wp.pl
wp.pl
Najpopularniejszy w Polsce portal o finansach i biznesie
Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 1814580 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 1814580 T3


EP 1814580 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 23.11.2005 05852204.6 (19) PL (11) PL/EP (13) (51) 1814580 T3 Int.Cl. A61K 38/20 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 10.08.2016 Europejski Biuletyn Patentowy 2016/32 EP 1814580 B1 G01N 33/574 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01) A61K 35/17 (2015.01) C12N 5/0783 (2010.01) Tytuł wynalazku: METODY STOSOWANIA IL-21 DO ADOPTYWNEJ IMMUNOTERAPII I IDENTYFIKACJI ANTYGENÓW GUZA (30) (43) Pierwszeństwo: 24.11.2004 US 630727 P Zgłoszenie ogłoszono: 08.08.2007 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/32 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.03.2017 Wiadomości Urzędu Patentowego 2017/03 (73) Uprawniony z patentu: Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, US PL/EP 1814580 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: CASSIAN YEE, Seattle, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla 12 53-114 Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Opis STAN TECHNIKI Cytokiny zasadniczo stymulują proliferację lub różnicowanie komórek hematopetycznej linii rodu lub uczestniczą w mechanizmach odpowiedzi zapalnych i immunologicznych organizmu. Interleukiny stanowią rodzinę cytokin, które pośredniczą w odpowiedziach immunologicznych. Dla odpowiedzi immunologicznej centralną jest komórka T, która wytwarza wiele cytokin i odgrywa rolę w adoptywnej odporności na antygeny. Cytokiny wytworzone przez komórkę T sklasyfikowano jako typ 1 i typ 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). Cytokiny typu 1 obejmują IL-2, IFN-?, LT-?, i są zaangażowane w odpowiedzi immunologiczne, odporność wirusową, odporność na pasożyty śródkomórkowe i odrzucenie aloprzeszczepu. Cytokiny typu 2 obejmują IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 i IL-13, i są zaangażowane w odpowiedzi humoralne, odporność na helminty i reakcję alergiczną. Cytokiny wspólne dla typów 1 i 2 obejmują IL-3, GM-CSF i TNF-?. Pewne dowody sugerują, że populacje komórek T wytwarzające typ 1 i typ 2 korzystnie migrują do różnych typów zapalnej tkanki. Wykazano, że IL-21 jest silnym modulatorem cytotoksycznych komórek T i komórek NK. (ParrishNovak, et al. Nature 408:57-63, 2000; Parrish-Novak, et al., J. Leuk. Bio. 72:856-863, 2002; Collins et al., Immunol. Res. 28:131-140, 2003; Brady, et al. J. Immunol. 172:2048-58, 2004). Odpowiedzi komórek T obejmują wzmocnienie pierwotnej odpowiedzi antygenu jako modulację funkcji komórek T pamięci immunologicznej. W badaniach na myszach, IL-21 wzmaga dojrzewanie i funkcję efektorową komórek NK oraz sprzyja aktywacji komórek T w odpowiedzi na aloantygen (Kasaian et al., Immunity 16:559-569, 2002). Jako cytokina, która ogranicza ekspansję komórek NK i sprzyja aktywacji mysich komórek T CD8, IL-21 jest podejrzewane o odgrywanie roli w przejściu z odporności wrodzonej do adaptywnej (Kasaian, supra, 2002). Wśród komórek T CD4, IL-21 opisano zarówno jako cytokinę Th1 (T pomocnicze 1), która reguluje ?up? ekspresję genów związanych z wrodzoną odpornością (Strengell et al., J. Immunol. 170:5464, 2003) jak i cytokinę Th2, która inhibituje różnicowanie naiwnych komórek Th w wytwarzających IFN-gamma komórkach Th 1 (Wurster et al., J. Exp. Med. 196:969, 2002). Wpływ IL21 na rozwój wrodzonej odporności i odpowiedzi Th CD4 są dobrze scharakteryzowane (Strengell supra, 2003; Strengell et al., J. Leukoc. Biol. 76:416, 2004), lecz jego rola w odpowiedzi specyficznych dla antygenu komórek T CD8+, szczególnie u ludzi, nie została w pełni zbadana. Niniejsze ujawnienie dostarcza sposoby indukowania odpowiedzi o wysokim powinowactwie specyficznych dla antygenu cytotoksycznych komórek T przez podawanie IL-21. Indukowanie odpowiedzi o wysokim powinowactwie CD8 względem autoantygenów, które są reprezentowane coraz bardziej jako potencjalne cele immunologiczne w immunoterapii raka, dowodzą znaczącej roli IL-21 w specyficznych dla antygenu strategiach przeciw guzom. Tak więc, niniejsze ujawnienie dostarcza sposoby podawania IL-21 jako adiuwanta w szczepionkach przeciw guzom. Niniejszy wynalazek 2 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 dostarcza sposoby dla ex vivo ekspansji specyficznych dla antygenu guza cytotoksycznych komórek T do stosowania w immunoterapii adoptywnej, jak określono w zastrzeżeniach. Niniejsze ujawnienie dostarcza sposoby podawania IL-21 jako adiuwanta dla szczepionek i ex vivo ekspansji specyficznych dla antygenu cytotoksycznych komórek T ogólnie względem wirusów, i innych docelowych antygenów. Te i inne zastosowania winny być widoczne biegłym w sztuce z ujawnienia w niniejszym tekście. WO 03/103589 opisuje zastosowanie IL-21 w raku i innych zastosowaniach terapeutycznych. US 2003/0147869 opisuje system i metody sprzyjania ekspansji poliklonalnych i specyficznych dla antygenu cytotoksycznych limfocytów T w odpowiedzi na sztuczne APCs. Vari & Hart, Cytotherapy, luty 2004, Vol. 6(2) str. I 11-121, opisuje ładowanie DCs przy użyciu Ag. Kasaian MT et al., Immunity, Vol. 16(4), kwiecień 2002, str. 559-569 donoszą, że IL-21 ogranicza odpowiedzi komórek NK i sprzyja aktywacji specyficznych dla antygenu komórek T. Sivakumar PV et al., Immunology, Vol. 112(2), czerwiec 2004, str. 177-182, donoszą, że interleukina-21 jest cytokiną komórek pomocniczych T, która reguluje humoralną odporność i odpowiedzi przeciwko guzowi pośredniczone przez komórki. MA H-L et al., J. Immunology, Vol. 171 (2), 15 lipiec 2003, str. 608-615, donoszą, że IL-21 aktywuje zarówno wrodzoną jak i adaptywną odporność, by generować silne odpowiedzi przeciw guzowi, które wymagają perforyny lecz są niezależne od IFN gamma. Moroz A et al., J. Immunology, Vol. 173(2), 15 lipiec 2004, str. 900-909, donoszą, że IL-21 wzmacnia i podtrzymuje odpowiedzi komórek T CD8+, by osiągnąć długotrwałą odporność na guz. Li Y. et al., J. Immunology, Vol. 27(6), 2004, str. S2-S3, donoszą, że modulacja cytokiny ułatwia in vitro tworzenie specyficznych dla antygenu komórek T dla immunoterapii adoptywnej. Brentjens RJ et al., Nature Medicine, Vol. 9(3), marzec 2003, str. 279-286, opisują likwidację guzów układowych komórek B przez genetycznie ukierunkowane ludzkie limfocyty T współstymulowane przez CD80 i interleukinę-15. Foster et al., Current Pharmaceutical Design, Vol. 10(11), październik 2004, str. 1207-1220, opisują użycie ex vivo i zastosowania cytokin do immunoterapii adoptywnej w raku. W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza sposób identyfikacji antygenu guza obejmując: współhodowanie materiału guza wyodrębnionego z osobnika z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) w obecności kompozycji IL-21 i komórek prezentujących antygen (APCs); wyodrębnienie populacji komórek T CD8+ z hodowli, w której liczba wytworzonych komórek T specyficznych względem antygenu guza jest 20 do 30 razy większa niż liczba komórek T specyficznych względem antygenu guza wytworzonych w nieobecności IL-21; klonowanie 3 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 poszczególnych komórek T CD8+ z populacji komórek T CD8+; i identyfikowanie antygenu przez charakteryzowanie klonów komórek T na specyficzność względem antygenu. Niniejsze ujawnienie dostarcza sposób identyfikowania antygenu guza, który obejmuje współhodowanie materiału guza z osobnika z wyodrębnioną populacją komórek T, która jest niekońcowo zróżnicowana, w obecności kompozycji IL-21; klonowanie poszczególnych komórek T z populacji komórek T; i charakteryzowanie klonów komórek T na specyficzność względem antygenu. W jednym wykonaniu, wyodrębniona populacja komórek T nie obejmuje komórek CD4+. W pewnych wykonaniach sposobu według wynalazku, populacja komórek T CD8+ lub PBMCs jest autologiczną populacją komórek. W innych wykonaniach, materiał guza obejmuje całkowity RNA, poddane lizie komórki guza, lub ciała apoptotyczne. W innym wykonaniu, współhodowanie następuje w obecności kompozycji IL-21 i jednej lub więcej dodatkowych cytokin. Wynalazek dostarcza sposób wytwarzania populacji ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza do stosowania w immunoterapii adoptywnej obejmując: wyodrębnienie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) z próbki biologicznej, w którym wspomniane PBMCs obejmują populację naiwnych ludzkich komórek T CD8+; identyfikowanie PBMCs mających fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem mającym guz; wyodrębnienie ze wspomnianych zgodnych tkankowo PBMCs populacji naiwnych ludzkich komórek T CD8+; współhodowanie materiału guza wyodrębnionego z osobnika z populacją naiwnych ludzkich komórek T CD8+ w obecności kompozycji IL-21 i komórek prezentujących antygen (APCs), w którym wspomniany materiał guza obejmuje antygen guza; i ekspandowanie komórek w hodowli, w której liczba wytworzonych ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza jest 20 do 30 razy większa niż liczba ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza wytworzonych w nieobecności IL21. Wynalazek dostarcza sposób wytwarzania populacji ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza do stosowania w immunoterapii adoptywnej obejmując: identyfikowanie, z wyodrębnionej ludzkiej próbki biologicznej zawierającej komórki T, populacji ludzkich komórek T mającej fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem mającym guz; wyodrębnienie ze wspomnianej zgodnej tkankowo populacji ludzkich komórek T populacji naiwnych ludzkich komórek T CD8+; współhodowanie materiału guza z osobnika z populacją naiwnych ludzkich komórek T CD8+ w obecności kompozycji IL-21 i APCs, w którym wspomniany materiał guza obejmuje antygen guza; i ekspandowanie tych komórek w hodowli, w której liczba ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza wytworzonych jest 20 do 30 razy większa niż liczba ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza wytworzonych w nieobecności IL-21. Wynalazek dostarcza sposób ex vivo ekspansji ludzkich cytotoksycznych komórek T CD8+ specyficznych dla antygenu guza obejmując: identyfikowanie, z wyodrębnionej ludzkiej próbki 4 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 biologicznej zawierającej komórki T, populacji ludzkich komórek T mających fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem; wyodrębnienie ze wspomnianej zgodnej tkankowo populacji ludzkich komórek T populacji naiwnych ludzkich komórek T CD8+; współhodowanie materiału guza z osobnika z populacją naiwnych ludzkich komórek T CD8+, w obecności kompozycji IL-21, w którym wspomniany materiał guza obejmuje antygen guza; i ekspandowanie komórek w hodowli, w której liczba wytworzonych ludzkich cytotoksycznych komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza jest 20 do 30 razy większa niż liczba ludzkich cytotoksycznych komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza wytworzonych w nieobecności IL-21. Wynalazek dostarcza również zastosowanie ekspandowanych ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza, do wytwarzania leku do immunoterapii adoptywnej u osobnika mającego guz, w którym ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza mają fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem, i w którym ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza współhodowano z materiałem guza z osobnika w obecności IL21 i APCs, w którym ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza są CD28+ i zdolne do wytwarzania IL-2, i w którym wspomniane CD28+, wytwarzająca IL-2 populacja ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza jest hodowana w nieobecności dodatkowych cytokin, w ten sposób ekspandując wspomniane ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza. Wynalazek dostarcza również ekspandowane CD28+, wytwarzające IL-2 ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza, wytworzone przez współhodowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) mających fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem, z materiałem guza wyodrębnionym z osobnika, w obecności IL-21 i APCs, by wytworzyć populację ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza, która jest CD28+ i jest zdolna do wytwarzania IL-2 , i ekspandowanych przez hodowlę w nieobecności dodatkowych cytokin, do stosowania w immunoterapii adoptywnej u osobnika mającego guz. Wynalazek dostarcza również ekspandowanych ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza do stosowania w immunoterapii adoptywnej u osobnika mającego guz, w których ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza mają fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem, i w którym ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza współhodowano z materiałem guza z osobnika w obecności IL-21 i APCs, w którym ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza są CD28+ i są zdolne do wytwarzania IL-2 , i w którym wspomniana CD28+, wytwarzająca IL-2 populacja ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza jest hodowana w nieobecności dodatkowych cytokin w ten sposób ekspandując wspomniane ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza. W innym aspekcie, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób wytwarzania populacji komórek T do stosowania w immunoterapii adoptywnej obejmując identyfikowanie PBMCs mających zgodny 5 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 tkankowo fenotyp z osobnikiem mającym guz, współhodowanie materiału guza lub peptydów związanych z guzem od pacjenta z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMCs) w obecności kompozycji IL-21 i APCs; ekspandowanie tych komórek w hodowli; i ponowne wprowadzanie tych komórek z powrotem do pacjenta. PBMCs mogą być autologiczne. Populacja komórek T może być autologiczna. Materiał guza może obejmować całkowity RNA, poddane lizie komórki guza lub ciała apoptotyczne. W innym wykonaniu, PBMCs lub komórki T są alogeniczne. W innym aspekcie, niniejsze ujawnienie dostarcza sposób wytwarzania populacji komórek T do stosowania w immunoterapii adoptywnej obejmując identyfikowanie populacji komórek T mającej zgodny tkankowo fenotyp z osobnikiem mającym guz; współhodowanie materiału guza z osobnika z populacją komórek T w obecności kompozycji IL-21 i APCs; ekspandowanie tych komórek w hodowli; i ponowne wprowadzanie tych komórek z powrotem do osobnika. Populacja komórek T może być naiwna lub nie-końcowo zróżnicowana. Populacja komórek T może być autologiczna. Materiał guza może obejmować całkowity RNA, poddane lizie komórki guza lub ciała apoptotyczne. KRÓTKI OPIS FIGUR Figury 1 i 2 ilustrują, że IL-21 wzmacnia tworzenie specyficznego względem MART-1 CTL. Komórki T CD8+ od zdrowych dawców HLA-A2+ CG, NE i LD stymulowano in vitro autologicznymi dojrzałymi komórkami dendrytycznymi pulsowanymi MART-1, peptydem M26 jak opisano w przykładach. 6 Figura 1. Dnia 7 po stymulacji, 10 komórek z każdej grupy doświadczalnej zebrano i wybarwiono stosując 20 ?g/ml tetrameru peptyd/MHC (PE, oś pionowa) i barwnik przyżyciowy (PI lub DAPI, oś pozioma). Dane wyrażono jako procent komórek dodatnich względem tetrameru pośród limfocytów w ramce (oczyszczone komórki CD8+). Figura 2. Bezwzględną liczbę w milionach komórek tetramer+ odpowiadającą hodowlom od dawców CG, NE i LD nie poddanym działaniu i poddanym działaniu IL-21 przedstawiono na A., i krotność wzrostu w liczbach bezwzględnych hodowli poddanych działaniu IL-21 względem nie poddanych działaniu. C. Hodowle od normalnego zdrowego dawcy, CG, i pacjenta z przerzutami czerniaka, ST, poddano analizie dnia 7 po pierwszej (Stim 1) i drugiej (Stim 2) stymulacji w obecności lub nieobecności IL-21 podczas Stim 1. IL-2 i IL-7 dodano po Stim 2. Dane wyrażono jako procent komórek dodatnich względem tetrameru wśród limfocytów w ramkach (oczyszczone komórki CD8+). Wyniki powyżej są przykładami trzech oddzielnych doświadczeń dla każdego dawcy. Figura 3 ilustruje, że wystawienie na działanie innych cytokin łańcucha gamma, IL-2, IL-7 lub IL-15, nie zwiększa tworzenia specyficznego dla antygenu CTL. Komórki T CD8+ od zdrowego dawcy HLA-A2+ stymulowano in vitro autologicznymi dojrzałymi komórkami dendrytycznymi pulsowanymi MART-1, 6 peptydem M26, jak opisano w przykładach. Dnia 7 po stymulacji, 10 komórek z każdej grupy doświadczalnej zebrano i wybarwiono stosując 20 ?g/ml tetrameru peptyd/MHC (PE, oś pionowa) i barwnik przyżyciowy (PI lub DAPI, oś pozioma). Dane wyrażono jako procent komórek dodatnich 6 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 względem tetrameru wśród limfocytów w ramkach (oczyszczone komórki CD8+). Dane są przykładami hodowli od 3 dawców HLA-A2+. Figura 4 ilustruje, że poddane działaniu IL-21 komórki podlegają zwiększonej proliferacji i zmniejszonej apoptozie podczas pierwotnej stymulacji in vitro. Oczyszczone populacje naiwnych + + (CD45RA , CD62L ) limfocytów preinkubowano CFSE i stymulowano peptydem MART-1 w nieobecności (brak cytokin) lub obecności IL-21 (traktowane IL-21). Dnia 7, komórki wybarwiono stosując peptyd MART-1 - tetramer MHC -PE i poddano analizie na frakcję dzielących się komórek (CFSE) lub komórek podlegających apoptozie (aneksyna V). Komórki wybarwione CFSE straciły natężenie fluorescencji w kolejnych podziałach. Wyniki wyrażono jako procent nie dzielących się (z prawej strony), dzielących się (pośrodku) i szybko dzielących się (z lewej strony) komórek tetramer+. W przypadku komórek apoptotycznych, komórki tetramer+ z wybarwianiem aneksyną V są reprezentowane jako procent w prawej górnej ćwiartce. Figura 5 ilustruje, że IL-21 wpływa w pierwszym rzędzie na naiwne komórki T CD8+ względem komórek T CD8+ pamięci immunologicznej. Wysoce oczyszczone populacje komórek T naiwnych + + + (CD45RA , CD62L ) lub pamięci immunologicznej (CD45RO ) od zdrowego normalnego dawcy (CG) i dawcy z czerniakiem (ST) oceniono pod kątem indukowania specyficznych dla antygenu odpowiedzi na peptyd MART-1 w nieobecności lub obecności IL-21. Procenty CTL specyficznego względem MART-I są wyrażone jako procent komórek tetramer+ wśród całości limfocytów w ramce (oczyszczone komórki CD8+) po dwóch cyklach stymulacji in vitro. Wyniki są przykładami doświadczeń wykonanych na 2 innych normalnych zdrowych dawcach (NE, LD) i 2 innych dawcachpacjentach (AM, RE). Figura 6 ilustruje, że IL-21 korzystnie indukuje tworzenie CTL o dużej awidności specyficznego dla antygenu. Poszczególne specyficzne względem MART-1 klony komórek T CD8+ wyodrębniono z hodowli stymulowanych w nieobecności (próba kontrolna) lub obecności (IL-21) IL-21. 8-12 przykładowych klonów CTL dla każdego warunku doświadczenia oceniono na powinowactwo do celu w próbie uwalniania chromu stosując komórki T2 pulsowane zmniejszanymi stężeniami peptydu M26 (analiza miareczkowa dawki peptydu). Dane wyrażono jako stężenie (nM) wymagane, by osiągnąć 50% maksymalnej lizy komórek docelowych. Przeciętnie, klony CTL tworzone przez IL-21, wykazały zmniejszone wymaganie dawki peptydu dla specyficznej lizy w porównaniu do klonów CTL tworzonych kontrolnie przy braku cytokin (* p < 0,01). A: zdrowy dawca, CG (?); B: pacjent z czerniakiem, ST (?). Te same klony oceniono na specyficzną reaktywność względem linii komórek guza MART-1+ (526) 51 przy stosunku E/T 10 do 1 w standardowej 4-godzinnej próbie uwalniania chromu (CRA). Znacząco większą lizę guza dodatniego względem antygenu (526 ?, A) z lizą w tle guza ujemnego względem antygenu (375 ?, ?) zaobserwowano w klonach CTL wyodrębnionych z hodowli poddanej działaniu IL21 niż w tych wyodrębnionych kontrolnych przy braku cytokin. (? p< 0,01). C: zdrowy dawca, CG (?, ?); D: pacjent z czerniakiem, ST (?, ?). Wyniki są przykładami 3 normalnych zdrowych dawców i 3 dawców-pacjentów. 7 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Figura 7 ilustruje, że poddane działaniu IL-21 hodowle wzbogacają CTL wyrażając większe powinowactwo w próbie dysocjacji TCR:tetramer. Próbę dysocjacji tetrameru, która przedstawia frakcję związanego tetrameru pozostającego w czasie w obecności nadmiaru nieznaczonego tetrameru, zastosowano jako zastępczą miarę stopnia dysocjacji TCR lub powinowactwa TCR poszczególnych klonów. Frakcję klonów CTL znaczonych PE-tetramerem, MART-I-specyficznych z hodowli poddanych działaniu IL-21 (?) porównano z klonami z hodowli nie poddanych działaniu (?) w czasie (2 do 60 minut). Szybkość zmniejszania natężenia fluorescencji wybarwiania tetrameru (w procentach) od czasu 0 jest odwrotnie skorelowana z powinowactwem do TCR. Wyniki są przykładami dla 4 dawców. Figura 8 ilustruje, że hodowle poddane działaniu IL-21 dostarczają populację CTL specyficzną dla hi antygenu CD28 . Komórki zebrano z prestymulacji PBMC, a następnie 7 dni po stymulacji pulsowanymi peptydem MART-1 autologicznymi komórkami dendrytycznymi w nieobecności lub obecności IL-21. Komórki wybarwiono na MART-1-tetramer i równocześnie bądź CD45RA lub CD45 RO, CD28 i CCR7 (Figura 7). Analizę histogramu na poszczególne markery fenotypowe wykonano na bramkowanych komórkach wybarwianych MART-I-tetramerem. Ekspresja CD28 na bramkowanych komórkach wybarwianych tetramerem jest również przedstawiona dla hodowli od dnia 27 po stymulacji. Wyniki te są przykładami hodowli od 3 dawców. hi Figura 9 ilustruje wytwarzanie IL-2 po specyficznej dla antygenu stymulacji CTL wyrażających CD28 i CD28 low hi . Komórki T CD8+ MART-1-tetramer+ z hodowli poddanych działaniu IL-21 (CD28 ) lub nie poddanych działaniu IL-21 (CD28 Iow ) sortowano i współhodowano bądź z niepulsowanymi komórkami T2, samymi komórkami T2 pulsowanymi peptydem MART-1 (M26), lub z CTLA4-lg (0,5 ?g/ml) by zablokować włączenie się B7-CD28. Supernatanty zebrano 48 godzin później i poddano analizie na IL-2 przez ELISA. Obserwuje się specyficzne indukowanie wytwarzania IL-2 wśród CD28-hi wyrażających MART-I-specyficzne CTL po stymulacji antygenem, i inhibitowane przez CTLA4-lg, sugerując, że indukowanie IL-2 wśród komórek poddanych działaniu IL-21 jest zależne od CD28. Wyniki są średnią z trzech prób; przedstawiono słupki błędów. Figura 10 ilustruje wytwarzanie IL-2 po specyficznej dla antygenu stymulacji CTLs wyrażających CD28hi i CD28 low . MART-1 tetramer-dodatnie komórki CD8 z poddanych działaniu IL-21 lub nie poddanych działaniu hodowli sortowano i współhodowano bądź z niepulsowanymi komórkami T2, pulsowanymi peptydem MART-1 samymi komórkami T2 , lub z CTLA4-lg, by zablokować włączenie się B7-CD28. Supernatanty zebrano 48 godzin później i poddano analizie na IL-2 przez ELISA. Zaobserwowano specyficzne indukowanie wytwarzania IL-2 wśród CTLs wyrażających CD28 hi specyficzne względem MART-1 po stymulacji antygenem i inhibitowanie przez CTLA4-lg. Wyniki są średnią z trzech prób. 8 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Figura 11 ilustruje, że IL-21 wpływa na odpowiedź komórek T CD8 względem antygenu NY-ESO-1 i gp100. Komórki CD8 T stymulowano zarówno in vitro autologicznymi pulsowanymi DCs peptydem gp100 lub NY-ESO-1. IL-21 dodano do hodowli poddanych działaniu IL-21. Sześć dni po pierwotnej stymulacji in vitro hodowle poddano analizie na specyficzność względem antygenu i fenotyp powierzchniowy przez wybarwianie tetramerem i analizę multiparametrową przy użyciu cytometrii przepływowej. W panelu A, częstość NY-ESO-1- i GI54-specyficznego CTL przedstawiono jako procent wszystkich komórek T CD8 obok ramek. Krotność wzrostu w liczbach bezwzględnych NYESO-1-specyficznych CTLs obliczono w oparciu o liczby komórek w odpowiednich hodowlach i dla NY-ESO-1 stwierdzono, że jest niemal 20-krotnie większa wśród komórek poddanych działaniu IL-21. Panel B. Bramkowane tetramer-dodatnie komórki z hodowli kontrolnych bądź poddanych działaniu IL21 poddano analizie na ekspresję CD8. Wszystkie komórki były CD45RO+, CCR7-. Analiza histogramu dla ekspresji CD28 wśród NY-OEST-1 lub gp1000-specyficznych CTLSs wykazała znaczącą regulację ?up? wśród hodowli poddanych działaniu IL-21 w porównaniu do hodowli kontrolnych. Wyniki te są przykładami sześciu oddzielnych doświadczeń z trzech osobników HLA-2+. Figura 12 ilustruje że dodanie IL-21 do IL-6 i IL-12, do samego IL-2, IL-7 lub IL-15 znacząco wzmacnia odpowiedź komórki T CD8, w porównaniu do samego IL-6 i IL-12, IL-2, IL-7 lub IL-15. Figura 13 ilustruje że IL-21 może zwiększyć częstość komórek T do poziomów wystarczająco wysokich dla ekspansji i transferu adoptywnego bez dalszego wzbogacania specyficznych dla antygenu komórek T. OPIS WYNALAZKU Przed szczegółowym wyłożeniem wynalazku, dla jego zrozumienia może być pomocne zdefiniowanie poniższych terminów: Termin "wariant allelowy" jest stosowany w niniejszym opisie, by oznaczyć jakąkolwiek z dwóch lub więcej alternatywnych form genu zajmującego ten sam locus chromosomowy. Zmiana allellowa powstaje w sposób naturalny przez mutację, i może powodować fenotypowy polimorfizm w obrębie populacji. Mutacje genów mogą być ciche (bez zmiany w kodowanym polipeptydzie) lub mogą kodować polipeptydy mające zmienioną sekwencję aminokwasów. Termin wariant allelowy jest zatem stosowany w niniejszym opisie, by oznaczyć białko kodowane przez wariant allelowy genu. Terminy "amino-końcowy" i "karboksylo-końcowy" są stosowane w niniejszym opisie, by oznaczyć pozycje w obrębie polipeptydów. Tam, gdzie kontekst to umożliwia, terminy te są stosowane w odniesieniu do szczególnej sekwencji lub części polipeptydu, by oznaczyć bliskość lub względne położenie. Na przykład, pewna sekwencja pozycjonowana karboksylo-końcowo względem sekwencji odniesienia w polipeptydzie jest umiejscowiona blisko końca karboksylowego sekwencji odniesienia, lecz nie koniecznie przy końcu karboksylowym całego polipeptydu. 9 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Termin "rak" lub "komórka raka" jest stosowany w niniejszym opisie, by oznaczyć tkankę lub komórkę stwierdzoną w nowotworze, która posiada cechy charakterystyczne, które różnią ją od normalnej tkanki lub komórek tkanki. Wśród takich cech charakterystycznych są objęte (lecz nie są ograniczone do): stopień anaplazji, nieregularność kształtu, niewyraźny zarys komórki, wielkość jądra, zmiany struktury jądra lub cytoplazmy, inne zmiany fenotypowe, obecność białek komórkowych wskazujących na stan rakowy lub przedrakowy, zwiększona liczba mitoz i zdolność do tworzenia przerzutów. Słowa odnoszące się do "raka" obejmują rak (carcinoma), mięsak, guz, nabłoniak, białaczkę, chłoniak, polip, i rak włóknisty, transformację, nowotwór, i tym podobne. Termin "współpodawanie" jest stosowany w niniejszym opisie, by oznaczyć, że białko lub polipeptyd IL-21 i druga cząsteczka terapeutyczna mogą być podawane równocześnie lub w różnych czasach. Współpodawanie może być pojedynczym współpodawaniem zarówno IL-21 jak i drugiej cząsteczki terapeutycznej lub wielokrotnymi cyklami współpodawania. Współpodawanie nie musi być tylko jedynym czasem, gdy bądź IL-21 lub druga cząsteczka terapeutyczna jest podawana pacjentowi. Termin "terapia skojarzeniowa" jest stosowany w niniejszym opisie, by określić, że osobnikowi jest podawana co najmniej jedna terapeutycznie skuteczna dawka IL-21 i drugiej cząsteczki terapeutycznej. IL-21 może być dojrzałym polipeptydem, jego fragmentem, fuzją lub koniugatem, wykazującym biologiczną aktywność IL-21. Termin "wzmacnia" w odniesieniu do odpowiedzi immunologicznej jest stosowany w niniejszym opisie jako oznaczający zwiększenie skali i/lub skuteczności odpowiedzi immunologicznej lub rozszerzenie czasu trwania odpowiedzi immunologicznej. Termin jest stosowany zamiennie ze "zwiększa." Odpowiedź immunologiczna obejmuje, lecz nie jest ograniczona do, wzmocnioną aktywność cytolityczną, aktywność apoptyczną lub zwiększenie liczby komórek T CD8+ lub przeżycia. Termin "wyodrębniony", gdy stosuje się do polinukleotydu, oznacza że polinukleotyd został usunięty ze swojego naturalnego środowiska genetycznego i jest zatem pozbawiony innych nieistotnych lub niepożądanych sekwencji kodujących, i jest w postaci odpowiedniej do stosowania w systemach wytwarzania białek metodami inżynierii genetycznej. Takie wyodrębnione cząsteczki są tymi, które są oddzielone od ich naturalnego środowiska i obejmują cDNA i klony genomowe. Wyodrębnione cząsteczki DNA niniejszego wynalazku są pozbawione innych genów z którymi są one zwykle związane, lecz mogą obejmować w sposób naturalny występujące 5' i 3' nietranslowane regiony, takie jak promotory i terminatory. Identyfikacja związanych regionów będzie widoczna dla osoby mającej zwykłą biegłość w dziedzinie techniki (patrz na przykład, Dynan i Tijan, Nature 316:774-78, 1985). "Wyodrębniony" polipeptyd lub białko jest polipeptydem lub białkiem, które znajduje się w stanie innym niż jego środowisko macierzyste, takim jak oddzielne od krwi i tkanki zwierzęcej. W korzystnej postaci, wyodrębniony polipeptyd jest zasadniczo pozbawiony innych polipeptydów, szczególnie innych 10 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 polipeptydów pochodzenia zwierzęcego. Korzystne jest, by dostarczyć polipeptydy w wysoce oczyszczonej postaci, tzn. czystej ponad 95%, korzystniej ponad 99% czystości. Gdy stosuje się w tym kontekście, termin "wyodrębniony" nie wyklucza obecności tego samego polipeptydu w alternatywnych postaciach fizycznych, takich jak dimery lub alternatywnie formy glikozylowane lub derywatyzowane. Termin "poziom" odnosząc się do komórek immunologicznych, takich jak komórki NK, komórki T, w szczególności cytotoksycznych komórek T, komórek B i tym podobnych, odnosi się do liczby komórek lub aktywności komórek. Zwiększony poziom jest bądź zwiększoną liczbą komórek lub wzmocnioną aktywnością funkcji komórek. Termin "poziom" odnosząc się do infekcji wirusowych odnosi się do zmiany w poziomie infekcji wirusowej i obejmuje, lecz nie jest ograniczony do, zmiany w poziomie CTLs lub komórek NK (jak opisano powyżej), zmniejszenia obciążenia wirusowego, wzrostu miana przeciwciała wirusowego, obniżenia poziomów serologicznych aminotransferazy alaninowej, lub polepszenia, jak określono przez histologiczne badanie docelowej tkanki lub organu. Oznaczenie czy te zmiany poziomu są znaczącymi różnicami lub zmianami mieści się w obrębie umiejętności osoby biegłej w dziedzinie techniki. Termin "nowotworowy", odnosząc się do komórek, wskazuje komórki podlegające nowej i anormalnej proliferacji, szczególnie w tkance, gdzie proliferacja jest niekontrolowana i postępująca, prowadząc do nowotworu. Komórki nowotworowe mogą być bądź złośliwe, tzn. inwazyjne i przerzutowe, lub łagodne. "Polinukleotyd" jest jedno- lub dwuniciowym polimerem zasad deoksyrybonukleotydu lub rybonukleotydu odczytanych od końca 5' do końca 3'. Polinukleotydy obejmują RNA i DNA, i mogą być wyodrębnione ze źródeł naturalnych, zsyntetyzowane in vitro, lub wytworzone z kombinacji naturalnych i syntetycznych cząsteczek. Wielkości polinukleotydów są wyrażone jako pary zasad (w skrócie "bp"), nukleotydów ("nt"), lub kilozasad ("kb"). Tam gdzie kontekst to umożliwia, ostatnie dwa terminy mogą opisywać polinukleotydy, które są jednoniciowe lub dwuniciowe. Gdy termin jest zastosowany do cząsteczek dwuniciowych jest stosowany, by oznaczyć całkowitą długość i będzie rozumiany jako równoważny z terminem "pary zasad". Będzie to uznane przez biegłych w dziedzinie techniki, że dwie nici dwuniciowego polinukleotydu mogą różnić się nieznacznie co do długości i że końce ich mogą być przesunięte w wyniku rozszczepienia enzymatycznego; tak więc wszystkie nukleotydy w obrębie cząsteczki dwuniciowej polinukleotydu mogą nie być sparowane. "Polipeptyd" jest polimerem reszt aminokwasowych połączonych przez wiązania peptydowe, czy to wytworzonych w sposób naturalny lub syntetycznie. Polipeptydy o mniej niż około 10 resztach aminokwasowych są powszechnie nazywane "peptydami". 11 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 "Białko" jest makrocząsteczką obejmującą jeden lub więcej łańcuchów polipeptydowych. Białko może zatem obejmować niepeptydowe składniki, takie jak grupy węglowodanowe. Węglowodany i inne niepeptydowe podstawniki mogą być dodawane do białka przez komórkę w której białko jest wytwarzane, i będą się zmieniać wraz z typem komórki. Białka są określone w niniejszym opisie w kategoriach ich struktur szkieletu aminokwasów; podstawniki takie jak grupy węglowodanowe są zasadniczo nie wyszczególnione, lecz mimo to mogą być obecne. Termin "receptor" oznacza związane z komórką białko, które wiąże się z bioaktywną cząsteczką (tzn. ligandem) i pośredniczy we wpływie ligandu na komórkę. Związane z błoną receptory cechują się wielopeptydową strukturą obejmującą pozakomórkową domenę wiążącą ligand i śródkomórkową domenę efektora, która jest typowo zaangażowana w przetwarzanie sygnału. Wiązanie ligandu do receptora prowadzi do zmiany konformacyjnej w receptorze, która powoduje oddziaływanie między domeną efektora i inną cząsteczką (cząsteczkami) w komórce. To oddziaływanie z kolei prowadzi do zmiany w metabolizmie komórki. Zdarzenia metaboliczne, które są związane z oddziaływaniami receptor-ligand obejmują transkrypcję genu, fosforylację, defosforylację, zwiększenie wytwarzania cyklicznego AMP, uruchomienie wapnia komórkowego, mobilizację lipidów błony, adhezję komórkową, hydrolizę lipidów inozytolu i hydrolizę fosfolipidów. Ogólnie, receptory mogą być związane z błoną, cytozolowe lub jądrowe; monomeryczne (np. receptor hormonu stymulowania tarczycy, receptor betaadrenergiczny) lub multimeryczne (np. receptor PDGF, receptor hormonu wzrostu, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor erytropoetyny i receptor IL-6). Masy cząsteczkowe i długości polimerów oznaczane przez nieprecyzyjne metody analityczne (np., elektroforezę żelową) będą rozumiane jako wartości przybliżone. Gdy taka wartość jest wyrażona jako "około" X lub "w przybliżeniu" X, podana wartość X będzie rozumiana jako dokładna do ?10%. Niniejsze ujawnienie dotyczy zastosowania IL-21 do wzrostu proliferacji i przeżycia specyficznych dla antygenu komórek T. Wzmocnienie przez IL-21 specyficznych dla antygenu komórek T będzie przydatne dla zwiększenia częstości specyficznych dla antygenu komórek T, wzbogacenia populacji specyficznych dla antygenu komórek T o wzmocnionym powinowactwie, i tworzenia populacji specyficznych dla antygenu komórek T o zwiększonej ekspresji CD28 i "niezależnego od pomocnika" fenotypu (Widmer et al., Nature 294:750, 1981;Topp et al., J. Exp Med 198(6):947, 2003; Cheng et al., J lmmunol 169:4990, 2002). W pewnych aspektach niniejsze ujawnienie dostarcza sposoby, które obejmują hodowanie naiwnych komórek T w obecności kompozycji IL-21 i antygenu prowadząc do populacji cytotoksycznych komórek T, która ma większe powinowactwo do antygenu niż komórki T hodowane w nieobecności IL21. Szczególnie ważne są antygeny guzów. Specyficzne dla antygenu, o wysokim powinowactwie komórki T mają zdolność rozpoznawania i zabijania guza, podczas gdy komórka T o małym powinowactwie może mieć specyficzność względem antygenu guza, jednak wciąż nie rozpoznaje ani nie zabija komórki guza. Powinowactwo komórki T do guza jest w części zależne od gęstości 12 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 antygenu, który jest prezentowany przez komórkę nowotworu. Jeśli prezentacja antygenu na komórce guza jest niska, wtedy jest bardziej prawdopodobne, że jedynie wysokie powinowactwo komórek T będzie zdolne do rozpoznawania komórki guza i zapoczątkowania cytolizy. Sposoby niniejszego wynalazku (jak określono w zastrzeżeniach) mogą być stosowane do wzrostu częstości komórek T do poziomów wystarczająco wysokich dla ekspansji i adoptywnego transferu komórek bez dalszego wzbogacania specyficznych dla antygenu komórek T i w ten sposób do znacznego obniżenia czasu terapii i zbyteczności wymagania dalszej selekcji lub klonowania. W innym aspekcie niniejszego ujawnienia, sposoby opisane w niniejszym opisie obejmują tworzenie populacji specyficznego dla antygenu CTL, który ma wysokie powinowactwo do autoantygenów, przez hodowanie komórek T, które zróżnicowały się nie-końcowo względem kompozycji IL-21. W jednym wykonaniu, komórki T są wyodrębnionymi naiwnymi komórkami T. Gdy specyficzna dla antygenu populacja komórek T została ekspandowana ex vivo, komórki są ponownie wprowadzane do pacjenta. W pewnych wykonaniach, podawanie IL-21 pacjentowi będzie kontynuowane i może być kojarzone z innymi terapiami. W innym aspekcie, niniejsze ujawnienie dostarcza sposoby zwiększenia repertuaru antygenów rozpoznawanych przez populację komórek T. Sposoby te obejmują współhodowanie materiału guza, takiego jak linia komórek guza lub jej pochodnej (np. całkowity RNA, poddane lizie komórki guza, ciała apoptotyczne) z autologicznymi komórkami T wyodrębnionymi z osobnika. Materiał guza i komórki T są hodowane w obecności kompozycji IL-21, i po pozostawieniu komórek T do proliferacji, komórki T są klonowane. Identyfikuje się specyficzne dla antygenu komórki T i dalej poddaje analizie by scharakteryzować specyficzność wzgledem antygenu. A. Opis IL-21. Ludzkie IL-21 (SEQ ID NO: 1 i SEQ ED NO:2) było pierwotnie określane jako ligand zalpha11, i jest opisane w będących wspólną własnością Opisach patentowych USA nr. 6,307,024, i 6,686,178. Receptor IL-21 jest opisany w U.S. 6,057,128. Receptor IL-21 , uprzednio określany zalpha11 (SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6), i heterodimeryczny receptor IL-21 R/IL-2Ry są również opisane w będących wspólną własnością Opisach patentowych USA 6,576,744, 6,803,451, 6,692,924 i WO 00117235. Jak opisano w tych publikacjach, IL-21 wyodrębniono z biblioteki cDNA tworzonej z aktywowanych komórek ludzkiej krwi obwodowej (hPBCs), które wybrano dla CD3. CD3 jest markerem powierzchni komórkowej unikatowym dla komórek pochodzenia limfoidalnego, szczególnie komórek T. Sekwencja aminokwasów dla IL-21 R wskazała, że kodowany receptor należał do podrodziny receptora cytokin Klasy I, która obejmuje, lecz nie jest ograniczona do, receptorów dla IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF i G-CSF (odnośnie przeglądu patrz: Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" w: Cytokine 5(2): 95-106, 1993). Receptor IL-21 zidentyfikowano na komórkach NK, komórkach T i komórce B wskazując, że IL-21 działa na hematopoetyczną linię rodu 13 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 komórek, w szczególności komórek progenitora limfoidalnego i komórek limfoidalnych. Inne znane cytokiny z wiązką czterohelisową, które działają na komórki limfoidalne obejmują IL-2, IL-4, IL-7, i IL15. Odnośnie przeglądu cytokin z wiązką czterohelisową, patrz: Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52: 1-65, 1999 i Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76:300-317, 1998. W przypadku IL-21, wydzielnicza sekwencja sygnałowa jest złożona z reszt aminokwasowych 1 (Met) do 29 (Ser), a dojrzały polipeptyd jest złożony z reszt aminokwasowych 30 (Gin) do 162 (Ser) (jak przedstawiono w SEQ ID NO: 2). Odpowiadająca temu sekwencja polinukleotydu jest przedstawiona w SEQ ID NO:1. Biegli w dziedzinie techniki uznają, że sekwencja ujawniona w SEQ ID NO:1 przedstawia pojedynczy allel ludzkiego IL-21 i że można się spodziewać występowania zmiany allellowej oraz alternatywnego splicing (składania genu). B. Stosowanie terapii szczepionką IL-21, adoptywnej immunoterapii i identyfikacji specyficznych antygenów guza. Niniejszy wynalazek (jak określono w zastrzeżeniach) jest oparty w części na badaniu zarówno ludzkich zdrowych dawców jak i pacjentów z czerniakiem, gdzie wykazano dodatnią rolę regulacyjną IL-21 w indukowaniu pierwotnej odpowiedzi specyficznych dla antygenu ludzkich komórek T CD8+. Stosując tetramery peptyd-MHC, by śledzić rzadką lecz mierzalną populację naiwnych komórek T rozpoznającą normalny autoantygen, w obecności IL-21, częstość i liczby bezwzględne specyficznych dla antygenu komórek T CD8 mogły być wyzwalane z ponad 20-krotnym zwiększeniem w porównaniu do hodowli prowadzonych w nieobecności IL-21. Wzmocnione tworzenie odpowiedzi specyficznych dla antygenu komórek T jest specyficzne dla tej cytokiny receptora łańcucha gamma, ponieważ dodanie IL-2, IL-7 lub IL-15 podczas początkowego primingu nie dało dodatkowego efektu względem hodowli, które nie otrzymały cytokin. Wystawione na działanie IL-21 i primowane antygenem komórki T zachowały zdolność do odpowiadania na cytokiny sprzyjające wzrostowi, takie jak IL-2 i IL-7, i mogły być łatwo wyodrębnione i ekspandowane. Niniejszy wynalazek dostarcza wzmocnione przez IL-21 tworzenie ludzkich specyficznych dla antygenu komórek T CD8+ cechujących się regulacją ?up? CD28 i ekspresją TCR o wysokim powinowactwie prowadzącym do kierowanego przez antygen niezależnego od pomocnika wytwarzania IL-2, zwiększonej awidności celu, oraz zwiększonego zabijania guza specyficznego dla antygenu. Niniejszy wynalazek dostarcza sposoby, jak określono w zastrzeżeniach, w których IL-21 jest stosowany do indukowania odpowiedzi ludzkich specyficznych dla antygenu komórek T CD8+, co jest przydatne do immunoterapii, szczególnie adoptywnej terapii komórkowej. W badaniach opisanych w niniejszym ujawnieniu, zwiększona przez IL-21 odpowiedź specyficzna dla antygenu była ograniczona do populacji komórek T naiwnych, a nie pamięci immunologicznej stosując preselekcjonowane responderowe komórki T. Naiwne komórki T nie napotkały uprzednio antygenu i mają potencjał, by rozpoznać i wiązać pojedynczy, unikatowy antygen. Antygen guza jest peptydem lub polipeptydem lub kompleksem peptydu, który ma różny profil ekspresji od antygenu stwierdzonego 14 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 na komórkach nie-guza. Na przykład, antygen nie-guza może być wyrażony z wyższą częstością lub gęstością przez komórki guza niż przez komórki nie-guza. Antygen guza może się różnić od antygenu nie-guza strukturalnie, na przykład, antygen mógł być wyrażony jako obcięty polipeptyd, mający pewne mutacje w sekwencji aminokwasów lub sekwencji polinukleotydu kodującej antygen, mógł być nieprawidłowo zwijany, lub nieprawidłowo zmodyfikowany post-translacyjnie. Podobieństwo do antygenów, które są obecne na normalnych, nie-guzowych komórkach w organizmie gospodarza umożliwia komórkom guza unikanie immunologicznych mechanizmów kontrolnych gospodarza. Obserwacja, że antygeny związane z guzem tworzyły specyficzne odpowiedzi immunologiczne, które atakowały guzy dały badaczom podstawę do tego, by opracować terapie raka według antygenów specyficznych dla guza. Jednak, guzy poddają ekspresji mnóstwo antygenów, z których wiele nie zostało wyodrębnionych ani scharakteryzowanych. Ponadto, nie wszystkie antygeny guzów ulegają ekspresji na poziomach wystarczających, by stymulować dostateczną odpowiedź immunologiczną. W ostatnich latach, wiele genów kodujących antygeny guzów które mogą być rozpoznawane przez cytotoksyczne limfocyty T zidentyfikowano z cDNA ludzkich komórek guza (Gomi et al., J. Immunol. 163:4994-5004, 1999.) Przykłady obejmują geny HER/neu (Peoples et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 92:432-436, 1995) i mutanta CASP-8 (Mandruzzato et al., J. Exp. Med., 186:785-793, 1997). Komórki T specyficzne dla antygenu guza mogą być wyodrębnione od pacjentów, jednak utrzymywanie tych hodowli komórek T było trudne. Komórki T specyficzne dla antygenu guza mogą być zlokalizowane we krwi, w tkance limfoidalnej, takiej jak śledziona, lub mogą być z samego guza. Zasadniczo, tkanka guza jest poddawana biopsji i zawiesinę komórek hoduje się in vitro. Wykazano, że specyficzne dla antygenu komórki guza w obecności cytokiny, takiej jak IL-2, IL-7, IL-4, i IL-15, przeżywają dłużej (Vella et al., PNAS 95:3810-3815, 1998). W bieżącym wynalazku, dodanie IL-21 do hodowli specyficznych dla antygenu guza komórek T w obecności pierwotnej prezentacji antygenu przez komórki dendrytyczne prowadziło do znaczącego wzrostu bezwzględnych liczb specyficznych dla antygenu komórek T ponad te obserwowane w przypadku samych IL-15, IL-6, IL-12, 2 lub IL-7. Tak więc, niniejszy wynalazek dostarcza sposoby (jak określono w zastrzeżeniach) identyfikacji nowych antygenów specyficznych dla guza i sposobów zwiększenia populacji komórek T specyficznych dla antygenu guza, by kierować się do tych guzów przez wystawianie komórek T na działanie IL-21 (jak określono w zastrzeżeniach). Sposoby zwiększenia repertuaru antygenów rozpoznawanych przez populację komórek T przez tworzenie specyficznych dla guza linii komórkowych powstały przez wykazanie, że kompozycje IL-21 zwiększają proliferację specyficznych dla antygenu populacji komórek T, gdy antygen jest prezentowany nie-końcowo zróżnicowanym komórkom T. Sposoby te obejmują współhodowanie materiału guza, takiego jak linia komórek guza lub jej pochodna (np. całkowity RNA, poddane lizie komórki guza, ciała apoptotyczne) z autologicznymi komórkami T wyodrębnionymi z osobnika. Materiał guza i komórki T są hodowane w obecności kompozycji IL-21 , i po pozostawieniu komórek T do proliferacji, komórki T są wzbogacane, na przykład komórki T mogą być klonowane. W pewnych wykonaniach, zapotrzebowanie na IL-2 lub inne czynniki wzrostu jest minimalizowane przez podawanie IL-21. W innych wykonaniach, nie jest niezbędne, by komórki T 15 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 CD4+ były obecne w hodowli. Specyficzne dla antygenu komórki T są identyfikowane, a dalej są poddawane analizie, by scharakteryzować specyficzność względem antygenu. (patrz, van der Bruggen Science 254: 1643, 1991 i Engelhard et al., Mol. Immunol. 39: 127, 2002). wiadomo, że większa liczba specyficznych względem MART-1 komórek T przebywa wśród populacji naiwnej (Pittet et al, J. Exp. Med. 190:705, 1999) jednak mierzalne częstości specyficznych względem MART-I komórek T mogą być także wykryte wśród populacji pamięci immunologicznej (D'Souza et al., Int. J. Cancer 78:699, 2004), a jednak te nie ekspandowały, gdy dodano IL-21. W przypadku pacjentów z czerniakiem, uprzednie spotkanie z komórkami guza niosącymi antygen może prowadzić do wadliwego sygnalizowania wśród komórek T pamięci immunologicznej czyniąc je nieodpowiadającymi na pośredniczoną przez IL-21 proliferację in vitro (Zippelius, et al, Cancer Res. 64:2865, 2004; Lee et al., Nature Medicine 5:677. 1999). Primowane antygenem komórki T podlegają zwiększonej proliferacji i zmniejszonej apoptozie, gdy są wystawione na działanie IL-21 w porównaniu do ich odpowiedników nie poddanych działaniu, dostarczając zatem sposobów wzmocnienia pośredniczonych przez komórki T szczepionek oraz dostarczenia adiuwanta dla immunoterapeutycznego leczenia raka. Działanie IL-21 prowadziło do regulowanej ?up? ekspresji CD28 i wzbogacając populacją komórek T wyrażenie trwałego, hi unikatowego fenotypu, CD45RO+, CD28 , CCR7- CD8+. Ten fenotyp może być scharakteryzowany jako pośredni między komórką T naiwną (CD45RO-, CD28+, CCR7+) i komórką T pamięci immunologicznej (CD45RO+, CD28-, CCR7-/+) (Tomiyama, et al., J. Exp. Med. 198:947, 2003). Komórki T CD8+ CD28+ stanowią potencjalnie bardziej skuteczne CTL dla immunoterapii adoptywnej ponieważ mogą one dostarczyć kierowany przez antygen autowydzielniczy sygnał dla proliferacji. Takie niezależne od pomocnika komórki T CD8 nie wymagałyby egzogennej pomocy w postaci IL-2 lub komórek T CD4+, by przeżywać i ekspandować (Ho et al., Cancer Cell 3:431.2003; i Topp et al., J. Exp. Med. 198:947, 2003). Tak więc, niniejsze ujawnienie dostarcza leczenia immunopośredniczonej choroby przez dostarczenie osobnikowi populacji komórek T CD8+, mającej wzmocnioną aktywność cytotoksyczną w nieobecności lub zmniejszonej obecności dodatkowych cytokin, takich jak IL-2, lub komórki T CD4+. Sposoby są szczególnie przydatne do ex vivo ekspansji cytolitycznych, specyficznych dla antygenu komórek T CD8+, lecz mogą także być stosowane in vivo, gdy dodatkowe cytokiny powodują niepożądane efekty uboczne lub populacje komórek CD4+ są upośledzone. Przykłady ujawnione w niniejszym opisie dowodzą, że wystawienie na działanie IL-21 podczas pierwotnej stymulacji in vitro także prowadziło do tworzenia specyficznych dla antygenu klonów komórek T o jednolicie większym powinowactwie i awidności komórek docelowych. Klony te były reprezentowane przez różne Vbetas TCR sugerując, że nie było to prawdopodobnie wynikiem ekspandowanej populacji kilku klonów o wysokim powinowactwie, lecz bardziej globalnym wpływem na repertuar komórek T. Poprzednie badania wykazały zwiększone prawdopodobieństwo wyodrębnienia klonów komórek T o większym powinowactwie, gdy cytokiny takie jak IL-10, które regulują ?down? zdolność stymulującą APCs, są stosowane w hodowli (Tsai et al., Critical Rev. 16 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Immunol. 18:65, 1998). Wykazano, że IL-21 (Brandt et al., Blood 102:4090, 2003) prowadzi do zatrzymania dojrzewania wśród mysiego DC prowadząc do zmniejszonej ekspresji MHC i zmniejszonej zdolności stymulującej dla aktywacji komórek T. Jednak, w tym przypadku, IL-21 dodano do ludzkich DCs, które już uległy pełnemu dojrzewaniu. We wstępnych badaniach, dodanie IL-21 do dojrzałego DC nie wpłynęło na powierzchniową ekspresję Klasy I MHC, HLA-DR, CD80, CD83 lub CD86 w porównaniu do tych nie poddanych działaniu DC. W zamierzeniu nie wiążąc się z teorią, wyniki sugerują, że tłumiona ekspresja powierzchniowych cząsteczek stymulujących nie jest prawdopodobnie wyjaśnieniem zwiększonego tworzenia komórek T o wysokim powinowactwie in vitro. Preinkubacja dojrzałego ludzkiego DC IL-21 także nie miała wpływu na częstość lub powinowactwo komórek T CD8+ tetramer+, które mogły być tworzone. Stosowanie IL-21 w zwiększaniu odpowiedzi specyficznych dla antygenu komórek T CD8 zbadano w modelach myszy i stwierdzono wysoką skuteczność w wykorzenianiu agresywnych guzów (Ma et al., J. Immunol. 171:608, 2002; Kishida et al., Mol. Ther. 8:552, 2003; Moroz et al., J. lmmunol 173:900, 2003). Selektywny wpływ IL-21 na naiwne komórki T względem komórek T pamięci immunologicznej sugeruje większy wpływ podczas primingu, i w istocie, badania z myszami dowodzą silnego efektu primingu cechującego się powolnym odrzuceniem odpowiedzi i indukowaniem przedłużonej pamięci względem guza. IL-21 sprzyja długotrwałemu przeżyciu uprzednio aktywowanych specyficznych dla antygenu komórek T CD8 in vivo jako wynik zmniejszonej apoptozy przez nieokreślony mechanizm możliwie angażujący fosforylację STAT3 lub indukowanie centralnego fenotypu pamięci (Brenne et al., Blood 99:3756, 2002). Pewne z tych efektów można przypisać regulacji ?up? CD28 wśród traktowanych IL-21 komórek T CD8. Metody stosowania populacji komórek T do adoptywnej terapii komórkowej w leczeniu osobników ludzkich są znane klinicystom biegłym w dziedzinie techniki. Populacje komórek T wytworzone zgodnie ze sposobami opisanymi w niniejszym opisie i znanymi w dziedzinie techniki mogą być stosowane w takich metodach. Na przykład, adoptywną terapię komórkową stosującą limfocyty infiltrujące guz, z komórkami T specyficznymi względem antygenu MART-1 zbadano w klinice (Powell et al., Blood 105:241-250, 2005). Pacjentów z rakiem komórek nerki szczepiono napromieniowanymi autologicznymi komórkami guza. Zebrane komórki wtórnie aktywowano przeciwciałem monoklonalnym anti-CD3 oraz IL-2, a następnie ponownie podawano pacjentom (Chang et al., J. Clinical Oncology 21 :884-890, 2003.) Niniejsze ujawnienie dostarcza sposoby zwiększenia adoptywnej immunoterapii przez dostarczenie pacjentowi poziomu wzmocnionej odporności przez stymulowanie komórek ex vivo, i następnie ponowne podawanie ich pacjentowi. Komórki są zgodne tkankowo z osobnikiem, i mogą być alogeniczne lub autologiczne. Sposób wytwarzania obejmuje wyodrębnienie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) od pacjenta, ekspandowanie tych komórek w hodowli do bardzo dużych liczb w pożywce hodowli obejmującej kompozycję IL-21, a następnie ponowne wprowadzanie tych komórek z powrotem do pacjentów. Wzrost tych komórek efektorowych, który 17 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 obejmuje komórki NK, komórki LAK, i specyficzne dla guza komórki T, może wymagać dodatkowych cytokin takich jak IL- 2 (Dudley et al., J. Immunother. 24:363-73, 2001) lub IL-15 (Marks-Konczalik et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 11445-50 2000; Waldmann TA. Nat Med., 9:269-77, 2003; Fehniger et al., Cytokine Growth Factor Rev., 13: 169-83, 2002.). Po transferze komórek z powrotem do pacjentów, są stosowane sposoby, by zachować ich zdolność do życia przez działanie na pacjentów cytokinami, które mogłoby obejmować IL-21 i IL-2 (Bear et al., Cancer Immunol. Immunother. 50:26974, 2001; i Schultze et al., Br. J. Haematol. 113:455-60,2001). Alternatywnie, gdy PBMCs są wyodrębnione, komórki mogą być dalej wyodrębniane, by dostarczyć bardziej homogenną hodowlę komórek CD8+, i te komórki są hodowane w obecności kompozycji IL-21, a następnie ponownie podawane pacjentowi. Ponieważ IL-21 może zwiększyć częstość komórek T do poziomów wystarczająco wysokich dla ekspansji i transferu adoptywnego bez dalszego wzbogacania komórek T specyficznych dla antygenu, niniejszy wynalazek dostarcza sposoby, które mogą znacznie obniżyć czas terapii i uczynić zbędnym wymaganie dalszej selekcji i/lub klonowania. Niniejsze ujawnienie dostarcza sposób wytwarzania populacji komórek T do stosowania w immunoterapii adoptywnej obejmując identyfikowanie PBMCs posiadających zgodny tkankowo fenotyp z pacjentem mającym guz; współhodowanie materiału guza od pacjenta z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMCs) w obecności kompozycji IL-21 i komórek prezentujących antygen (APCs), takimi jak autologiczne komórki dendrytyczne, monocyty, komórki B, transformowane przez EBV linie komórkowe B, alogeniczne transformowane przez EBV linie komórkowe B poddające ekspresji wspólny allel ograniczający, sztuczne komórki prezentujące antygen (Yee et al., Proc Natl Acad Sci. 99(25):16168. 2002; Oelke et al., Nat Med. 9(5):619-24, 2003; Maus et al., Clin Immunol. 106(1):16-22. 2003; Cai et al., lmmunol Rev. 165:249-65, 1998); ekspandowanie tych komórek w hodowli; i ponowne wprowadzanie tych komórek z powrotem do pacjenta. PBMCs mogą być autologiczne. Materiał guza może obejmować peptyd, całkowity RNA, poddane lizie komórki guza lub ciała apoptotyczne. Niniejsze ujawnienie dostarcza także sposób wytwarzania populacji komórek T do stosowania w immunoterapii adoptywnej obejmując identyfikowanie populacji komórek T mających zgodny tkankowo fenotyp z pacjentem mającym guz; współhodowanie materiału guza od pacjenta z populacją komórek T w obecności kompozycji IL-21 i APCs; ekspandowanie tych komórek w hodowli; i ponowne wprowadzanie tych komórek z powrotem do pacjenta. Populacja komórek T może być autologiczna (Dudley et al., Science 290:850, 2002). Niniejsze ujawnienie dostarcza sposób wytwarzania populacji komórek T do stosowania w immunoterapii adoptywnej obejmującej komórki T, komórki szpiku kostnego lub PBMCs (włączając komórki NK) poddane metodom inżynierii genetycznej (przez wirusową transdukcję, transfekcję, elektroporację lub inne metody wprowadzania materiału genetycznego), by poddać ekspresji receptor komórek T lub receptor chimerycznych komórek T poddany fuzji z cząsteczkami sygnałowymi, które rozpoznają docelowy antygen; hodowanie w obecności kompozycji IL-21 ; ekspandowanie tych 18 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 komórek w hodowli; i ponowne wprowadzanie tych komórek z powrotem do pacjenta. (Hughes et al., Hum Gene Ther 16(4):457, 2005; Roszkowski et al., Cancer Res 65(4):1570, 2005; Cooper et al., Blood 101: 1637, 2003; Alajez et al., Blood 105:4583, 2005). Populacja komórek T może być autologiczna. Niniejsze ujawnienie także dostarcza sposoby ulepszenia terapii szczepionką na raka. Wiele guzów poddaje ekspresji obce antygeny, które mogą potencjalnie służyć jako cele dla destrukcji przez układ immunologiczny (Boon, T., Adv. Cancer Res. 58.177-21 I , 1992). Szczepionki na raka tworzą u osobnika układową specyficzną dla guza odpowiedź immunologiczną, która obejmuje składniki zarówno humoralny jak i komórkowy. Odpowiedź jest wyzwalana przez własny układ immunologiczny osobnika przez podawanie kompozycji szczepionki w miejscu odległym od guza lub w miejscu zlokalizowanego guza. Przeciwciała lub komórki immunologiczne wiążą antygen guza i poddają lizie komórki guza. Jednak, pozostaje potrzeba zwiększonej proliferacji populacji komórek T zdolnych do wytworzonych wzmocnionych odpowiedzi immunologicznych in vivo. Były stosowane liczne sposoby uodporniania pacjentów antygenami raka, i stosuje się wiele technik, by wzmacniać siłę odpowiedzi immunologicznych po dostarczeniu antygenu (przegląd zawarty w: Rosenberg, SA. (Ed.), Principles and practice of the Biologic Therapy of Cancer., 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2000). Metody, w których można stosować IL-21 skojarzone ze szczepionką przeciw guzowi obejmują, lecz nie są ograniczone do, dostarczenie autologicznych i alogenicznych komórek guza, które bądź poddają ekspresji gen IL-21 lub w których IL-21 jest dostarczane w kontekście białka adiuwanta. Podobnie, IL-21 może być dostarczane skojarzone z iniekcją oczyszczonego białka antygenu guza, antygen guza poddany ekspresji z wstrzykniętego DNA, lub peptydy antygenu guza, które są prezentowane komórkom efektorowym stosując terapie oparte na komórkach dendrytycznych. Przykłady tych typów terapii obejmują użycie cytokin jak IL-2 w kontekście szczepienia modyfikowanymi komórkami guza (Antonia et al., J. Urol. 167:1995-2000, 2002; i Schrayer et al., Clin. Exp. Metastasis 19:43-53, 2002), DNA (Niethammer et al., Cancer Res. 61:6178-84, 2001), i komórek dendrytycznych (Shimizu et al., Proc. Nat. Acad. Sci USA 96:2268-73, 1999). IL-21 może być stosowane jako adiuwant szczepionki przeciw rakowi. Określenie skuteczności szczepionki jest trudne do oceny. Ostatecznym wykazaniem skuteczności jest szybkość regresji guza, czas trwania przeżycia bez choroby, lub, co najmniej, czas do progresji (TTP), te punkty końcowe wymagają przez lata śledzenia postępu u pacjenta. Aby dostarczyć bardziej bezpośredni środek oceny skuteczności ma miejsce trwające poszukiwanie tak zwanych "zastępczych markerów", które umożliwiłyby wczesne pomiary oraz przewidywanie wyniku klinicznego. Według stanu na dziś, pomiary in vitro odpowiedzi immunologicznych specyficznych dla guza i/lub szczepionki nie okazały się pomyślne jako zastępcze markery (patrz, Srivastava P., Nat Immunol. 1:363-366, 2000). 19 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 W przypadku jakiejkolwiek terapii raka każdy protokół może określić oceny odpowiedzi guza różnie, lecz przykładowe wytyczne można znaleźć w: Clinical Research Associates Manual, Southwest Oncology Group, CRAB, Seattle, WA, 6 paźdz. 1998, aktualizacja sierpień 1999. Zgodnie z the CRA Manual (patrz, Rozdział 7 "Response Accessment"), odpowiedź guza oznacza zmniejszenie lub eliminację wszelkich mierzalnych zmian chorobowych lub przerzutów. Choroba jest zasadniczo uważana za mierzalną jeśli obejmuje dwuwymiarowo mierzalne zmiany chorobowe z jasno określonymi obrzeżami przez fotografię medyczną lub rentgena, skomputeryzowaną tomografię osiową (CT), obrazowanie przez rezonans magnetyczny (MRI), lub obmacywanie. Choroba ocenialna oznacza, że choroba obejmuje jednowymiarowo mierzalne zmiany chorobowe, masy z obrzeżami nieokreślonymi klarownie, zmianę chorobową z obydwoma średnicami mniejszymi niż 0,5 cm, zmiany chorobowe na skanie z którąkolwiek średnicą mniejszą niż odległość między cięciami, dające się obmacać zmiany chorobowe o średnicy mniejszej niż 2 cm, lub chorobę kości. Niemożliwa do oceny choroba obejmuje wysięki opłucnowe, puchlinę brzuszną, i chorobę dokumentowaną przez dowód pośredni. Uprzednio napromieniowane zmiany chorobowe, które nie postąpiły są także zasadniczo uważane za niemożliwe do oceny. Dodatni wynik terapeutyczny może być zmierzony stosując protokoły stanu obiektywnego. by ocenić odpowiedź guza litego. Przykładowe kryteria obejmują następujące: (1) Odpowiedź pełna (CR) określona jako całkowite zniknięcie całości mierzalnej i ocenialnej choroby bez nowych zmian chorobowych, i bez objawów związanych z chorobą. Brak dowodów choroby nieocenialnej; (2) Odpowiedź częściowa (PR) określona jako więcej niż lub równe 30% obniżenia od linii podstawowej w sumie iloczynów prostopadłych średnic wszystkich mierzalnych zmian chorobowych, bez postępu ocenialnej choroby, brak nowych zmian chorobowych. Zgodnie z kryteriami RESIST, pacjenci z co 2 najmniej jedna mierzalną zmianą chorobową; (3) Postęp określony jako 20% lub wzrost 10 cm w sumie iloczynów mierzalnych zmian chorobowych przez najmniejszą zaobserwowaną sumę stosując te same techniki jak w przypadku linii podstawowej, lub wyraźne pogorszenie się jakiejkolwiek ocenialnej choroby, lub ponowne pojawienie się jakiejkolwiek zmiany chorobowej, która znikła, lub pojawienie się jakiejkolwiek nowej zmiany chorobowej, lub niemożliwość powrotu do oceny wskutek śmierci lub pogorszenia stanu (o ile nie jest to niezwiązane z tym rakiem); (4) Odpowiedź stabilna lub brak odpowiedzi określony jako nie kwalifikujące się do CR, PR, lub postępu. (patrz, Clinical Research Associates Manual, supra.) Wynalazek jest dalej ilustrowany przez następujące nieograniczające przykłady. PRZYKŁADY Przykład 1 A. Linie komórkowe i reagent 20 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Linie komórkowe czerniaka A375 (CRL 1619; American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA), i Mel 526 (Arrighi et al., Cancer Res. 60 16 :4446-52, 2000; Marcinola et al. J lmmunother Emphasis Tumor Immunol. 19(3):192-205, 1996.) utrzymywano w RPMl z HEPES (25 mM), Lglutaminą (4 mM), penicyliną (50 U/ml), streptomycyną (50 mg/ml), pirogronianem sodu (10 mM), nieniezbędnymi aminokwasami (1 mM), i 10% surowicą płodu bydlęcego (Hyclone, Utah). Obydwie linie poddają ekspresji allel HLA-A2 lecz tylko Mel 526 poddaje ekspresji antygen MART-1. Linia komórkowa T2 jest hybrydą komórek T-B z niedoborem TAP poddającą ekspresji allel HLA-A2. Linie komórkowe EBV-LCL są transformowanymi wirusem Epsteina-Barra liniami komórkowymi limfoblastoidów (Yee, FHCRC, Seattle, WA). B. Indukowanie ludzkich, specyficznych dla antygenu komórek T CD8+ Wytworzono komórki T specyficzne względem peptydu M26-35 czerniaka (Yee et al., PNAS 99:16168, 2002; Yee et al., J. Immunol. 162:2227, 1999; Tsai et al., J. Immunol. 158:1796, 1997). Krew dawców poddano określeniu typu przez HLATyping Lab w Puget Sound Blood Center (Seattle, WA). Komórki T CD8+ były najpierw wyodrębnione za pomocą zestawu do wyodrębniania CD8 dodatnich. (Dynabeads, Dynal, Oslo, Norwegia) z PBMCs leukaferezy, zawieszonych w pożywce CTL składającej się z RPMl 1640, 25 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy, penicyliny (50 U/ml), streptomycyny (50 mg/ml) (Life Technologies, Gaithersburg, MD), i 10% ludzkiej surowicy od normalnych dawców, i następnie umieszczone w szalkach do hodowli tkankowej o 6 zagłębieniach (Costar, Coming 6 Incorporated, Coring, NY) przy 6 x10 komórek/zagłębienie. Dojrzałe DCs zebrano i pulsowano 40 6 ?g/ml zsyntetyzowanych peptydów przy 2 x 10 komórek/ml w obecności 3 ?g/ml ?2 mikroglobuliny (Scripps Lab, San Diego, CA) w PBS z 1% albuminy ludzkiej surowicy (Life Technologies, Gaithersburg, MD) przez 4 godz. w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu sterylnym PBS (Life Technologies), DCs zmieszano z oczyszczonymi komórkami T CD8 przy 3 x 10 5 komórek/zagłębienie w płytce o 6 zagłębieniach. Cytokiny, IL-15 (10 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN), IL-2 (10 U/ml, Chiron, Emeryville, CA), IL-7 (10 ng/ml, R&D Systems), lub IL-21 (30 ng/ml, ZymoGenetics, Seattle, WA) dodano indywidualnie do każdego zagłębienia bezpośrednio po zainicjowaniu hodowli. IL-2 (50 IU/ml) i IL-7 (10 ng/ml) dodano jeden dzień po drugiej stymulacji by dalej ułatwić ekspansję aktywowanych specyficznych dla antygenu komórek T. DC wytworzono (Bender et al., J. Immunol. Methods 196:121, 1996) przez wystawianie przylegającego PBMC na działanie IL-4 (500 U/ml, R&D) i GM-CSF (800 U/ml, Amgen, Thousand Oaks, CA) w pożywce AIM-V? (Life Technologies), po czym nastąpiło dojrzewanie z użyciem IL-1? przy 2 ng/ml, IL-6 przy 1000 U/ml, TNF-? przy 10 ng/ml (R&D Systems) i PGE-2 przy 1 ?g/ml (SigmaAldrich, St. Louis, MO) przez dodatkowe 2 dni. Dnia 8 dojrzała populacja DC zawierała ponad 90% CD83+ DCs jak określono przez analizę FACS. C. Wybarwianie komórek T tetramerem peptyd-MHC plus przeciwciałem 21 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Znaczone PE lub APC tetramer M26-MHC i tetramery G154-MHC wytworzono w laboratorium monitoringu immunologicznego w Fred Hutchinson Cancer Center w oparciu o uprzednio opisane 6 protokoły (Altman et al., Science 274:94, 1996). W celu analizy próbki, 0,5 x 10 komórek w 25 ?l 2% FCS/PBS najpierw wybarwiono stosując tetramer peptydu -PE lub APC (końcowe stężenie 20 ?g MHC/ml) przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie wybarwianie przez anti-CD28APC (BD, PharMingen, San Diego, CA) lub anti-CD28-FITC (Caltac Lab, Burlingame, CA), anti-CCR7PE i anti-CD45RO lub anti-CD45RA-FITC (BD, PharMingen, San Diego, CA) przez 20 min w 4°C. Po przemyciu PBS, komórki ponownie zawieszono w PBS zawierającym 2% FBS i dodano DAPl. Dane zebrano stosując cytometr przepływowy FACScalibur i CellQuest (BD) i poddano analizie stosując oprogramowanie FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA). D. Wzbogacenie podzbiorów naiwnego i pamięci immunologicznej Komórki T oczyszczono z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przez sekwencyjne stosowanie kombinacji koralików magnetycznych i sortownicy magnetycznej Automacs (Miltenyi Biotech, Auburn California). Komórki CD8+ wyodrębniono stosując selekcję negatywną przy użyciu zestawu II do wyodrębniania CD8. Kolejna selekcja naiwnych (CD8+CD45RO-CD45RA+CD62L+) komórek wiązała się z ubytkiem komórek pamięci immunologicznej CD8 stosując koralik CD45RO, następnie dodatnią selekcję komórek CD62L-dodatnich przez wybarwianie przeciwciałem CD62L skoniugowanym z PE (BD Phamingen, San Diego, CA) i inkubację koralilkiem antiPE. Wyodrębnienie komórek pamięci immunologicznej (CD8+CD45RA-CD45RO+) wiązało się z ubytkiem populacji naiwnej przy użyciu koralika CD45RA+. Typowe czystości ocenione przez FACs wyniosły ponad 95%. E. Klonowanie i ekspansja CTL specyficznego dla Ag Procedury klonowania i ekspansji, jak opisano w: Yee, -supra, 2002; Riddell et al., J. Immunolog. Methods 128:189, 1990, zastosowano, by wyodrębnić komórki T. Komórki T sortowane według tetramer+ posiano przy granicznym rozcieńczeniu na płytkach o 96 zagłębieniach z okrągłym dnem (Nalge Nunc International, Dania) w obecności napromieniowanych komórek zasilających (PBL i LCL) przy stosunku responder/ stymulator 1:50,000 razem z anti-CD3 mAb (OKT3, Ortho Tech, Raritan, NJ) i 50 U IL-21mI w 0,2 ml pożywki CTL. Zagłębienia dodatnie dla wzrostu klonalnego zidentyfikowano 10-14 dni po posianiu i poddano skriningowi w próbie mikrocytotoksyczności. Specyficzne dla peptydu klony przeniesiono do kolbek 25-cm 2 (Costar, Corning Incorporated, Coring, NY), ponownie stymulowano mAb anti-CD3, i napromieniowane alogeniczne PBL i LCL dodano jako komórki zasilające w celu szybkiej ekspansji. Hodowle zasilano IL-2 przy 50 U/ml 24 godz po ponownej stymulacji, a następnie co 3 dni. Po 14 dniach, komórki użyto do dalszych analiz lub poddano kriokonserwacji. F. Próba cytotoksyczności in vitro 22 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Komórki docelowe (linie komórkowe 375, 526 czerniaka lub komórek T2) znaczono 100 ?Ci 51 Cr i współhodowano z komórkami efektorowymi przez 4 godz w 37°C plus 5% CO2. W celu badań 1 miareczkowania dawki peptydu, T2 pulsowano peptydami przy stężeniach sięgających od 10 do 10 pg/ml przez 1 godzinę, a następnie przemyto przed znaczeniem licznikiem scyntylacji gamma i procentową specyficzną 51 lizę Cr. Uwolniony określono 51 7 Cr zmierzono stosując wzór: Procent specyficznego uwalniania = Uwalnianie doświadczalne-Uwalnianie spontaniczne/Uwalnianie całkowite. Uwalnianie spontaniczne wyniosło < 10% uwalniania całkowitego we wszystkich próbach. G. Próba dysocjacji MHC/peptyd w celu identyfikacji klonów CTL o wysokim i niskim powinowactwie Klony CTL wybarwiono stosując APC-tetramer (20 ?g/ml) przez 1 h w temperaturze pokojowej i przemyto jeden raz zimnym PBS, by wyeliminować niezwiązany tetramer. Komórki inkubowano w obecności nadmiaru (100 ?g/ml) znaczonego PE tetrameru, by zapobiec ponownemu wiązaniu APCtetrameru po ich dysocjacji z TCR. Podczas tego okresu, próbki komórek zebrano w różnych punktach czasowych i utrwalono w 1 % paraformaldehydzie w celu analizy przez cytometrię przepływową. Stopień dysocjacji APC-tetramer jest odwrotnie skorelowana z powinowactwem TCR (Dutoit et al., J. Immunol. 168, 1167, 2002). Przykład 2 IL-21 zwiększa częstość specyficznych dla antygenu komórek T CD8+ tworzonych po pierwotnej stymulacji in vitro Układ modelowy pierwotnej stymulacji in vitro specyficznych dla antygenu komórek T ustalono przez wyodrębnienie komórek T CD8+ z PBMC zdrowych dawców HLAA2+ i współhodowanie z autologicznymi dojrzałymi komórkami dendrytycznymi pulsowanymi immunogenicznymi epitopami związanego z guzem autoantygenu, MART-1 (peptyd M26-35). Hodowle wzrastały bez dodawanej cytokiny lub z IL-21 (Figura 1). Częstość specyficznych dla MART-1 odpowiedzi komórek T CD8 w hodowlach oceniono 7 dni po stymulacji przez wybarwianie tetramerem. U przykładowych zdrowych dawców (CG, NE i LD), zaobserwowano 16 do 20-krotność wzrostu częstości specyficznych względem MART-1 komórek T CD8+ w hodowlach wystawionych na działanie IL-21 w porównaniu z hodowlami z kontrolnych bez cytokin (0,12 względem 2,26% ; 0,12 względem 1,95 i 0,11 względem 2,2% odpowiednio) po jednym cyklu stymulacji in vitro (Figura 1). Bezwzględne liczby specyficznych dla antygenu komórek T tworzonych w traktowanych IL-21 hodowlach przekroczyły hodowle kontrolne ponad 20 do 30-krotnie (Tabela 1). Tabela 1 23 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 CG NE Próba kontrolna 0,22 x 10 IL-21 7,8 x 10 Krotność wzrostu 35 6 6 LD 0,30 x 10 6 0,43 x 10 6 8,15 x 10 6 14,1 x 10 6 27 33 Zastosowanie innych cytokin należących do rodziny receptora cytokin o wspólnym łańcuchu gamma, IL-2, IL-7 i IL- 15 podczas pierwotnej stymulacji in vitro nie dało żadnego dodatkowego wpływu na częstość specyficznych dla MART-1 komórek T CD8+ w porównaniu do hodowli kontrolnych przy braku cytokin (Figura 3). Dodanie IL-2 i IL-7 jednak, sprzyja ex vivo ekspansji uprzednio poddanych primingowi, komórek T, które zetknęły się z antygenem, jak wykazała nasza grupa i inne (Gervois, et al., Clin Cancer Res 6:1459-1467, 2000; Liao et al., Mol Ther 9:757-764, 2004). W przypadku dodawania do hodowli po drugiej stymulacji in vitro, IL-2 (10 U/ml) i IL- 7 (10 ng/ml) wytworzyły dalszy wzrost wielkości specyficznej względem MART-1 populacji komórek T CD8 wśród hodowli poddanych działaniu IL-21 (11,8%) względem hodowli nie poddanych działaniu (2,43%) (Figura 2, dawca CG). Badania te dowodzą, że IL-21 ma zdolność do zwiększania odpowiedzi CTL specyficznych dla antygenu związanego z guzem u pacjentów z czerniakiem, guzem, który udostępnia ekspresję MART1. U przykładowego pacjenta, częstość specyficznego dla MART-I CTL wytworzonego w hodowlach poddanych działaniu IL-21 w porównaniu z hodowlami nie poddanymi działaniu po dwóch cyklach stymulacji in vitro wykazuje 40-krotność wzrostu, gdy dodano IL-21 w porównaniu do hodowli kontrolnych nie poddanych działaniu (19,1 względem 0,46%) (Figura 2, pacjent ST). Aby ocenić, czy wzrost częstości i liczb bezwzględnych specyficznych dla antygenu komórek T CD8 wytworzonych wśród hodowli poddanych działaniu IL-21 był spowodowany wzmocnioną proliferacją i/lub wzmocnionym przeżyciem, naiwne komórki T CD8 były znaczone CFSE, stymulowane in vitro pulsowanym peptydem MART-1 autologicznym DC i dnia 7 ocenione pod względem frakcji dzielących się komórek (jak określono przez kwantowe obniżenie wybarwiania CFSE towarzyszącego każdemu podziałowi komórek) i apoptozy (wybarwianie aneksyną V). W przypadku wybarwiania CFSE, analizy wykonane na tetramerowo-dodatniej (specyficznej względem MART-1) populacji komórek T dowodzą zasadniczo większej frakcji nie dzielących się komórek (przedział z prawej) wśród hodowli nie poddanych działaniu (44%) niż wśród hodowli poddanych działaniu IL-21 (18%) (Figura 4). W istocie, stosunek szybko dzielących się (z lewej strony przedziału) do nie-dzielących się, specyficznych dla antygenu komórek T jest ponad 3-krotnie większy wśród hodowli poddanych działaniu IL-21 w porównaniu do hodowli nie poddanych działaniu (63 : 18% wobec 36 : 44%). To, że wpływ IL-21 na proliferację komórek T jest specyficzny względem antygenu wykazała duża frakcja tetrameroujemnych (niespecyficznych względem antygenu) komórek T pozostających w fazie nie dzielącej się (95,6 i 87,9%). 24 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Wybarwianie za pomocą aneksyny V tetramero-dodatnich komórek T w dniu 7 ujawnia umiarkowane zmniejszenie frakcji apoptycznych (aneksyna V+) specyficznych względem antygenu komórek T wśród hodowli poddanych działaniu IL-21 w porównaniu do hodowli nie poddanych działaniu (10,4 względem 5,4 % komórek T tetramer+ , -odpowiednio , Figura 2). Zebrane razem, wyniki te sugerują że wzrost częstości i liczb bezwzględnych specyficznych dla antygenu komórek T CD8 tworzonych wśród hodowli poddanych działaniu IL-21 należy przypisać przeważnie wzmocnionej, specyficznej względem antygenu proliferacji komórkowej, a w mniejszej części - zwiększonemu przeżyciu lub zmniejszonej apoptozie. Przykład 3 IL-21 wzmacnia odpowiedź specyficznych względem antygenu komórek T wśród przeważnie naiwnej populacji CTL. Zdolność IL-21 do wzmacniania tworzenia specyficznych dla antygenu komórek T CD8+ oceniono oddzielnie wśród komórek T naiwnych oraz wśród komórek T pamięci immunologicznej. Oczyszczone populacje naiwnych (> 98% CD45RA+, CD62L+) komórek T CD8+ były porównane z komórkami T CD8+ pamięci immunologicznej (100% CD45RO+) zarówno od zdrowego normalnego dawcy (CG) (Figura 5) jak i osobnika z przerzutami czerniaka (ST). Podczas gdy IL-21 wywiera minimalny wpływ na częstość specyficznych względem MART-1 komórek tworzonych z komórek T CD8+ pamięci immunologicznej (0,10 do 0,15 % i 0,05 do 0,037%), obserwuje się 12 do 90-krotność wzrostu wśród naiwnych komórek T CD8 po wystawieniu na działanie IL-21 (0,94 do 12,5% i 0,08 do 7,08%) uzyskując dowód, że IL-21 wpływa w pierwszym rzędzie na naiwne komórki T. Przykład 4 CTL tworzone z hodowli traktowanych IL-21 stanowi populację o wysokim powinowactwie specyficznych względem antygenu komórek T o wzmocnionej reaktywności guza By bardziej scharakteryzować funkcję populacji specyficznych względem antygenu komórek T tworzonych pod wpływem IL- 21 na poziomie klonalnym, komórki T tetramer+ CD8+ zarówno od zdrowego dawcy (CG) jak i pacjenta z czerniakiem (ST) sortowano dnia 7 i klonowano przy granicznym rozcieńczeniu do płytek o 96 zagłębieniach. Specyficzne względem MART-1 klony identyfikowane przez próby mikrocytotoksyczności ekspandowano i badano na: 1) stężenie peptydu wymagane do 50% maksymalnej lizy (P50) pulsowanych peptydem komórek T2 oraz 2) zdolność do poddawania lizie antygeno-dodatnich celów czerniaka. W celu oceny P50, transfekowaną HLA-A2 linię 7 2 komórkową EBV B, T2, zmiareczkowano stężeniami peptydu sięgającymi od 10 do 10 pM. Wyniki są przedstawione jako wymaganie dawki peptydu (nM) dla 50% lizy (P50). Klony CTL tworzone z hodowli poddanych działaniu IL-21 potrzebowały > jeden log niższe wymaganie dawki peptydu niż ich odpowiedniki nie poddane działaniu - średnia 3 nM (zakres 0,6 - 30 nM) wobec średniej 80 nM (zakres 25 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 16 - 500 nM), odpowiednio (Figura 6 A). Podobny wpływ IL-21 zaobserwowano w przypadku klonów CTL tworzonych od pacjenta z czerniakiem (ST) (Figura 6 B). Przy stosunku efektor : cel (E:T) 10:1, klony komórek T wyodrębnione po stymulacji w obecności IL-21 wykazywały znacznie wyższą specyficzną aktywność lityczną względem the MART-1-dodatniej linii komórkowej czerniaka 526 (35-45%) niż te wyodrębnione w nieobecności IL-21 (Figury 6C i 6D). Dla każdego poszczególnego klonu, zwiększona reaktywność guza zbiegła się ze zmniejszonym wymaganiem dawki peptydu sugerując, że CTL tworzone w obecności IL-21 wykazywało oddziaływanie o wyższej awidności ze swoim pokrewnym celem. To, że zwiększona awidność guza może być przypisana większemu powinowactwu TCR a nie innym pobocznym czynnikom można było wykazać stosując próby wybarwiania TCR oparte na tetramerze. Pomimo, że natężenie wybarwiania tetrameru może zasadniczo być skorelowane z powinowactwem TCR (Yee et al., J. Immunol. 162:2227, 1999; Crawford et al., Immunity 8:675, 1998), dokładniejsze określenie powinowactwa TCR można było uzyskać w oparciu o stopień dysocjacji tetrameru, Kd, z jego specyficznego ligandu TCR (Dutoit et al., J. Immunol. 168:675, 1990). W tej próbie, Kd oddziaływania TCR-peptyd-MHC lub powinowactwo TCR jest odwrotnie skorelowane z ułamkiem związanego tetrameru pozostającego w czasie w obecności nadmiaru nieznaczonego tetrameru. Klony CTL wyzwalane z hodowli poddanych lub nie poddanych działaniu IL-21 wybarwiono stosując peptyd M27-tetramer-PE i inkubowano nadmiarem nieznaczonego M27-tetrameru. Ułamek CTL związanego z tetramerem określono przez cytometrię przepływową w wyszczególnionych punktach czasowych (2 do 60 minut). Stwierdzono, że szybkości w kierunku dysocjacji TCR/ tetramer-peptyd są znacząco szybsze dla klonów wyodrębnionych z hodowli nie poddanych działaniu w porównaniu do klonów tworzonych w hodowlach poddanych działaniu IL-21 (Fig 7). Zebrane razem, wyniki te dowodzą, że działanie IL-21 prowadzi do tworzenia klonów komórek T wyrażających TCR o wysokim powinowactwie. Aby pokazać, czy pośredniczone przez IL-21 wzbogacanie komórek T o wysokim powinowactwie było spowodowane oligoklonalną ekspansją ograniczonej liczby specyficznych dla antygenu komórek T lub reprezentowało rozleglejszy wpływ na repertuar komórek T, zbadano ekspresję Vbeta TCR wśród kohorty klonów komórek T o wysokim i niskim powinowactwie stosując panel przeciwciał anti-Vbeta. Na przykład, w przypadku pacjenta CG, wśród dziewięciu klonów komórek T o wysokim powinowactwie, siedem poddało ekspresji unikatowe łańcuchy Vbeta (jedynie dwa udostępniały ekspresję Vbeta) i podobnie różny repertuar TCR zaobserwowano wśród grupy klonów komórek T o niskim powinowactwie u tego pacjenta (spośród dziesięciu różnych klonów o niskim powinowactwie, tylko dwa udostępniały to samo Vbeta) sugerując, że wpływ IL-21 nie wynikał jedynie z ekspansji oligoklonalnej populacji klonów komórek T o wysokim powinowactwie in vitro (Figura 3). Przykład 5 26 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Hodowla specyficznych dla antygenu komórek T CD8 z IL-21 podtrzymuje ekspresję CD28, wytwarzanie IL-2 i IFNy CD28 jest ważną współstymulującą cząsteczką dla tworzenia odpowiedzi komórek T zarówno CD4 i CD8. Sygnalizowanie przez receptor CD28 prowadzi do zwiększonej stabilności mRNA IL-2 i zwiększonego wytwarzania IL-2 w komórkach T zarówno CD4 i CD8 (Boise et al, Immunity 3:87-98, 1995; Ragheb et al, J. Immunol. 163:120-129, 1999). Ekspresja CD28 jest utracona w podzbiorze ludzkich komórek T CD8+ po aktywacji i ten podzbiór wykazuje zmniejszoną proliferację po stymulacji anti-CD3 (Azuma et al, J. Immunol. 150:1147-1159,1993). Komórki T CD8+ CD28 są zwiększone u starszych i w puli komórek T CD8 pamięci immunologicznej u ludzi z utrzymującymi się infekcjami wirusowymi, EBV i CMV (Posnett et al, Int. Immunol. 11:229-241, 1999). Utrata ekspresji CD28 jest najbardziej wydatna u pacjentów HIV (Appay et al, Nat. Med. 8:379-385, 2002) i o zwiększeniu tej populacji donoszono u pacjentów z czerniakiem. Ostatnio wykazano, że przywrócenie ekspresji CD28 w komórkach T CD8 specyficznych względem CMV podtrzymuje wytwarzanie IL-2 i zwiększone przeżycie komórek T CD8 specyficznych dla antygenu in vitro (Topp et al, J. Exp. Med. 198:947-955, 2005). Ten szlak jest zatem rozpoznawany jako ważny szlak przedłużonego przeżycia i funkcji CD8. CTLs rozpoznające autoantygen MART-1 są obecne w małych ilościach we krwi obwodowej zdrowych int dawców i zazwyczaj cechują się naiwnym fenotypem (CD45RA+, CCR7+ i CD28 ). Zbadano różnicowanie tej rzadkiej populacji w obecności IL-21. Stymulowane antygenem, nie poddane działaniu komórki wykazywały fenotyp CD45RO+, któremu towarzyszyła utrata ekspresji CCR7 i CD28 po tygodniu w hodowli. Natomiast, hodowle poddane działaniu IL-21 wykazywały utrzymujące się poziomy ekspresji CD28, nawet 4 tygodnie po pierwotnej stymulacji antygenem (Figura 10). Tę regulację ?up? CD28 zaobserwowano zarówno u naiwnych zdrowych dawców jak i u pacjentów z czerniakiem dla CTLs zarówno MART-1- jak i gp-00-specyficznych. Aby ocenić, czy regulowana ?up? ekspresja CD28 prowadziła do funkcjonalnie kompetentnego sygnału, w tych hodowlach poddano analizie kierowane przez antygen wytwarzanie IL-2 i IFNy. Jak przedstawiono na Figurze 11, wytwarzanie IL-2 było znacząco podwyższone w komórkach CD28 hi lo traktowanych IL-21 w porównaniu do komórek poddających ekspresji CD28 nie poddanych działaniu. Ponadto, wytwarzanie IL-2 było inhibitowane przez dodanie CTLA-4lg, sugerując, że ekspresja CD28 była zasadnicza dla wytwarzania IL-2 w tych komórkach. Dane te sugerują, że in vitro, IL-21 jest zdolne do indukowania populacji komórek T CD8 pamięci immunologicznej poddających ekspresji CD28 zdolnej do wytwarzania IL-2. Może to się przenosić na zwiększone przeżycie i aktywację tych komórek T CD8 in vitro i in vivo i sugeruje ważną rolę leczenia IL-21 jako monoterapii oraz w adoptywnej terapii komórkowej raka i infekcji wirusowych. Przykład 6 27 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 IL-21 wpływa na odpowiedź komórek T CD8 względem antygenów gp100 i NY-ESO-1 Aby wykazać, że komórki T rozpoznają inne autoantygeny, oceniono wpływ IL-21 na komórki T CD8+ w podobny sposób stosując dwa inne związane z guzem autoantygeny, antygen czerniaka, gp100 (peptyd GI54) i antygen raka jądra, NY-ESO-1 (NY157). Patrz, Li et al., J. Immunol. 175:2261-2269. 2005. Komórki T CD8+ stymulowano in vitro autologicznymi komórkami dendrytycznymi (DC) pulsowanymi peptydem NY-ESO-1 (NY157) lub gp100 (G154). Do hodowli traktowanych IL-21 dodano IL-21 (30 ng/ml). Sześć dni po pierwotnej stymulacji in vitro, hodowle poddano analizie na specyficzność względem antygenu i powierzchniowy fenotyp przez wybarwianie tetramerem i analizę multiparametryczną stosując cytometrię przepływową. Na Figurze 13 panel A., częstości CTL specyficznego względem NY157 i G154 są przedstawione jako % wszystkich komórek T CD8+ obok ramek. Na przykład, krotność wzrostu CTL specyficznego względem NY-ESO-1 była 9,8 razy większa wśród komórek poddanym działaniu IL-21 względem kontroli (5,3 % : 0,54 %). Krotność wzrostu w liczbach bezwzględnych CTL specyficznego względem NY-ESO-1 obliczono w oparciu o liczby komórek w odpowiednich hodowlach i dla NY-ESO-1 stwierdzono, że jest niemal 20-krotnie większa wśród komórek poddanych działaniu IL- 21. Na Figurze 13 panel B., bramkowane tetramero-dodatnie komórki z hodowli kontrolnych lub hodowli poddanych działaniu IL-21 poddano analizie na ekspresję CD28. (Wszystkie komórki były CD45RO+, CCR7-ujemne). Stwierdzono, że analiza histogramu dla ekspresji CD28 wśród CTL NY-ESO-1 lub gp100-specyficznego jest znacząco regulowana ?up? wśród hodowli poddanych działaniu IL-21 w porównaniu do hodowli kontrolnych. Wyniki te były przykładowe dla 6 oddzielnych doświadczeń od 3 osobników HLA-A2+. Przykład 7 Wzmocnienie odporności na guz u pacjentów z czerniakiem otrzymujących leczenie IL-21 po terapii mieloablacyjnej i adoptywnym transferze komórek Adoptywna terapia komórkowa (ACT) jest oparta na selekcji ex vivo limfocytów reaktywnych względem guza, i ich aktywacji względem autologicznego gospodarza- nosiciela guza. Specyficzne dla guza komórki T (TILs) są aktywowane i ekspandowane in vitro w obecności własnych antygenów guzów pacjenta w obecności cytokin, a następnie przenoszone do tego samego pacjenta, po czym następuje leczenie podtrzymujące cytokinami. U znaczącej liczby pacjentów, prowadzi to do zwiększonej liczby specyficznych dla antygenu komórek T w części obwodowej powodując efekty przeciw guzowi jak to jest widoczne z obiektywnych odpowiedzi przeciw guzowi. IL-21 jest stosowane 28 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 zarówno jako aktywator/ ekspander in vitro specyficznych dla antygenu komórek T jak i do terapii podtrzymującej komórek T, gdy są one przeniesione do pacjenta z rakiem. Wszystkie badania związane z udziałem osobników ludzkich otrzymują uprzednie zatwierdzenie przez Institutional Review Board (Instytucjonalną Komisję Kontrolną) w szpitalu prowadzącym próby kliniczne. Po uzyskaniu świadomej zgody na udział w badaniu, otrzymuje się jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMCs) i specyficzne względem antygenu cytotoksyczne limfocyty T (CTLs) są tworzone przez użycie autologicznych komórek dendrytycznych pulsowanych ograniczonym do A2 epitopem peptydu MART-1 (M27) lub gp100 (G154) lub przez użycie lizatu komórek guza pochodzącego z biopsji z guzów pacjentów. Komórki T są ekspandowane w zatwierdzonym zgodnie z GMP reaktorze z odpowiednimi cytokinami (25-50 ng/ml IL-2 lub 10-50 ng/ml IrlL-21). W pewnych przypadkach, po trzech cyklach stymulacji w odstępach tygodniowych, komórki T są klonowane i ekspandowane dla badania in vitro. Wybiera się klony CTL wykazujące w próbie uwalniania chromu specyficzną lizę antygeno-dodatnich celów guza. Klony są ekspandowane w cyklach 14-dniowych stosując przeciwciało anti-CD3 (OKT3, Orthoclone; Ortho Biotech, Raritan, NJ) przy 30 ng/ml, napromieniowane alogeniczne PBMCs, przy 10 6 komórek/ml, napromieniowane alogeniczne 5 limfoblastoidowe linie komórkowe (2 x l0 komórek/ml), i seryjne IL-2 (aldesleukina; Chiron) przy 25-50 jednostek/ml co 2-3 dni. Wszystkie klony są scharakteryzowane jako CD3+, CD4-, CD8+ i po stymulacji antygenem wyrażają receptor IL-2 o wysokim powinowactwie (CD25). Pacjenci ze stopniem Ill-IV przerzutowego czerniaka otrzymują chemoterapię niemieloablacyjną 2 składającą się z 2 dni cyklofosfamidu (60 mg/kg), a następnie przez 5 dni fludarabiny (25 mg/m ). Dzień po końcowej dawce fludarabiny, pacjenci otrzymują wlew komórkowy limfocytów reaktywnych 6 względem guza (10 -10 10 komórek/wlew) i terapię cytokiną (wysoka dawka IL-2 720,000 IU/kg iv co 8 godzin lub 10-30 ?g/kg rlL-21 w różnych trybach leczenia). Pewni pacjenci otrzymują szczepienie 1 mg peptydu MART-1:26-35 (27L) lub gp100:209-217 (210M) w niekompletnym adiuwancie Freunda (IFA) wstrzyknięte podskórnie. Parametry hematologiczne pacjentów są monitorowane codziennie. Dodatni wynik terapeutyczny można zmierzyć stosując protokoły stanu obiektywnego, by ocenić odpowiedź guza litego. Odpowiedź pacjenta jest oceniana stosując standardowe badania radiograficzne i badanie fizyczne. Patrz, Clinical Research Associates Manual, Southwest Oncology Group, CRAB, Seattle, WA, 6 paźdz. 1998, aktualizacja sierpień 1999. Obecność obiektywnych odpowiedzi CR i/lub PR w tej próbie sugeruje dobitną rolę IL-21 w odpowiedziach przeciw guzowi w kontekście adoptywnej terapii komórkowej bądź przez hodowanie komórek in vitro z IL-21 lub przez podtrzymywanie pacjentów IL-21 po ACT. Przykład 8 Hodowla in vitro z IL-21 wzmacnia efekty przeciw guzowi w modelu myszy ACT 29 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Transgeniczne myszy Pmel-1 są myszami poddanymi metodom inżynierii genetycznej, by poddać ekspresji receptor komórek T (TCR) specyficzny dla antygenu gp10025-33 peptydu specyficznego dla ludzkiego czerniaka (Overwijk et al., J. Exp. Med. 198:569-580. 2003). Splenocyty z myszy transgenicznych pmel-1 są wyodrębniane i hodowane w obecności 1?M ludzkiego peptydu i pożywki hodowli zawierającej 30 IU/ml rekombinacyjnego ludzkiego IL-2 lub 10-100 ng/ml mysiego IL-21 przez 6-7 dni. Myszom-samicom C57B116 (w wieku 6-12 tygodni, Charles River Laboratories) wstrzykuje się S.C. 25 5 x 10 komórek czerniaka B16-F10 i 10-14 dni później działa się i.v. transferem adoptywnym hodowanych in vitro splenocytów pmel-1 (jak wyszczególniono powyżej). Limfopenia jest indukowana przez subletalne napromieniowanie całego ciała (5Gy) myszy nosicieli guza w dniu transferu. Myszy 5 są następnie bądź szczepione 2x10 pfu rekombinacyjnego wirusa ospy drobiu poddającego ekspresji ludzkie gp100, a następnie poddawane traktowaniu cytokinami (rhlL-2, 100 ?g/dawkę dla 6-15 dawek) lub poddawane traktowaniu samymi cytokinami (bez szczepienia). Guzy są mierzone przy użyciu 2 suwmiarki i objętość jest mierzona stosując wzór na objętość guza = ? (B x L), gdzie B jest najkrótszą średnicą guza i L jest najdłuższą średnicą guza. Zmniejszenie wzrostu guza gdy przenosi się komórki pmel z hodowanym IL-21 daje dowód dobitnej roli IL-21 w aktywacji i ekspansji in vitro specyficznych dla antygenu komórek T dla ACT. Przykład 9 Działanie IL-21 in vivo wzmacnia efekty przeciw guzowi w modelu mysim ACT Myszy transgeniczne Pmel-1 są myszami poddanymi metodom inżynierii genetycznej, by poddać ekspresji receptor komórek T (TCR) specyficzny dla antygenu gp10025-33 peptydu specyficznego dla ludzkiego czerniaka (Klebanoff et al., PNAS 101: 1969-1974, 2004). Splenocyty z myszy transgenicznych pmel-1 są wyodrębniane i hodowane w obecności 1 ?M ludzkiego peptydu gp10025-33 i pożywki hodowli zawierającej 30 IU/ml rekombinacyjnego ludzkiego IL-2 lub 10-100 ng/ml mysiego IL-21 przez 6-7 dni. Myszom-samicom C57B116 (w wieku 6-12 tygodni, Charles River Laboratories) wstrzykuje się S.C. 25 x 10 5 komórek czerniaka B16-F10 i 10-14 dni później działa i.v. transferem adoptywnym hodowanych in vitro splenocytów pmel-1 (jak wyszczególniono powyżej). Limfopenia jest indukowana przez subletalne napromieniowanie całego ciała (5Gy) myszy nosicieli guza w dniu transferu. Myszy 5 są następnie bądź szczepione 2x 10 pfu rekombinacyjnego wirusa ospy drobiu poddającego ekspresji ludzkie gp100, a następnie poddawane traktowaniu cytokinami (rhlL-2, 100 ?g/dawkę lub mlL-21, 20100 ?g/dawkę dla 6-15 dawek lub poddawane traktowaniu samymi cytokinami (bez szczepienia). Guzy są mierzone przy użyciu suwmiarki i objętość jest mierzona stosując wzór na objętość guza = ? 2 (B x L), gdzie B jest najkrótszą średnicą guza i L jest najdłuższą średnicą guza. 30 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Zmniejszenie wzrostu guza po działaniu IL-21 in vivo wykazuje rolę IL-21 w utrzymaniu i aktywacji specyficznych dla guza komórek T po ACT. LISTA SEKWENCJI <110> ZymoGenetics, Inc. Yee, Cassian <120> METODY STOSOWANIA IL-21 DO ADOPTYWNEJ IMMUNOTERAPII I IDENTYFIKACJI ANTYGENÓW GUZA <130> 04-15PC <150> US 60/630,727 <151> 2004-11-24 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> <211> <212> <213> 1 642 DNA Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (47)...(532) 31 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 32 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 33 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób identyfikacji antygenu guza obejmujący: współhodowanie materiału guza wyodrębnionego z osobnika z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMCs) w obecności kompozycji IL-21 i komórek prezentujących antygen (APCs); wyodrębnienie populacji komórek T CD8+ z hodowli, w której liczba wytworzonych komórek T specyficznych względem antygenu guza jest ponad 20 do 30 razy większa niż liczba komórek T specyficznych względem antygenu guza wytworzonych w nieobecności IL-21; klonowanie poszczególnych komórek T CD8+ z populacji komórek T CD8+; i identyfikowanie antygenu przez charakteryzowanie klonów komórek T na specyficzność względem antygenu. 2. Sposób według zastrz. 1, w którym populacją komórek T CD8+ jest CD28+ i jest ona zdolna do wytwarzania IL-2. 3. Sposób według zastrz. 1, w którym populacja komórek T CD8+ jest populacją komórek T CD8+, która jest nie-końcowo zróżnicowana. 4. Sposób według zastrz. 1, w którym populacja PBMC lub komórek T CD8+ jest autologiczną populacją komórek. 5. Sposób według zastrz. 1, w którym materiał guza obejmuje całkowity RNA, poddane lizie komórki guza lub ciała apoptotyczne. 6. Sposób według zastrz. 1, w którym współhodowanie jest w obecności kompozycji IL-21 i jednej lub więcej dodatkowych cytokin. 7. Sposób wytwarzania populacji ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza do stosowania w immunoterapii adoptywnej obejmujący: wyodrębnienie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) z próbki biologicznej, w którym wspomniane PBMCs obejmują ludzką populację naiwnych komórek T CD8+; identyfikowanie PBMCs mających fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem mającym guz; wyodrębnienie ze wspomnianych zgodnych tkankowo PBMCs naiwnej populacji ludzkich komórek T CD8+; 34 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 współhodowanie materiału guza wyodrębnionego z osobnika z populacją naiwnych ludzkich komórek T CD8+ w obecności kompozycji IL-21 i komórek prezentujących antygen (APCs), w którym wspomniany materiał guza obejmuje antygen guza; i ekspandowanie komórek w hodowli, w której liczba wytworzonych ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza jest ponad 20 do 30 razy większa niż liczba ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza wytworzonych w nieobecności IL21. 8. Sposób według zastrz. 7, w którym populacją ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza jest CD28+ i jest ona zdolna do wytwarzania IL-2. 9. Sposób według zastrz. 7, w którym PBMCs są autologiczne. 10. Sposób wytwarzania populacji ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza do stosowania w immunoterapii adoptywnej obejmujący: identyfikowanie, z wyodrębnionej ludzkiej próbki biologicznej zawierającej komórki T, populacji ludzkich komórek T mających fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem mającym guz; wyodrębnienie ze wspomnianej zgodnej tkankowo populacji ludzkich komórek T, populacji naiwnych ludzkich komórek T CD8+; współhodowanie materiału guza z osobnika z populacją naiwnych ludzkich komórek T CD8+ w obecności kompozycji IL-21 i APCs, w którym wspomniany materiał guza obejmuje antygen guza; i ekspandowanie tych komórek w hodowli, w której liczba wytworzonych ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza jest ponad 20 do 30 razy większa niż liczba ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza wytworzonych w nieobecności IL-21. 11. Sposób według zastrz. 10, w którym populacją ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza jest CD28+ i jest ona zdolna do wytwarzania IL-2. 12. Sposób według zastrz. 10, w którym populacja komórek T CD8+ jest autologiczna. 13. Sposób według zastrz. 7 lub 10, w którym materiał guza obejmuje całkowity RNA, poddane lizie komórki guza lub ciała apoptotyczne. 14. Sposób ex vivo ekspansji ludzkich cytotoksycznych komórek T CD8+ specyficznych dla antygenu guza obejmujący: identyfikowanie, z wyodrębnionej ludzkiej próbki biologicznej zawierającej komórki T, populacji ludzkich komórek T mających fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem; 35 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 wyodrębnienie ze wspomnianej zgodnej tkankowo populacji ludzkich komórek T populacji naiwnych ludzkich komórek T CD8+; współhodowanie materiału guza z osobnika z populacją naiwnych ludzkich komórek T CD8+ w obecności kompozycji IL-21, w którym wspomniany materiał guza obejmuje antygen guza; i ekspandowanie komórek w hodowli, w której liczba wytworzonych ludzkich cytotoksycznych komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza jest ponad 20 do 30 razy większa niż liczba ludzkich cytotoksycznych komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza wytworzonych w nieobecności IL-21. 15. Sposób według zastrz. 14, w którym populacją ludzkich cytotoksycznych komórek T CD8+ jest CD28+ i jest ona zdolna do wytwarzania IL-2. 16. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 7, 10 lub 14, w którym po etapie współhodowania materiału guza z populacją naiwnych ludzkich komórek T CD8+, są wzbogacane ludzkie cytotoksyczne komórki T CD8+. 17. Zastosowanie ekspandowanych ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza do wytwarzania leku dla immunoterapii adoptywnej u osobnika mającego guz, w którym ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza mają fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem, i w którym ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza współhodowano z materiałem guza z osobnika w obecności IL-21 i APCs, w którym ludzkimi komórkami T CD8+ specyficznymi względem antygenu guza są CD28+ i są one zdolne do wytwarzania IL-2, i w którym wspomniane CD28+, wytwarzającą IL-2 populację ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza hoduje się w nieobecności dodatkowych cytokin w ten sposób ekspandując wspomniane ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza. 18. Ekspandowane CD28+, wytwarzające IL-2 specyficzne względem antygenu guza ludzkie komórki T CD8+, wytworzone przez współhodowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) mające fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem, z materiałem guza wyodrębnionym z osobnika, w obecności IL-21 i APCs, by wytworzyć populację ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza, która jest CD28+ i jest zdolna do wytwarzania IL-2 , i jest ekspandowana przez hodowlę w nieobecności dodatkowych cytokin, do stosowania w immunoterapii adoptywnej u osobnika mającego guz. 19. Ekspandowane ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza do stosowania w immunoterapii adoptywnej u osobnika mającego guz, w którym ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza mają fenotyp, który jest zgodny tkankowo z osobnikiem, i w którym ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza współhodowano z materiałem guza z osobnika w obecności IL-21 i APCs, w którym ludzkie komórki T CD8+ 36 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 specyficzne względem antygenu guza są CD28+ i są zdolne do wytwarzania IL-2, i w którym wspomniane CD28+, wytwarzającą IL-2 populację ludzkich komórek T CD8+ specyficznych względem antygenu guza hoduje się w nieobecności dodatkowych cytokin w ten sposób ekspandując wspomniane ludzkie komórki T CD8+ specyficzne względem antygenu guza. 37 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 38 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 39 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 40 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 41 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 42 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 43 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 44 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 45 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 46 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 47 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 48 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 49 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 50 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 DOKUMENTY WYMIENIONE W OPISIE Lista wymienionych przez zgłaszającego dokumentów została dołączona wyłącznie dla informacji czytającego i nie jest częścią europejskiego dokumentu patentowego. Została zestawiona z największą starannością, Europejski Urząd Patentowy nie bierze jednak żadnej odpowiedzialności za ewentualne błędy lub braki. Dokumenty patentowe wymienione w opisie ? WO 03103589 A [0004] ? US 20030147869 A [0005] ? US 6307024 B [0044] ? US 6686178 B [0044] ? US 6057128 A [0044] ? US 6576744 B [0044] ? US 6803451 B [0044] ? US 6692924 B [0044] ? WO 0017235 A [0044] ? US 60630727 B [0104] Literatura niepatentowa cytowana w opisie ? KELSO, A. Immun. Cell Biol., 1998, vol. 76, 300-317 [0001] ? PARRISH-NOVAK et al. Nature, 2000, vol. 408, 57-63 [0002] ? PARRISH-NOVAK et al. J. Leuk. Bio., 2002, vol. 72, 856-863 [0002] ? COLLINS et al. Immunol. Res., 2003, vol. 28, 131-140 [0002] ? BRADY et al. J. Immunol., 2004, vol. 172, 2048-58 [0002] ? KASAIAN et al. Immunity, 2002, vol. 16, 559-569 [0003] ? STRENGELL et al. J. Immunol., 2003, vol. 170, 5464 [0003] ? WURSTER et al. J. Exp. Med, 2002, vol. 196, 969 [0003] ? STRENGELL et al. J. Leukoc. Biol., 2004, vol. 76, 416 [0003] ? VARI ; HART. Cytotherapy, February 2004, vol. 6 (2), 111-121 [0006] ? KASAIAN MT et al. Immunity, April 2002, vol. 16 (4), 559-569 [0007] ? SIVAKUMAR PV et al. Immunology, June 2004, vol. 112 (2), 177-182 [0007] ? MA H-L et al. J. Immunology, 15 July 2003, vol. 171 (2), 608-615 [0008] ? MOROZ A et al. J. Immunology, 15 July 2004, vol. 173 (2), 900-909 [0008] ? LI Y. et al. J. Immunology, 2004, vol. 27 (6), S2-S3 [0009] ? BRENTJENS RJ et al. Nature Medicine, March 2003, vol. 9 (3), 279-286 [0009] ? FOSTER et al. Current Pharmaceutical Design, Bol., October 2004, vol. 10 (11), 1207-1220 [0010] ? DYNAN ; TIJAN. Nature, 1985, vol. 316, 774-78 [0030] ? WIDMER et al. Nature, 1981, vol. 294, 750 [0040] ? TOPP et al. J. Exp Med, 2003, vol. 198 (6), 947 [0040] ? CHENG et al. J Immunol, 2002, vol. 169, 4990 [0040] 51 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 ? COSMAN. The Hematopoietin Receptor Superfamily. Cytokine, 1993, vol. 5 (2), 95-106 [0045] ? NICOLA et al. Advances in Protein Chemistry, 1999, vol. 52, 1-65 [0045] ? KELSO, A. Immunol. Cell Biol., 1998, vol. 76, 300-317 [0045] ? GOMI et al. J. Immunol., 1999, vol. 163, 4994-5004 [0050] ? PEOPLES et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, 432-436 [0050] ? MANDRUZZATO et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 186, 785-793 [0050] ? VELLA et al. PNAS, 1998, vol. 95, 3810-3815 [0050] ? VAN DER BRUGGEN. Science, 1991, vol. 254, 1643 [0050] ? ENGELHARD et al. Mol. Immunol., 2002, vol. 39, 127 [0050] ? PITTET et al. J. Exp. Med., 1999, vol. 190, 705 [0051] ? D?SOUZA et al. lnt. J. Cancer, 2004, vol. 78, 699 [0051] ? ZIPPELIUS et al. Cancer Res., 2004, vol. 64, 2865 [0051] ? LEE et al. Nature Medicine, 1999, vol. 5, 677 [0051] ? TOMIYAMA et al. J. Exp. Med., 2003, vol. 198, 947 [0052] ? HO et al. Cancer Cell, 2003, vol. 3, 431 [0052] ? TOPP et al. J. Exp. Med., 2003, vol. 198, 947 [0052] ? TSAI et al. Critical Rev. Immunol., 1998, vol. 18, 65 [0053] ? BRANDT et al. Blood, 2003, vol. 102, 4090 [0053] ? MA et al. J. Immunol., 2002, vol. 171, 608 [0054] ? KISHIDA et al. Mol. Ther., 2003, vol. 8, 552 [0054] ? MOROZ et al. J. Immunol, 2003, vol. 173, 900 [0054] ? BRENNE et al. Blood, 2002, vol. 99, 3756 [0054] ? POWELL et al. Blood, 2005, vol. 105, 241-250 [0055] ? CHANG et al. J. Clinical Oncology, 2003, vol. 21, 884-890 [0055] ? DUDLEY et al. J. Immunother., 2001, vol. 24, 363-73 [0056] ? MARKS-KONCZALIK et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, vol. 97, 11445-50 [0056] ? WALDMANN TA. Nat Med., 2003, vol. 9, 269-77 [0056] ? FEHNIGER et al. Cytokine Growth Factor Rev., 2002, vol. 13, 169-83 [0056] ? BEAR et al. Cancer Immunol. Immunother., 2001, vol. 50, 269-74 [0056] ? SCHULTZE et al. Br. J. Haematol., 2001, vol. 113, 455-60 [0056] ? YEE et al. Proc Natl Acad Sci., 2002, vol. 99 (25), 16168 [0057] ? OELKE et al. Nat Med., 2003, vol. 9 (5), 619-24 [0057] ? MAUS et al. Clin Immunol., 2003, vol. 106 (1), 16-22 [0057] ? CAI et al. Immunol Rev., 1998, vol. 165, 249-65 [0057] ? DUDLEY et al. Science, 2002, vol. 290, 850 [0058] ? HUGHES et al. Hum Gene Ther, 2005, vol. 16 (4), 457 [0059] ? ROSZKOWSKI et al. Cancer Res, 2005, vol. 65 (4), 1570 [0059] ? COOPER et al. Blood, 2003, vol. 101, 1637 [0059] ? ALAJEZ et al. Blood, 2005, vol. 105, 4583 [0059] ? BOON, T. Adv. Cancer Res., 1992, vol. 58, 177-211 [0060] 52 PZ/4150/RW EP 1 814 580 B1 ? Principles and practice of the Biologic Therapy of Cancer. Lippincott Williams & Wilkins, 2000 [0061] ? ANTONIA et al. J. Urol., 2002, vol. 167, 1995-2000 [0061] ? SCHRAYER et al. Clin. Exp. Metastasis, 2002, vol. 19, 43-53 [0061] ? NIETHAMMER et al. Cancer Res., 2001, vol. 61, 6178-84 [0061] ? SHIMIZU et al. Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1999, vol. 96, 2268-73 [0061] ? SRIVASTAVA P. Nat Immunol., 2000, vol. 1, 363-366 [0062] ? Clinical Research Associates Manual, Southwest Oncology Group. CRAB, 06 October 1998 [0063] [0096] ? ARRIGHI et al. Cancer Res., 2000, vol. 60 (16), 4446-52 [0066] ? MARCINOLA et al. J Immunother Emphasis Tumor Immunol., 1996, vol. 19 (3), 92-205 [0066] ? YEE et al. PNAS, 2002, vol. 99, 16168 [0067] ? YEE et al. J. Immunol., 1999, vol. 162, 2227 [0067] [0084] ? TSAI et al. J. Immunol., 1997, vol. 158, 1796 [0067] ? BENDER et al. J. Immunol. Methods, 1996, vol. 196, 121 [0069] ? ALTMAN et al. Science, 1996, vol. 274, 94 [0070] ? RIDDELL et al. J. Immunolog. Methods, 1990, vol. 128, 189 [0072] ? DUTOIT et al. J. Immunol., 2002, vol. 168, 1167 [0074] ? GERVOIS et al. Clin Cancer Res, 2000, vol. 6, 1459-1467 [0077] ? LIAO et al. Mol Ther, 2004, vol. 9, 757-764 [0077] ? CRAWFORD et al. Immunity, 1998, vol. 8, 675 [0084] ? DUTOIT et al. J. Immunol., 1990, vol. 168, 675 [0084] ? BOISE et al. Immunity, 1995, vol. 3, 87-98 [0086] ? RAGHEB et al. J. Immunol., 1999, vol. 163, 120-129 [0086] ? AZUMA et al. J. Immunol., 1993, vol. 150, 1147-1159 [0086] ? POSNETT et al. Int. Immunol., 1999, vol. 11, 229-241 [0086] ? APPAY et al. Nat. Med., 2002, vol. 8, 379-385 [0086] ? TOPP et al. J. Exp. Med., 2005, vol. 198, 947-955 [0086] ? LI et al. J. Immunol., 2005, vol. 175, 2261-2269 [0090] ? OVERWIJK et al. J. Exp. Med., 2003, vol. 198, 569-580 [0098] ? KLEBANOFF et al. PNAS, 2004, vol. 101, 1969-1974 [0101]




















































Grupy dyskusyjne