnie z oczekiwaniami, hodowane osobno komórki pochodzenia trzustkowego utworzyły klastry w ciągu 48 godz. Komórki AF linii B nie utworzyły żadnych klastrów, nawet gdy hodowlę wydłużono do 1 tygodnia. W przeciwieństwie do tego, kombinacja dwóch typów komórek utworzyła klastry w ciągu 48 godz. W celu upewnienia się, że klastry zawierały oba typy komórek, każdy typ komórek znakowano innym znacznikiem fluorescencyjnym przy użyciu zestawu do dynamicznego wielokolorowego znakowania komórek (Molecular Probes, OR, USA). Po zaindukowaniu klastrów, klastry analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Figura 8 przedstawia klaster zawierający oba typy komórek. Przykład 8 Mikro-wysepki jako sposób indukcji tworzenia klastrów [0056] Komórki pochodzenia trzustkowego otrzymano sposobami przedstawionymi w Przykładzie 2. Komórki hodowano i utrzymywano w podłożu DMEM-LG suplementowanym 10% FBS. Roztwór kolagenu IV (Producent??) sporządzono w stężeniu 20 ?g/ml w PBS. W tym doświadczeniu zastosowano powleczone hydrożelem słabo przytwierdzające płytki (średnica = 10 cm) (Corning, NY). Na powierzchnię płytki naniesiono 0,21 ?l kropelki roztworu kolagenu IV a płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. 10 ml zawiesiny komórek pochodzenia trzustkowego w podłożu DMEM-LG suplementowanym 10% FBS powoli naniesiono pipetą na powierzchnię płytki. Płytkę inkubowano przez 3 godziny w 37°C w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia przeprowadzono całkowitą wymianę podłoża w celu usunięcia wszystkich komórek pozostających w zawiesinie. Komórki przytwierdzone do powleczonej kolagenem IV powierzchni utworzyły wzór wysepek (Figura 9). Po 24 godzinach komórki rozprzestrzeniły się w celu wypełnienia przerywnikowych przestrzeni pomiędzy wysepkami (Figura 10). Po 48 godz. komórki skupiły się w klastry (Figura 11) i ostatecznie oderwały od powierzchni płytki. Przykład 9 Analiza PCR komórek pochodzenia trzustkowego w monowarstwie oraz w klastrach [0057] Komórki pochodzenia trzustkowego izolowane zgodnie z Przykładem 1 hodowano w monowarstwie lub indukowano do tworzenia klastra zgodnie ze sposobem opisanym w Przykładzie 2. [0058] RNA wyekstrahowano albo z pojedynczych komórek rosnących w monowarstwie, albo z klastrów komórek. Jako kontrolę pozytywną zastosowano całkowity RNA z ludzkiej trzustki (Ambion, INC.). [0059] Ekstrakcja, oczyszczanie RNA oraz synteza cDNA: Próbki RNA oczyszczano poprzez jego wiązanie się z membraną krzemionkowo-żelową (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) w obecności zawierającego etanol buforu o wysokiej zawartości soli; podczas gdy zanieczyszczenia zostały wymyte. RNA związany z kolumną oczyszczano dalej poprzez traktowanie DNazą I (Qiagen, CA) przez 15 min. Wysokiej jakości RNA wymyto następnie wodą. Uzysk i czystość oceniano na spektrofotometrze za pomocą odczytów A260 i A280. Z oczyszczonego RNA przygotowano kopie cDNA przy użyciu wysoce wydajnego zestawu do archiwizacji cDNA z ABI (ABI, CA). [0060] Amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym oraz analiza ilościowa: O ile nie określono inaczej, wszystkie odczynniki zakupiono z Applied Biosystems. Reakcje PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu systemu ABI PRISM? 7000 Sequence Detection System. W całkowitej objętości reakcyjnej wynoszącej 20 ?l zastosowano TAQMAN? UNIVERSAL PCR MASTER MIX? 11 (ABI, CA) wraz z 20 ng poddanego odwrotnej transkrypcji RNA. W celu skorygowania błędów pipetowania każdą próbkę cDNA przebadano dwukrotnie. Startery oraz sondy TAQMAN? znakowane FAM zastosowano w stężeniach 200 nM. Poziom ekspresji każdego genu docelowego znormalizowano przy użyciu endogennego zestawu kontrolnego rybosomalnego RNA 18S lub ludzkiej dehydrogenazy aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GAPDH) uprzednio opracowanych przez Applied Biosystem. Startery i sondy albo zaprojektowano przy użyciu oprogramowania ABI PRISM PRIMER EXPRESS?, albo wykorzystano uprzednio opracowany zestaw ABI do analizy genów. Dla każdego genu jeden ze starterów lub sondę zaprojektowano tak, aby otrzymać łączenie na granicy egzonu. Wyeliminowało to możliwość przyłączania starterów/sondy do dowolnego obecnego genomowego DNA. Zestawy starterów i sond wymieniono, jak następuje Pax6 (Hs00240871), Insulina (Hs00355773), Glukagon (Hs00174967), Isl-1 (Hs00158126), Somatostatyna (Hs00174949). Pozostałe startery zaprojektowano stosując program PRIMERS (ABI, CA). Po początkowych 50°C przez 2 min oraz 95°C przez 10 min, próbki poddawano cyklom 40 razy w dwóch etapach - etapie denaturacji w 95°C przez 15 sek., a następnie etapie elongacji/wydłużania w 60°C przez 1 min. Analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GENEAMP?7000 Sequence Detection System. Dla każdego zestawu starter/sonda, wartość Ct określono jako liczbę cykli, w której intensywność fluorescencji osiągnęła określoną wartość w środku wykładniczego obszaru amplifikacji. Względne poziomy ekspresji genów obliczono za pomocą metody porównawczej Ct. W skrócie, dla każdej próbki cDNA, od Ct danego genu odejmowano wartość Ct kontroli endogennej w celu uzyskania wartości delta Ct (?Ct). Znormalizowaną ilość obiektu docelowego obliczono jako 2-?Ct, zakładając 100% wydajność amplifikacji. Końcowe dane wyrażono relatywnie względem próbki kalibratora. Metoda porównawcza Ct jest wiarygodna tylko wtedy, gdy wydajności amplifikacji obiektu docelowego i kontroli endogennej są w przybliżeniu równe. Dla każdego zestawu starter/sonda przeprowadzono zatem wstępne doświadczenia walidacyjne poprzez amplifikację seryjnie rozcieńczonych próbek cDNA oraz określenie wartości ?Ct. Jeśli wydajności amplifikacji są równe, to te wartości ?Ct powinny być stałe w całym zakresie rozcieńczeń. Figura 12 przedstawia porównanie poziomów ekspresji genów w komórkach w monowarstwie versus tych w klastrach. 12 26825/PE/16 EP 1 788 077 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób tworzenia klastrów komórek in vitro obejmujący: a. selekcję grupy komórek do utworzenia klastrów, gdzie komórkami są komórki trzustkowe, komórki pochodzące z płynu owodniowego lub kohodowla komórek trzustkowych i komórek pochodzących z płynu owodniowego; b. namnożenie komórek w monowarstwie; c. utworzenie zawiesiny komórek w płynnym podłożu zawierającym surowicę w stężeniu od około 2% do około 10%; d. inkubację podłoża zawierającego komórki w przestrzeni objętościowej związanej przez powierzchnię; oraz e. ograniczenie przytwierdzania komórkowego do powierzchni; gdzie powierzchnia posiada obszar powierzchni, a etap ograniczenia przytwierdzania komórkowego do powierzchni obejmuje ograniczenie obszaru powierzchni dostępnego dla przytwierdzania komórkowego. 2. Sposób według zastrz. 1, w którym powierzchnia została zmodyfikowana w celu umożliwienia przytwierdzenia komórek tylko do wybranych miejsc na powierzchni. 3. Sposób według zastrz. 1, w którym ograniczenie obszaru powierzchni obejmuje powleczenie powierzchni substancją, która hamuje przytwierdzanie komórkowe. 4. Sposób według zastrz. 3, w którym substancja, która hamuje przytwierdzanie komórkowe uniemożliwia przytwierdzanie komórkowe. 5. Sposób według zastrz. 4, w którym usuwa się porcje substancji, która hamuje przytwierdzanie komórkowe. 6. Sposób według zastrz. 1, w którym etap ograniczania przytwierdzania komórkowego do powierzchni obejmuje zmniejszenie powinowactwa wiązania powierzchni przez komórki do wartości mniejszej niż powinowactwo wiązania komórek ze sobą. 7. Sposób według zastrz. 1, w którym klastry tworzą się na powierzchni. 13 8. Sposób według zastrz. 1, w którym grupa komórek do utworzenia klastrów obejmuje 2 lub więcej typów komórek. 9. Sposób według zastrz. 1 obejmujący ponadto osadzenie białka macierzy pozakomórkowej na obszarach powierzchni. 10. Sposób tworzenia klastrów komórek in vitro obejmujący: a. selekcję grupy komórek do utworzenia klastrów, gdzie komórkami są komórki trzustkowe, komórki pochodzące z płynu owodniowego lub kohodowla komórek trzustkowych i komórek pochodzących z płynu owodniowego; b. namnożenie komórek w monowarstwie; c. utworzenie zawiesiny podgrupy komórek w płynnym podłożu zawierającym surowicę w stężeniu od około 2% do około 10%; d. wprowadzenie podłoża zawierającego podgrupę komórek do przestrzeni objętościowej związanej przez powierzchnię; e. umożliwienie podgrupie komórek przylgnięcia do powierzchni; f. usunięcie komórek z podgrupy komórek, które nie przylgnęły do powierzchni; g. wprowadzenie pozostałych komórek; oraz h. umożliwienie pozostałym komórkom przylgnięcia do komórek przylegających do powierzchni; gdzie powierzchnia posiada obszar powierzchni, a etap umożliwienia podgrupie komórek przylgnięcia do powierzchni obejmuje etap ograniczenia obszaru powierzchni dostępnego dla adherencji komórkowej. 11. Sposób według zastrz. 10, w którym ograniczenie obszaru powierzchni obejmuje powleczenie powierzchni substancją, która hamuje przytwierdzanie komórkowe. 12. Sposób według zastrz. 10, w którym substancja, która hamuje przytwierdzanie komórkowe uniemożliwia przytwierdzanie komórkowe. 13. Sposób według zastrz. 11, w którym usuwa się porcje substancji, która hamuje przytwierdzanie komórkowe. 14. Sposób według zastrz. 10, w którym adherencję komórkową ogranicza się poprzez zmniejszenie powinowactwa wiązania powierzchni przez komórki do wartości mniejszej niż powinowactwo wiązania komórek ze sobą. 15. Sposób według zastrz. 11, w którym klastry tworzą się na powierzchni. 16. Sposób według zastrz. 10, w którym grupa komórek do utworzenia klastrów obejmuje 2 lub więcej typów komórek. 14 17. Sposób według zastrz. 10 obejmujący ponadto osadzenie białka macierzy pozakomórkowej na ograniczonych obszarach powierzchni. 18. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 10, w którym podłoże płynne zawiera surowicę w stężeniu około 2%. 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27



























Grupy dyskusyjne