Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 1864666 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 1864666 T3


EP 1864666 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1864666 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 31.03.2006 06730774.4 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 15.08.2012 Europejski Biuletyn Patentowy 2012/33 EP 1864666 B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 31/5575 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01) A61P 27/02 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) Tytuł wynalazku: Czynnik ochronny dla komórki neuronalnej siatkówki zawierający jako składnik aktywny pochodną prostaglandyny F2 alfa (30) Pierwszeństwo: 31.03.2005 JP 2005100348 Zgłoszenie ogłoszono: 12.12.2007 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/50 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 28.02.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/02 (43) (73) Uprawniony z patentu: Asahi Glass Company, Limited, Tokyo, JP SANTEN PHARMACEUTICAL CO., LTD., Osaka, JP (72) Twórca(y) wynalazku: NARUHIRO ISHIDA, Ikoma, JP ATSUSHI SHIMAZAKI, Ikoma, JP PL/EP 1864666 T3 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). EP 1 864 666 B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek odnosi się do środka ochronnego dla neuronalnej komórki siatkówki zawierającego pochodną prostaglandyny F2? jako substancję czynną do stosowania w profilaktyce lub 5 leczeniu chorób oczu związanych z uszkodzeniem komórek neuronalnych siatkówki. [0002] Siatkówka jest tkanką o grubości od 0,1 do 0,5 mm, składającą się z dziesięciu warstw: wewnętrznej błony granicznej, warstwy włókien nerwowych, warstwy komórek zwojowych, wewnętrznej warstwy splotowatej, wewnętrznej warstwy jądrzastej, zewnętrznej warstwy splotowatej, zewnętrznej warstwy jądrzastej, zewnętrznej błony granicznej, warstwy komórek fotoreceptorowych i warstwy nabłonka 10 barwnikowego siatkówki oraz grup komórek neuronalnych siatkówki obejmujących komórki fotoreceptorowe, komórki dwubiegunowe, komórki zwojowe, komórki horyzontalne, komórki amakrynowe i komórek Mullera. [0003] Komórki neuronalne siatkówki odgrywają ważną rolę w przyjmowaniu i przekazywaniu informacji wizualnych, taką jak stymulacja konwersji światła na sygnał elektryczny i przekazywanie sygnału do mózgu. [0004] Konkretny mechanizm tego przekazywania jest następujący, informacja wizualna z oczu jest 15 przetwarzana w sygnał elektryczny przez komórki fotoreceptorowe i przekazywana do komórek zwojowych za pomocą komórek horyzontalnych, komórek bipolarnych i/lub komórek amakrynowych. Następnie sygnał elektryczny jest przekazywany do mózgu za pomocą nerwu wzrokowego, który jest wiązką włókien nerwu wzrokowego, w tym aksonów komórek zwojowych. [0005] Z drugiej strony, gdy te komórki neuronalne siatkówki zostają uszkodzone z różnych przyczyn, 20 homeostaza (funkcja dostarczania tlenu lub składników odżywczych do komórek neuronalnych siatkówki przez siatkówkowe krążenie krwi, i tym podobne) komórek neuronalnych siatkówki nie może być utrzymana, a przekaz informacji wizualnej do mózgu jest hamowany. Na przykład, powszechnie wiadomo, że dysfunkcja komórek neuronalnych siatkówki jest wywoływana w różnych chorobach siatkówki, takich jak niedrożność naczyń siatkówki, retinopatia cukrzycowa, niedokrwienna neuropatia nerwu wzrokowego, jaskra, 25 zwyrodnienie plamki żółtej, retinopatia barwnikowa i choroba Lebera (Brain Res. Bull., 62 (6), 447-453 (2004)). [0006] Niedawno zauważono, że śmierć komórek neuronalnych siatkówki w wyniku niedokrwienia siatkówki jest jedną z przyczyn uszkodzenia komórek neuronalnych siatkówki opisano następujące zdarzenia dotyczace śmierci komórek neuronalnych siatkówki (JP-A-2003-146904 i Nature Rev., 2, 448-459 (2003)). 30 1) Mechanizm śmierci komórek neuronalnych siatkówki w wyniku niedokrwienia siatkówki jest podobny do śmierci komórek neuronalnych mózgu w wyniku niedokrwienia mózgu. 2) W krótkim okresie niedokrwienia siatkówki, wewnętrzna warstwa siatkówki (wewnętrzna warstwa splotowata) jest selektywnie uszkadzana. 3) Podczas niedokrwienie siatkówki można zaobserwować nadmierne uwalnianie glutaminianu. 35 4) Przez wstrzykiwanie pobudzających aminokwasów, takich jak glutaminian, do ciałka szklistego siatkówki wywoływana jest śmierć komórek neuronalnych. 5) Nadmierna stymulacja za pośrednictwem siatkówkowych receptorów N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) promuje napływ wapnia (Ca) do komórek, czego wynikiem jest indukowanie uszkodzenia komórki drogą indukcji podtlenku azotu (NO). 40 [0007] Na podstawie powyższych zdarzeń uważa się, że lek, taki jak glutaminianowy inhibitor neurotoksyczności, antagonista receptora NMDA lub inhibitor syntezy NO, jest użyteczny do leczenia chorób oczu spowodowanych uszkodzeniem komórek neuronalnych siatkówki i przeprowadzono liczne badania. 1 EP 1 864 666 B1 [0008] Na przykład, JP-A-2001-072591 ujawnia środek ochronny dla neuronalej komórki siatkówki zawierający nipradilol, który jest jednym z ?-blokerów, jako składnik aktywny. WO 01/056606 ujawnia środek ochronny dla wzrokowej komórki zwojowej zawierający jako składnik aktywny białko antagonisty receptora interleukiny-1. WO 03/004058 ujawnia środek ochronny dla wzrokowej komórki zwojowej zawierający 5 antagonistę receptora ?1, takiego jak chlorowodorek brimonidyny jako składnik aktywny. Experimental Eye Res., 72, 479-486 (2001) ujawnia działanie ochronne na nerw latanoprostu, który jest jedną z pochodnych prostaglandyny, itd. [0009] Z drugiej strony, pochodne prostaglandyny F2? są ujawnione w JP-A-59-1418, JP-T-3-501025, JP-T8-501310, JP-A-10-182465,WO 98/12175, publikacji Europejskiego Zgłoszenia Patentowego nr 850926, JP10 A-2004-002462, JP-A-10-259179, JP-A-2002-293771 i JP-A-2003-321442 jako środek leczniczy do leczenia jaskry mający działanie obniżające ciśnienie śródgałkowe. JP-59-A-1418 ujawnia naturalną pochodną prostaglandyny F2?. JP-T-3-501025 ujawnia związek pokrewny z latanoprostem. JP-T-8-501310 ujawnia związek pokrewny z bimatoprostem. JP-A-10-182465 ujawnia związek pokrewny z trawoprostem. WO 98/12175 ujawnia pochodną monofluoroprostaglandyny F2?. Publikacja europejskiego zgłoszenia 15 patentowego nr 850926 i JP-A-2004-002462 ujawniają pochodną difluoroprostaglandyny F2?. JP-A-10259179 ujawnia pochodną prostaglandyny F2? zawierającą fluor mającą wielopodstawioną grupę aryloksy. JP-A-2002-293771 ujawnia pochodną difluoroprostaglandyny F2? typu eterowego. JP-A-2003-321442 ujawnia pochodną amidową difluoroprostaglandyny F2?. [0010] Jednak żaden z tych dokumentów w ogóle nie opisuje działania zawierającej fluor pochodnej 20 prostaglandyny F2? na ochronę neuronalnej komórki siatkówki. [0011] Znalezienie nowego farmaceutycznego zastosowania pochodnej prostaglandyny F2? (zwłaszcza zawierającej fluor prostaglandyny F2?) jest bardzo ciekawym tematem. [0012] W związku z tym twórcy przeprowadzili intensywne badania w celu znalezienia nowego farmaceutycznego zastosowania pochodnej prostaglandyny F2?. W rezultacie stwierdzono, że pochodna 25 prostaglandyny F2? hamuje indukowaną glutaminianem śmierć komórki neuronalnej siatkówki w sposób zależny od stężenia w szczurzych płodowych komórkach neuronalnych siatkówki, innymi słowy, pochodna prostaglandyny F2? działa bezpośrednio na neuronalne komórki siatkówki i wykazuje działanie ochronne, osiągając w ten sposób cel niniejszego wynalazku. [0013] Niniejszy wynalazek dotyczy środka ochronnego dla neuronalnej komórki siatkówki zawierającego 30 pochodną prostaglandyny F2? jako substancję czynną do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu choroby oczu związanej z uszkodzeniem komórek neruronalnych siatkówki. [0014] Ponadto, niniejszy wynalazek może być stosowany w sposobie ochrony neuronalnej komórki siatkówki oraz sposobie zapobiegania lub leczenia choroby oczu związanej z uszkodzeniem komórek neruronalnych siatkówki. 35 [0015] W niniejszym wynalazku pochodna prostaglandyny F2? oznacza związek pokrewny z prostaglandyną F2? związek otrzymany ze szkieletu kwasu prostanowego, jak określono w zastrzeżeniu 1. [0016] Na ogół środkiem ochronnym dla neuronalnej komórki siatkówki jest na przykład taki, który zawiera jako składnik aktywny pochodną prostaglandyny F2? lub jej sól, taki jak naturalna pochodna prostaglandyny F2? ujawniona w JP-A-59-1418, związek pokrewny z latanoprostem (z zastrzeżeniem, że ze związku 40 pokrewnego z latanoprostem lub jego solą wykluczony jest latanoprost) ujawniony w JP-T-3-501025, związek pokrewny z bimatoprostem (korzystnie bimatoprost lub jego sól) ujawniony w JP-T-8-501310, związek pokrewny z trawoprostem (korzystnie trawoprost lub jego sól) ujawniony w JP-A-10-182465 lub 2 EP 1 864 666 B1 zawierająca fluor pochodna prostaglandyny F2? ujawniona w WO 98/12175, publikacji Europejskiego Zgłoszenia Patentowego nr 850926, JP-A-2004 -002462, JP-A-10-259179, JP-A-2002-293771 i JP-A-2003321442. [0017] Korzystnie, środek ochronny dla neuronalnej komórki siatkówki jest, na przykład, środkiem który 5 zawiera ?zawierającą fluor pochodną prostaglandyny F2?? jako składnik aktywny. "Zawierająca fluor pochodna prostaglandyny F2?" oznacza pochodną prostaglandyny F2? mającą jeden lub więcej atomów fluoru. [0018] W szczególności, środek ochronny dla neuronalnej komórki siatkówki jest, na przykład, środkiem, który zawiera jako składnik aktywny pochodną prostaglandyny F2? zawierającą fluor ujawnioną w WO 10 98/12175, publikacji Europejskiego Zgłoszenia Patentowego nr 850926, JP-A-2004 -002462, JP-A-10259179, JP-A-2002-293771 i JP-A-2003-321442. [0019] Bardziej korzystnie, środek ochronny dla neuronalnej komórki siatkówki jest, na przykład, środkiem, który zawiera jako składnik aktywny pochodną 15,15-difluoroprostaglandyny F2? ujawnioną w publikacji Europejskiego Zgłoszenia Patentowego nr 850926, JP-A-2004 -002462, JP-A-10-259179, JP-A-200215 293771 i JP-A-2003-321442. [0020] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, środek ochronny dla neuronalnej komórki siatkówki jest środkiem, który zawiera jako składnik aktywny pochodną 15,15-difluoroprostaglandyny F2? przedstawioną następującym wzorem ogólnym (1), która ponadto jest bardziej korzystną pochodną prostaglandyny F2? zawierającą fluor lub jej solą. 20 [R oznacza grupę karboksylową lub grupę jej soli albo grupę alkoksykarbonylową. [0021] Odpowiednie grupy i terminy określone w tym opisie zostaną przedstawione poniżej. 25 [0022] ?Fluorowiec? odnosi się do fluoru, chloru, bromu lub jodu. [0023] "Alkil" odnosi się do alkilu o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym mającym 1 do 6 atomów węgla. Szczególne przykłady obejmują metyl, etyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, n-heksyl, izopropyl, izobutyl, secbutyl, tert-butyl, izopentyl, i tym podobne. [0024] "Alkoksy" odnosi się do grupy alkoksylowej o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym mającym od 1 do 30 6 atomów węgla. Szczególne przykłady obejmują grupę metoksylową, etoksylową, n-propoksylową, nbutoksylową, n-pentyloksylową, n-heksyloksylową, izopropoksylową, izobutoksylową, sec-butoksylową, tertbutoksylową, izopentyloksylową, i tym podobne. [0025] "Aryl" odnosi się do monocyklicznego węglowodoru aromatycznego albo bicyklicznego lub tricyklicznego skondensowanego policyklicznego węglowodoru aromatycznego mającego 6 do 14 atomów 35 węgla. Konkretne przykłady obejmują fenyl, naftyl, antryl, fenantryl, i tym podobne. [0026] "Aryloksy" odnosi się do monocyklicznej aromatycznej grupy węglowodorowej albo bicyklicznej lub tricyklicznej skondensowanej, policyklicznej aromatycznej grupy węglowodorowej mającej 6 do 14 atomów węgla. Konkretne przykłady obejmują, grupę fenoksylową, naftyloksylową, fenantryloksylową, i tym podobne. 3 EP 1 864 666 B1 [0027] "Alkiloaminowy" oznacza grupę monoalkiloaminową lub dialkiloaminową mającą 1 do 12 atomów węgla. Konkretne przykłady obejmują, grupę metyloaminową, etyloaminową, dimetyloaminową, diheksylaminową, i tym podobne. [0028] "Aryloaminowy" odnosi się do grupy monoarylaminowej lub diarylaminowej zawierającej 6 do 28 5 atomów węgla. Konkretne przykłady obejmują grupę fenyloaminową, naftyloaminową, metylofenyloaminową, etylofenyloaminową, difenyloaminową, diantryloaminową, i tym podobne. [0029] Szczególnie korzystną zawierającą fluor pochodną prostaglandyny F2? jest, na przykład, pochodna 15,15-difluoroprostaglandyny F2? o wyżej wymienionym wzorze ogólnym (1), w którym R oznacza grupę karboksylową lub grupę jej soli albo grupę izopropoksykarbonylową. 10 [0030] Pochodne prostaglandyny F2? mogą być w postaci soli z kwasem nieorganicznym, takim jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas jodowodorowy, kwas azotowy, kwas siarkowy lub kwas fosforowy, z kwasem organicznym, takim jak kwas octowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas bursztynowy i kwas cytrynowy, z metalem alkalicznym, takim jak lit, sód lub potas, metalem ziem alkalicznych, takim jak wapń lub magnez, z amoniakiem, itp. Sole te są również objęte niniejszym 15 wynalazkiem. [0031] W niniejszym wynalazku "komórka neuronalna siatkówki" oznacza komórkę neuronalną biorącą udział w przekazywaniu sygnału wizualnego do mózgu. Konkretnie oznacza to komórkę fotoreceptorową, komórkę horyzontalną, komórkę dwubiegunową, wzrokową komórkę zwojową, komórkę amakrynową lub tym podobne. 20 [0032] W niniejszym wynalazku, "choroba oczu" oznacza chorobę oczu związaną z uszkodzeniem komórek neuronalnych siatkówki. [0033] Konkretnie oznacza to zaburzenia pola widzenia, zamknięcie naczyń siatkówki, retinopatię cukrzycową, niedokrwienną neuropatię nerwu wzrokowego, jaskrę, zwyrodnienie plamki żółtej, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, chorobę Lebera, lub tym podobne, a korzystnie oznacza to zaburzenia pola 25 widzenia, zamknięcie naczyń siatkówki, retinopatię cukrzycową, niedokrwienną neuropatię nerwu wzrokowego, zwyrodnienie plamki żółtej, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki lub chorobę Lebera. [0034] Środek ochronny dla neuronalnej komórki siatkówki według niniejszego wynalazku można podawać doustnie lub pozajelitowo. Przykłady postaci użytkowych do podawania obejmują krople do oczu, maść oczną, iniekcje, tabletkę, kapsułkę, granulki, proszek, i tym podobne, a szczególnie korzystne są krople do 30 oczu. Taki preparat można wytworzyć dowolną z powszechnie stosowanych technik, na przykład, techniką opisaną w JP-A-59-1418, JP-T-3-501025, JP-T-8-501310, JP-A-10-182465, WO 98/12175, publikacji Europejskiego Zgłoszenia Patentowego nr 850926, JP-A-2004-002462,JP-A-10-259179, JP-A-2002293771, JP-A-2003-321442, WO 02/22131 lub tym podobych. [0035] Na przykład, krople do oczu można wytwarzać stosując środek tonizujący, taki jak chlorek sodu lub 35 stężona gliceryna, bufor, taki jak fosforan sodu lub octan sodu, środek powierzchniowo czynny, taki jak polioksyetylenowany monooleinian sorbitolu, stearynian polioksylowy 40 albo polioksyetylenowany uwodorniony olej rycynowy, stabilizator, taki jak cytrynian sodu lub wersenian sodu, środek konserwujący, taki jak chlorek benzalkoniowy lub kwas p-hydroksybenzoesowy, w zależności od potrzeby. Dopuszczlne jest pH kropli do oczu w zakresie, który jest do przyjęcia jako preparat oftalmiczny. Korzystna wartość pH jest w 40 zakresie od 4 do 8. [0036] Maść oczną można wytwarzać używając szeroko stosowanego podłoża, takiego jak biała parafina miękka lub parafina ciekła, w zależności od potrzeby. 4 EP 1 864 666 B1 [0037] Ponadto, preparat doustny w postaci tabletki, kapsułki, granulek lub proszku można wytwarzać stosując wypełniacz, taki jak laktoza, celuloza krystaliczna, skrobia lub olej roślinny, środek smarujący, taki jak stearynian magnezu lub talk, środek wiążący, taki jak hydroksypropyloceluloza lub poliwinylopirolidon, środek rozsadzający, taki jak karboksymetyloceluloza wapniowa lub nisko podstawiona 5 hydroksypropylometyloceluloza, środek powlekający, taki jak hydroksypropylometyloceluloza, makrogol lub żywica silikonowa, środek błonotwórczy, taki jak błona żelatynowa, i tym podobne, w zależności od potrzeby. [0038] Dawkę można odpowiednio dobrać w zależności od objawów, wieku, postaci dawkowania, i tym podobnych. Krople do oczu można wkraplać od jednego do kilku razy dziennie, w stężeniu od 0,00001 do 1% (wag./obj.), korzystnie od 0,0001 do 1% (wag./obj.). Preparat doustny można podawać raz lub 10 podzielony na kilka razy w dawce na ogół od 0,01 do 5000 mg na dzień, korzystnie od 0,1 do 1000 mg na dzień. [0039] Jak to zostanie opisane szczegółowo w części Test Farmakologiczny poniżej, działanie pochodnej prostaglandyny F2? na indukowaną glutaminianem śmierć komórek neuronalnych siatkówki badano stosując szczurze płodowe komórki neuronalne siatkówki. W rezultacie, pochodna prostaglandyny F2? hamowała 15 indukowaną glutaminianem śmierć komórek neuronalnych siatkówki w sposób zależny od stężenia. Oznacza to, że pochodna prostaglandyny F2? ma działania ochronne dla neuronalnej komórki siatkówki i jest przydatna do zapobiegania lub leczenia choroby oczu związanej z uszkodzeniem komórek neuronalnych siatkówki. [0040] Poniżej zostaną opisane przykłady preparatów według niniejszego wynalazku i wyniki testu 20 farmakologicznego. Jednakże przykłady te są opisane w celu lepszego zrozumienia niniejszego wynalazku i nie mają na celu ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku. [Przykłady preparatu] 25 [0041] Poniżej zostaną opisane przykłady ogólnych preparatów zawierających pochodną prostaglandyny F2? według niniejszego wynalazku. 1) Krople do oczu (w 100 ml) [0042] Pochodna prostaglandyny F2? Stężona gliceryna Polisorbat 80 Dihydrat dihydroortofosforanu sodu Sterylna woda oczyszczona 1 N kwas solny lub 1 N wodorotlenek sodu pH 30 [0043] Żądane krople do oczu można otrzymać przez odpowiednie zmiany rodzajów i ilości pochodnej prostaglandyny F2? i substancji dodatkowych. 10 mg 2500 mg 2000 mg 200 mg q.s. q.s. 6,0 5 EP 1 864 666 B1 2) Maść oczna (w 100 g) [0044] Pochodna prostaglandyny F2? Ciekła parafina Biała parafina miękka Oczyszczona lanolina 0,1 g 20 g 77,9 g 2g [0045] Żądaną maść oczną można otrzymać przez odpowiednie zmiany rodzajów i ilości pochodnej 5 prostaglandyny F2? i substancji dodatkowych. [Test farmakologiczny] [0046] W celu znalezienia nowego farmaceutycznego zastosowania pochodnej prostaglandyny F2?, 10 stosując szczurze płodowe komórki neuronalne siatkówki, oceniono i zbadano działanie pochodnej prostaglandyny F2? na ochronę neuronalnych komórek siatkówki przeciwko indukowanej glutaminianem śmierci komórek neuronalnych siatkówki. [0047] Nawiasem mówiąc, jako pochodną prostaglandyny F2?, która jest badanym związkiem, stosowano 16-fenoksy-15-deoksy-15,15-difluoro-17,18,19,20-tetranor-prostaglandynę F2?. 15 (1) Hodowla do izolacji neuronalnych komórek siatkówki [0048] Ciężarnego szczura SD poddano laparotomii w znieczuleniu ogólnoustrojowym i macicę przeniesiono do naczynia zawierającego zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS). Płód szczura 20 wyizolowano z macicy i wyjęto gałki oczne z płodu szczura. Siatkówkę wyizolowano z gałek ocznych pod mikroskopem stereoskopowym i pokrojono na kawałki za pomocą noża chirurgicznego. Następnie, siatkówkę dalej rozdrobniono do poziomu komórkowego i przepuszczono przez siatkę nylonową (Nr 305, produkowana przez NBC Industries, Ltd.) w celu usunięcia agregatów komórkowych, a następnie otrzymany przesącz odwirowywano przy 1000 obr./min. przez 4 minuty. Supernatant usunięto, a do pozostałych 25 komórek dodano odpowiednią ilość zmodyfikowanej podłoża Eagle (MEM) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), w celu ich zawieszenia. Po zliczeniu liczby komórek za pomocą hemocytometru, dodano podłoże MEM zawierające 10% FBS, po czym otrzymano zawiesinę komórek o gęstości komórek 0,8 x 106 komórek/ml. Zawiesinę komórek zainokulowano w ilości 80 ?l każda na powlekane polietylenoiminą krążki z tworzywa sztucznego i krążki pozostawiono w inkubatorze (37°C, 5% CO2). Dzień 30 inokulowania komórek oznaczono jako dzień 1 hodowli, a wymianę podłoża przeprowadzono w dni parzyste. Nawiasem mówiąc, do dnia 4 stosowano podłoże MEM zawierające 10% FBS, a po dniu 8 stosowano podłoże MEM zawierające 10% surowicy końskiej (HS). Nawiasem mówiąc, w dniu 6 do usuwania komórek proliferacyjnych stosowano 6 ml podłoża zawierającego cytarabinę (Ara-C) (1,5 x 10 M w podłożu MEM zawierającym 10% FBS). 35 -5 6 EP 1 864 666 B1 (2) Wytworzenie zawierającego badany związek podłoża MEM zawierającego HS [0049] 2 mg badanego związku rozpuszczono w 100% etanolu, a otrzymany roztwór kolejno rozcieńczono zawierającym HS podłożem MEM, przy czym przygotowano zawierające HS podłoże MEM zawierające badany związek w 0,1 nM, 1 nM, 10 nM lub 100 nM. 5 (3) Przygotowanie wolnego od surowicy podłoża MEM zawierającego badany związek [0050] 2 mg badanego związku rozpuszczono w 100% etanolu, a otrzymany roztwór kolejno rozcieńczono wolnym od surowicy podłożem MEM, przy czym przygotowano wolne od surowicy podłoże MEM zawierające 10 badany związek w 0,1 nM, 1 nM, 10 nM lub 100 nM. (4) Ocena śmierci komórek [0051] W 10 dniu hodowli, krążki z tworzywa sztucznego, na których inokulowano i hodowano komórki 15 przeniesiono do zawierającego HS podłoża MEM zawierającego badany związek i inkubowano przez 24 godziny (37°C, 5% CO2). Krążki z tworzywa sztucznego przeniesiono na wolne od surowicy podłoże MEM zawierające 1 mM glutaminianu i inkubowano przez 10 minut, a następnie przeniesiono na wolne od surowicy podłoże MEM zawierające badany związek i inkubowano przez 1 godzinę (37°C, 5% CO2) . Następnie komórki wybarwiono 1,5% roztworem błękitu trypanowego przez 10 minut i utrwalono dodając 20 10% utrwalający roztwór formaliny. Po przemyciu komórek roztworem soli fizjologicznej, wybarwione komórki i niewybarwione komórki zliczono pod mikroskopem odwróconym. [0052] Grupę do podawania nośnika przygotowano przeprowadzając to samo badanie w sposób opisany powyżej, z tym, że zamiast wyżej wymienionego zawierającego HS podłoża MEM zawierającego badany związek zastosowano zawierające HS podłoże MEM, a wolne od surowicy podłoże MEM zastosowano 25 zamiast wspomnianego powyżej wolnego od surowicy podłoża MEM zawierającego badany związek. [0053] Ponadto, grupę nietraktowaną przygotowano przeprowadzając to samo badanie jak opisane powyżej, z tym, że zastosowano podłoże MEM zawierające HS zamiast wyżej wymienionego zawierającego HS podłoża MEM zawierającego badany związek, a podłoże MEM wolne od surowicy zastosowano zamiast wyżej wymienionego podłoża MEM wolnego od surowicy zawierającego badany związek, a następnie nie 30 przeprowadzono traktowanie wolnym od surowicy podłożem MEM zawierającym glutaminianu. [0054] Przeżywalność obliczono na podstawie następującego równania. Współczynnik przeżywalności (%) = {(liczba komórek niewybarwionych) / (liczba komórek niewybarwionych + liczba komórek wybarwionych)} x 100 35 (5) Wyniki i omówienie [0055] Jak pokazano na Fig. 1, w grupie, której podawano nośnik, zaobserwowano śmierć około 40% neuronalnych komórek siatkówki spowodowaną traktowaniem glutaminianem. Jednak, gdy jako podłoże stosowano zawierające HS podłoże MEM zawierające badany związek (0,1 nM do 100 nM), śmierć komórek neuronalnych siatkówki indukowana glutaminianem była hamowana w sposób zależny od stężenia, co 40 potwierdzało, że badany związek ma działanie chroniące komórkę neuronalną siatkówki. 7 EP 1 864 666 B1 [0056] Fig. 1 jest wykresem przedstawiającym współczynnik przeżywalności dla każdego stężenia w przypadku stosowania badanego związku z dodaniem glutaminianu. Zastrzeżenia 5 1. Związek przedstawiony następującym wzorem ogólnym (1) lub jego sól do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu choroby oczu związanej z uszkodzeniem neuronalnej komórki siatkówki, przy czym chorobą oczu jest zaburzenie pola widzenia, zamknięcie naczyń siatkówki, retinopatia cukrzycowa, niedokrwienna neuropatia nerwu wzrokowego, zwyrodnienie plamki żółtej, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki lub choroba Lebera: 10 , w którym R oznacza grupę karboksylową lub grupę jej soli albo grupę (C1-C6) alkoksykarbonylową. 15 20 25 30 35 8 EP 1 864 666 B1 Przeżywalność (%) 5 10 15 20 Nietraktowany nośnik 9 Badany związek EP 1 864 666 B1 ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE Lista przytoczonych przez zgłaszającego odnośników ma na uwadze jedynie wygodę czytelnika. Nie stanowi ona części Europejskiego dokumentu patentowego. Mimo, że zestawienie było wykonane z dużą starannością, nie można wykluczyć błędów lub pominięć i EUP nie bierze za nie żadnej odpowiedzialności. 5 Dokumenty patentowe cytowane w opisie Dokumenty niepatentowe cytowane w opisie 10 10












ANKIETA

Jak oceniasz nowe technologie na mundialu?

Grupy dyskusyjne