Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 2167951 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 2167951 T3


EP 2167951 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2167951 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 20.06.2008 08774195.5 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 26.09.2012 Europejski Biuletyn Patentowy 2012/39 EP 2167951 B1 (13) (51) T3 Int.Cl. G01N 27/447 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) Tytuł wynalazku: Metoda FFE wykorzystująca medium rozdzielające zawierające lotny bufor (30) Pierwszeństwo: 20.06.2007 US 945246 P 12.11.2007 US 987208 P 29.04.2008 US 48777 Zgłoszenie ogłoszono: 31.03.2010 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/13 (43) (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 29.03.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/03 (73) Uprawniony z patentu: Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, US (72) Twórca(y) wynalazku: GERHARD WEBER, Kirchheim-Heimstetten, DE MIKKEL NISSUM, Poing, DE PL/EP 2167951 T3 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Maria Anna Rożkowicz WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla 12 53-114 Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). PZ/1765/AR EP 2 167 951 B1 Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek lotnych ogólnie buforów dotyczy podczas zastosowania elektroforezy medium rozdzielającego (free flow obejmującego układ swobodnej electrophoresis, FFE). Media rozdzielające tutaj przedstawione pozwalają na wygodną separację analitów na drodze elektroforezy, a dodatkowa ich zaleta związana jest z możliwością łatwego i całkowitego usunięcia składników buforu i rozpuszczalnika po przeprowadzonym etapie rozdziału elektroforetycznego. Dokładniej, metody poprzedzające analizę w spektroskopii masowej obejmujące etap rozdziału FFE z zastosowaniem rzeczonych mediów rozdzielających są przedmiotem niniejszego wynalazku. Tło wynalazku [0002] Elektroforeza jest dobrze opracowaną techniką separacji cząsteczek, której podstawą jest migracja cząsteczek pod wpływem bezpośredniego działania prądu elektrycznego. Kilka różnych metod postępowania takich jak ogniskowanie izoelektryczne (isoelectric focusing, IEF), elektroforeza strefowa (zone electrophoresis, ZE) oraz izotachoforeza (isotachophoresis, ITP) opracowano jako warianty wyżej wspomnianej zasady separacji, metody te znane są osobom biegłym w dziedzinie. [0003] IEF jest techniką o powszechnym zastosowaniu, np. podczas charakterystyki białek jako sposób określenia punktu izoelektrycznego białka (patrz np. Analytical Biochemistry, Addison Wesley Longman Limited-Third Edition, 1998), podczas gdy ZE oparta jest o różnicę wartości mobilności elektroforetycznej separowanej cząsteczki i naładowanych cząstek zastosowanego medium rozdzielającego. [0004] Powyższe ogólne metody postępowania mogą być zastosowane podczas kilku różnych technik elektroforetycznych takich jak elektroforeza w nośniku stałym (np. bibuła filtracyjna, octan celulozy, agaroza itp.), elektroforeza kapilarna oraz elektroforeza swobodna (FFE). [0005] Pośród technik elektroforetycznych, FFE pozostaje jedną z najbardziej obiecujących [Krivanova L. & Bocek P. (1998), "Continuous free-flow electrophoresis", Electrophoresis 19: 1064-1074]. FFE jest techniką, podczas której rozdział analitów zachodzi w medium płynnym, pod nieobecność fazy stałej (lub stałego materiału wspomagającego), w celu zminimalizowania utraty próbki następującej pod wpływem adsorpcji. Elektroforeza swobodna jest często określana jako elektroforeza różnicująca bez użycia nośnika lub bez użycia matrycy. [0006] W dziedzinie proteomiki, FFE jest techniką wyboru dla określonego wstępnego rozdziału złożonych próbek białek w oparciu o zróżnicowane wartości ich punktów izoelektrycznych (pI). Z zastosowaniem FFE, cząsteczki organiczne i nieorganiczne, biocząstki, biopolimery i biocząsteczki mogą być rozdzielane na podstawie ich ruchliwości elektroforetycznej. PZ/1765/AR 2 EP 2 167 951 B1 Odpowiednie wytyczne zostały dotychczas opisane [e.g. Bondy B. et al. (1955), "Sodium chloride in separation medium enhances cell compatibility of free- flow electrophoresis", Electrophoresis 16:92-97]. [0007] Proces FFE usprawniono np. poprzez wykorzystanie mediów stabilizujących i mediów przeciwprzepływowych. Opisane zostało to na przykład w U.S. Patent 5,275,706. Według tego patentu, medium przeciwprzepływowe wprowadzane jest do przestrzeni rozdziału, przeciwległej do kierunku ciągłego objętościowego przepływu medium rozdzielającego i próbki migrującej pomiędzy elektrodami. Oba media (medium rozdzielające i medium przeciwprzepływowe) są pozbawiane ładunku lub eluowane jako próbki wyjściowe, zazwyczaj do płytek do mikromiareczkowania, wynikiem, czego jest proces frakcjonowania o niskiej objętości opróżniania. Dodatkowo, zachowany jest przepływ laminarny w regionie frakcjonowania próbek wyjściowych (tzn. przepływ jest niezaburzony lub wykazuje niskie zaburzenia). [0008] Szczególna odmiana techniki FFE, określana jako interwałowa FFE, ujawniona jest na przykład w U.S. Patent 6,328,868. W patencie tym próbka i medium rozdzielające wprowadzane są do komory elektroforetycznej, a anality w próbce rozdzielane są metodami elektroforetycznymi takimi jak ZE, IEF lub ITP i ostatecznie wyprowadzane są z komory w postaci wyjściowych próbek frakcyjnych. Korzystne realizacje patentu '868 opisują ruch medium rozdzielającego i próbki jako nieukierunkowany, polegający na migracji z końca wlotowego do końca wylotowego komory, zachodzący pod wpływem przyłożonego efektywnego napięcia wywołującego migrację elektroforetyczną, podczas gdy próbka i nośnik nie przemieszczają się od końca wejściowego do końca wyjściowego, co stanowi przeciwieństwo techniki powszechnie w dziedzinie stosowanej, w której próbka i nośnik podczas procesu rozdziału w aparacie przemieszczają się w polu elektrycznym (ciągła FFE). [0009] Tak zwana metoda cykliczna lub cykliczno- interwałowa w odniesieniu do FFE, jak tutaj zastosowanej, opisana została w WO 2008/025806. Podsumowując, metoda cyklicznointerwałowa charakteryzuje się przynajmniej jednym a możliwie wielokrotnymi odwróceniami kierunku przepływu objętościowego, podczas gdy próbka utrzymywana jest w polu elektroforetycznym pomiędzy wydłużonymi elektrodami. W przeciwieństwie do statycznej metody interwałowej, próbka pozostaje w ciągłym ruchu, co umożliwia uzyskanie pola o większej sile, a tym samym lepszy (szybszy) rozdział. Dodatkowo, poprzez odwracanie przepływu objętościowego próbki pomiędzy wydłużonymi elektrodami, czas przebywania analitu w polu elektrycznym może być znacząco wydłużony, co skutkuje wydłużonym czasem rozdziału i/lub wyższą wydajnością rozdziału oraz wyższą rozdzielczością. Odwrócenie przepływu objętościowego w dowolnym, równoległym do wydłużonych elektrod, kierunku (określane jako cykl) może być powtarzane tak często, jak jest to koniecznym w określonej sytuacji, jednakże względy praktyczne, a także chęć PZ/1765/AR 3 EP 2 167 951 B1 przeprowadzenia rozdziału w krótkim czasie zazwyczaj będzie ograniczać liczbę cykli prowadzonych podczas metody. [0010] Międzynarodowy wniosek patentowy WO 02/50524 ujawnia metodę elektroforetyczną, wykorzystującą aparat z komorą separacyjną, poprzez którą następuje przepływ medium i która zapewnia obszar rozdziału wyznaczony poprzez dno i pokrywę oraz separatory oddzielające je od siebie. Dodatkowo, taki aparat FFE zawiera pompę dostarczającą medium rozdzielające, która wpływa do komory separacyjnej poprzez przewody zasilające medium i opuszcza komorę poprzez odpływy. Aparat FFE zawiera również elektrody tworzące pole elektryczne w medium rozdzielającym i miejsce nastrzykiwania próbki, umożliwiające nałożenie mieszaniny cząstek lub analitów oraz miejsca frakcjonowania, umożliwiające zebranie cząstek rozdzielonych w medium rozdzielającym podczas FFE. Rozdzielone cząstki mogą być wykorzystane do celów analitycznych lub podczas dodatkowych procesów preparacyjnych. W dowolnym wypadku, wniosek ten nie dotyczy ujawnienia żadnych mediów rozdzielających. [0011] W dziedzinie znanych jest kilka mediów rozdzielających do rozdziału takich analitów jak biocząstki i biopolimery. Na przykład, książka "Free-flow Electrophoresis", wydana przez K. Hannig i K. H. Heidrich, (ISBN 3-921956-88-9) przedstawia listę mediów rozdzielających użytecznych podczas FFE, a w szczególności podczas swobodnej ZE (FF-ZE). U.S. Patent 5,447,612 (dla Bier et al.) ujawnia kolejne medium rozdzielające, które jest układem buforującym pH, stosowanym w celu rozdziału analitów podczas IEF, na drodze wytworzenia funkcjonalnie stabilnych prefabrykowanych gradientowych wąskich obszarów pH w wolnym roztworze. Wykorzystuje on składniki buforujące zestawione w komplementarnych parach buforowych. Składniki buforów wybierane są spośród prostych chemicznie, zdefiniowanych amfolitów, słabych kwasów i słabych zasad i sparowane są na podstawie ich właściwości dysocjacyjnych w sposób zapewniający gradient pH o raczej wąskim zakresie, zawierającym się pomiędzy 0.4 a 1.25 jednostek pH. Bier et al., Electrophoresis, Vol. 10(10)(1989), strony 690697 przedstawia różne procesy rozdziału chromosomów prowadzone techniką FFE, wykorzystujące jako składniki buforowe medium rozdzielającego, między innymi, TRIS/ kwas octowy. Nath et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 51 (1) (1996), strony 15-22 również opisują rozdział FFE wykorzystujący TRIS/kwas octowy jak medium buforujące oraz następującą po nim analizę frakcji uzyskanej podczas rozdziału FFE prowadzoną na drodze spektroskopii UV/VIS. [0012] Analiza spektrometrii mas (mass spectrometric, MS) jest skuteczną techniką analityczną, stosowaną w celu identyfikacji nieznanych związków, w celu oznaczeń ilościowych znanych związków oraz w celu oznaczenia struktury i właściwości chemicznej cząsteczek. Jest ona istotną, rozwijającą się metodą analityczną, wykorzystywaną podczas charakterystyki cząsteczek nieorganicznych i organicznych, a zwłaszcza biocząstek, biopolimerów i biocząsteczek. Istnieją dwie główne metody jonizacji cząsteczek biologicznych takich jak białka czy polisacharydy: jonizacja elektrosprejem (elektro spray jonization, ESI) oraz jonizacja przez PZ/1765/AR 4 EP 2 167 951 B1 desorpcję laserową z wykorzystaniem matrycy (matrix-assisted-laser-desorption/ionization, MALDI). W celu przygotowania próbki gotowej do wykorzystania podczas analizy MALDI, analizowana próbka, którą opcjonalnie poddaje się uprzednim etapom takim, jak fragmentacja analitu (np. trawienie) lub usunięcie związków zakłócających, mieszana jest z matrycą i pozostawiana do wysuszenia przed nałożeniem do spektrometru masowego. [0013] Istnieje kilka możliwych problemów, które należy rozwiązać w celu przeprowadzenia udanej analizy spektroskopii masowej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, szczególnie biocząsteczek takich jak białka. Białka lub inne cząsteczki biologiczne, będące przedmiotem zainteresowania badaczy, stanowią zazwyczaj część bardzo złożonej mieszaniny innych białek lub cząsteczek występujących wspólnie w medium biologicznym. Stanowi to przyczynę kilku istotnych problemów. Po pierwsze, dwie spośród czterech technik jonizacyjnych stosowanych dla dużych cząsteczek jest efektywnych jedynie w przypadku, gdy mieszanina zawiera w przybliżeniu taką samą ilość poszczególnych składników, podczas gdy w próbkach pochodzenia biologicznego, różne białka i cząsteczki zazwyczaj występują w wysoce zróżnicowanej ilości. Gdy taką mieszaninę poddaje się jonizacji z zastosowaniem ESI lub MALDI, cząsteczki występujące w większej ilości wykazują tendencję do "zagłuszania" sygnału pochodzącego od cząsteczek występujących mniej obficie. Drugi problem związany jest z faktem, że widmo dla złożonej mieszaniny jest bardzo trudne do interpretacji ze względu na przytłaczającą liczbę składników mieszaniny. Problem ten jest dodatkowo pogłębiany, np. przez fakt, że proces trawienia enzymatycznego białek jest źródłem dużej liczby produktów peptydowych. Dodatkowo, wiele substancji (np. soli nieorganicznych), które powszechnie występują w próbkach zawierających biocząsteczki jest nielotnych w warunkach roboczych spektrometrii masowej lub interferuje z procesem jonizacji podczas pomiaru spektrometrycznego i z tego względu wstrzymuje sygnał pochodzący od analitu. [0014] W istocie, jedną z głównych przeszkód stojących na drodze do szerokiego zastosowania techniki MS w analizie próbek biologicznych, jest wydajne oczyszczenie lub przynajmniej znaczące wzbogacenie próbki cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania, a tym samym zwiększenie jej przydatności w technice MS. Nawet najbardziej wyrafinowane, czułe oprzyrządowanie nie jest w stanie wygenerować użytecznych danych z próbki nieoczyszczonej lub zawierającej nieodpowiednią ilość analizowanej cząsteczki. Niestety, większość biocząsteczek będących przedmiotem zainteresowania występuje tylko w niewielkiej ilości. Dlatego też, przygotowanie próbki jest obecnie jednym z krytycznych, stanowiącym często wyzwanie pod względem technicznym, etapów udanego projektu analizy biomolekuły metodą MS. W celu przezwyciężenia tego problemu, analizy spektrometryczne są zwykle poprzedzane metodami frakcjonowania lub wzbogacania substancji. PZ/1765/AR 5 EP 2 167 951 B1 [0015] Pomimo, że elektroforeza jest wydajną techniką separacji lub frakcjonowania substancji, istnieją pewne wady stosowania konwencjonalnej elektroforezy podczas rozdziału analitów do późniejszej analizy MS rozdzielonych analitów. [0016] Wiadomym w dziedzinie jest, że składniki buforów jonowych, sole i detergenty należy usunąć przed rozpoczęciem analizy MS. Rzeczywiście, wiele jonów nieorganicznych (np. jonów metali lub jonów halogenków), występujących powszechnie w buforujących układach do elektroforezy, osłabia sygnał podczas spektroskopii masowej, interferuje z procesem jonizacji i tworzy addukty z wieloma związkami. Stosownie do tego, próbki przeznaczone do analizy MS, należy poddać czasochłonnym procedurom, które potencjalnie mogą prowadzić do utraty analizowanego materiału. Do procedur tych należą, na przykład, ekstrakcja cieczowa (Davidsson P. et al., (1999) Anal. Chem., 71, 642-647), tworzenie par jonowych (Königsberg, WH and Henderson, L.; (1983) Meth. Enzymol., 91, 254-259), lub precypitacja białek z chlorkiem guanidyny (Chirgwin, J. M. et al., (1979) Biochemistry 18, 5294-5299). [0017] W świetle powyższych, staje się oczywistym, że istnieje w dziedzinie zapotrzebowanie na efektywne i wygodne techniki rozdziału lub frakcjonowania, zwłaszcza dla próbek nieorganicznych, organicznych lub próbek o biologicznym pochodzeniu, które umożliwiałyby oczyszczenie lub przynajmniej wzbogacenie próbki o analit będący przedmiotem zainteresowania, poprzedzające jego analizę np. na drodze spektroskopii masowej, ale ograniczałyby wady metod znanych w dziedzinie uprzednio. Streszczenie Wynalazku [0018] Przedmiotem korzystnych realizacji niniejszego wynalazku jest zatem przedstawienie metod umożliwiających wygodny i powtarzalny rozdział/frakcjonowanie cząsteczek, będących przedmiotem zainteresowania i pozwalających na późniejszą analizę rozdzielonych lub przynajmniej wzbogaconych próbek, bez konieczności prowadzenia czasochłonnych i narażających na utratę próbki procesów poprzedzających późniejszą analizę techniką spektroskopii masowej. [0019] Kolejnym przedmiotem korzystnych realizacji niniejszego wynalazku jest przedstawienie układów mediów pozbawionych matrycy do zastosowania w technikach rozdziału FFE, które byłyby korzystniejsze od powszechnie stosowanych układów mediów do FFE, ponieważ potencjalnie zakłócające składniki buforów (np. sole nieorganiczne) mogą być albo łatwo usunięte lub nie wpływają na późniejsze analizy rozdzielonych analitów, będących przedmiotem zainteresowania, prowadzonej techniką spektroskopii masowej. [0020] Zaskakująco, wynalazcy odkryli, że media rozdzielające obejmujące lotne składniki buforowe są odpowiednie dla preparatywnych i analitycznych rozdziałów FFE oraz, że pozwalają na efektywny rozdział lub frakcjonowanie analitów, skutkujące znaczącym oczyszczeniem lub wzbogaceniem próbki, która w wygodny sposób może być użyta podczas PZ/1765/AR 6 EP 2 167 951 B1 późniejszej analizy MS, bez konieczności prowadzenia czasochłonnych etapów preparacji próbki (np. odsalania). Niniejszy wynalazek przedstawia metodę analizy analitów obejmującą rozdział analitów drogą elektroforezy swobodnej (FFE) obejmującej rzeczone wodne medium rozdzielające i następującą po niej analizę przynajmniej jednego analitu, będącego przedmiotem zainteresowania, otrzymanego podczas etapu rozdziału rzeczoną techniką FFE, w której rzeczoną następującą analizą jest analiza wykonana techniką spektroskopii masowej, wybrana spośród jonizacji elektrosprejem (ESI), powierzchniowo wzmocnionej laserowej desorpcji/ jonizacji (surface-enhanced laser desorption/ionization, SELDI), jonizacji przez desorpcję laserową w matrycy (MALDI lub MALDI-TOF-MS(/MN)), lub LC-MS(/MS). Media rozdzielające FFE stosowane w ramach rzeczonej metody obejmują przynajmniej jeden kwas buforowy oraz przynajmniej jedną zasadę buforową, gdzie każdy z kwasów buforowych i zasad buforowych są lotne. Po zebraniu analitów będących przedmiotem zainteresowania podczas etapu rozdziału FFE, i opcjonalnie, możliwym trawieniu białek (w zastosowaniach proteomicznych) lub próbek zawierających DNA, lotne składniki buforowe i rozpuszczalnik mogą być z łatwością i całkowicie usunięte, umożliwiając otrzymanie albo czystego analitu lub próbki obejmującej analit(y) gotowe do wykorzystaniu podczas dalszych analiz takich jak analizy techniką spektroskopii masowej. [0021] Media rozdzielające tutaj opisane są szczególnie odpowiednie do zastosowania podczas np., swobodnej ZE (free flow ZE, FF-ZE) oraz korzystniej, podczas swobodnej IEF (free flow IEF, FF-IEF), jednakże dla osób biegłych w dziedzinie oczywistym będzie, że media rozdzielające tutaj przedstawione mogą w zasadzie być również użyte w innych zastosowaniach, takich jak elektroforeza na nośniku. [0022] Rozkład pH medium rozdzielającego w komorze separacyjnej podczas elektroforezy może nie być ciągłym, tzn. w obrębie strefy rozdziału pomiędzy anodą i katodą aparatu do FFE wytworzy się jeden lub więcej obszarów różniących się pH i/lub stanów równowagi. Media takie są szczególnie użyteczne podczas zastosowań FFE prowadzonych w trybie IEF. [0023] Alternatywnie, rozkład pH wykazywany przez medium rozdzielające może być zasadniczo liniowy (tzn. pozbawiony znaczących obszarów o danym pH obserwowanych podczas rozdziału elektroforetycznego), lub nawet zasadniczo stały (tzn. "płaski" rozkład pH, lub raczej łagodny gradient pH w komorze separacyjnej). [0024] Media rozdzielające mogą obejmować wyłącznie jeden kwas buforowy i jedną zasadę buforową. Innymi słowy, takie media rozdzielające stanowią binarne media rozdzielające (tak zwane media A/B), w których ugrupowanie kwasowe lotnego związku i ugrupowanie zasadowe innego lub tego samego związku lotnego, zasadniczo służy ustaleniu odpowiedniego rozkładu pH i profilu przewodności medium rozdzielającego. Podczas gdy możliwym jest osiągnięcie dobrych rezultatów przy zastosowaniu w medium rozdzielającym jednego lub więcej kwasów buforowych i zasad buforowych, zazwyczaj korzystnym jest stosowanie najmniejszej możliwej liczby składników, nie tylko ze względu na niższe koszta uzyskania i łatwiejsze zastosowanie PZ/1765/AR 7 EP 2 167 951 B1 takich mediów, ale również ze względu na fakt, że właściwości elektrochemiczne takiego medium mogą być bardziej złożone w przypadku, gdy wzrośnie liczba indywiduów obdarzonych ładunkiem, obecnych w komorze separacyjnej. Krótki Opis Figur [0025] Figury 1 oraz 2 przedstawiają wyniki rozdziału FFE białek ludzkiego osocza prowadzonego metodą elektroforezy ciągłej IEF, jak opisano w Przykładzie 1 poniżej. [0026] FIG. 1 przedstawia rozdział frakcyjny próbki pomiędzy anodą (lewa) i katodą (prawa) (96 frakcji zebranych do standardowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania). i wskazuje pH frakcji. Zabarwione markery pI separowano w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja każdej frakcji przy długości fali ?=420nm, 515nm oraz 595nm, reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI również została przedstawione na FIG.1. [0027] FIG. 2 przedstawia odpowiadający żel SDS-PAGE otrzymany dla różnych frakcji, wskazujący na obecność frakcjonowanych analitów w próbce. [0028] Figury 3 oraz 4 ilustrują wyniki kolejnego rozdziału FFE zubożającego ilość albuminy ludzkiej surowicy w próbce białek ludzkiego osocza przeprowadzonego metodą elektroforezy IEF (FF-IEF) jak opisano poniżej w Przykładzie 2. [0029] FIG. 3 przedstawia rozdział frakcyjny próbki pomiędzy anodą (lewa) i katodą (prawa) (96 frakcji zebranych do standardowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania) i wskazuje pH frakcji. Zabarwione markery pI separowano w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja każdej frakcji przy długości fali ?=420nm, 515nm oraz 595nm reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI również została przedstawione na FIG.3. [0030] FIG. 4 przedstawia odpowiadający żel SDS-PAGE otrzymany dla różnych frakcji i wykazujący zdolność zubożania albuminy ludzkiej surowicy. [0031] FIG. 5 ilustruje wyniki rozdziału FFE prowadzonego metodą elektroforezy cyklicznointerwałowej (cykliczna FF-IEF) opisanego poniżej w Przykładzie 3. Przedstawia rozdział frakcyjny próbki pomiędzy anodą (lewa) i katodą (prawa) (96 frakcji zebranych do standardowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania) i wskazuje pH frakcji. Zabarwione markery pI poddano separacji w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja każdej z frakcji przy długości fali ?=420nm, 515nm oraz 595nm, reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI również została przedstawiona na FIG.5. [0032] FIG. 6 ilustruje wyniki kolejnego rozdziału FFE w próbce peptydów otrzymanych po trypsynizacji komórek HeLa, przeprowadzonego metodą elektroforezy ciągłej IEF (FF-IEF) jak dokładniej opisano poniżej w Przykładzie 4. FIG. Przedstawia rozdział frakcyjny próbki PZ/1765/AR 8 EP 2 167 951 B1 pomiędzy anodą (lewa) i katodą (prawa) (96 frakcji zebranych do standardowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania) i wskazuje pH frakcji. Zabarwione markery pI poddano separacji w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja każdej frakcji przy długości fali ?=420nm, 515nm oraz 595nm reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI również została przedstawione na FIG.6. [0033] FIG. 7 przedstawia Chromatogram Piku Bazowego zarejestrowanego dla próbki z frakcji 42 otrzymanej podczas eksperymentu opisanego w Przykładzie 4. Wyizolowana frakcja została bezpośrednio poddana analizie LC-MS/MS i nie poddana była żadnym dodatkowym etapom preparacji próbki. [0034] Figury 8 do 10 przedstawiają wyniki kolejnego rozdziału FFE próbki zawierającej białka ludzkiego osocza, prowadzonego metodą elektroforezy ciągłej IEF (FF-IEF), poprzedzającej analizę SDS-PAGE i następującą po niej analizę, metodą spektrometrii masowej MALDI-TOF, oczyszczonej frakcji jak opisano bardziej szczegółowo w Przykładzie 5 poniżej. [0035] FIG. 8 przedstawia rozdział frakcyjny próbki pomiędzy anodą (lewa) i katodą (prawa) (96 frakcji zebranych do standardowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania) i wskazuje pH frakcji. Zabarwione markery pI separowano w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja każdej frakcji przy długości fali ?=420nm, 515nm oraz 595nm reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI również została przedstawione na FIG.8. [0036] FIG. 9 przedstawia odpowiadający żel SDS-PAGE otrzymany dla różnych frakcji. [0037] FIG. 10 przedstawia Chromatogram Piku Bazowego zarejestrowanego dla próbki z frakcji 53 otrzymanej podczas eksperymentu opisanego w Przykładzie 5. Wyizolowana frakcja została bezpośrednio poddana analizie MALDI-TOF i nie poddana była żadnym dodatkowym etapom odsalania. [0038] Figury 11 do 12 przedstawiają wyniki kolejnego rozdziału FFE liofilizowanego ekstraktu białek osy, prowadzonego metodą elektroforezy ciągłej IEF z zastosowaniem różnych układów lotnych buforów jak dokładniej opisano w Przykładzie 6 poniżej. [0039] FIG. 11 przedstawia rozdział frakcyjny próbki pomiędzy anodą (lewa) i katodą (prawa) (96 frakcji zebranych do standardowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania) i wskazuje pH frakcji. Zabarwione markery pI separowano w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja każdej frakcji przy długości fali ?=420nm, 515nm oraz 595nm reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI również została przedstawione na FIG.11. [0040] FIG. 12 przedstawia odpowiadający żel SDS-PAGE otrzymany dla różnych frakcji odzyskanych po rozdziale FFE. [0041] FIG. 13 przedstawia dwa barwione srebrem żele SDS-PAGE dla frakcji otrzymanych z surowicy python sebae, podczas elektroforezy swobodnej za pomocą ogniskowania PZ/1765/AR 9 EP 2 167 951 B1 izoelektrycznego, prowadzonej z zastosowaniem układu lotnych buforów, podczas której rozdział prowadzony był w obecności 3-[3-(1,1-bisalkiloksyetylo)pirydyn-1-ylo)propano-1sulfonian (PPS) (pierwszy żel) oraz pod nieobecność PPS (drugi żel). [0042] FIG. 14 przedstawia widmo MALDI-TOF dla białka o masie 25kDa wyizolowanego we frakcji 26 podczas etapu elektroforezy swobodnej w obecności układu lotnych buforów i rozkładalnego detergentu PPS. [0043] FIG. 15 przedstawia rozdział frakcyjny próbki pomiędzy anodą (lewa) i katodą (prawa) (96 frakcji zebranych do standardowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania) i wskazuje pH frakcji. Zabarwione markery pI separowano w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja każdej frakcji przy długości fali ?=420nm, 515nm oraz 595nm reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI również została przedstawione na FIG.15. [0044] FIG. 16 przedstawia nielimitujący przykład obrazujący podstawę metody, w której obszar rozdziału obejmuje strefa A utworzona przez bufor medium rozdzielającego (SBM) obejmującego układ lotnego buforu (SBM typu A) oraz strefę B utworzoną przez SBM obejmującego układ buforu nielotnego (SBM typu B). Metoda przedstawiona na FIG. 16 jest cykliczno- interwałowym ogniskowaniem izoelektrycznym, w którym próbka wprowadzana jest do strefy B, a kwasowe anality będące przedmiotem zainteresowania eluują do SBM typu A. Opcjonalnie, próbka może być wprowadzona również do strefy A. [0045] FIG. 17 przedstawia schematyczny swobodny rozdział izotachoforetyczny (free flow isotachophoretic, FF ITP) prowadzony w przykładowej komorze separacyjnej FFE. [0046] Figury 18a do 18c przedstawiają schematyczny obraz warunków w sekcjach 18A, 18B oraz 18C jak wskazano na FIG. 17. Próbka wprowadzana jest do regionu oddzielającego utworzonego przez SBM typu A, np. do strefy A. Zatężona strefa terminującego elektrolitu T i rozcieńczona strefa T formują pierwszą strefę B, a strefa stabilizująca L oraz strefa wiodącego elektrolitu tworzą drugą strefę B. [0047] Sekcja 18A (FIG. 18a): Wyjściowe warunki przedstawiające zastosowane elektrolity oraz elektrolity oddzielające. Pomiędzy pierwszą (prawa strona) elektrodą i drugą (lewa strona) elektrodą, przestrzeń rozdziału obejmuje strefę stabilizującą (zatęż. L.), strefę elektrolitu wiodącego (L), strefę elektrolitu oddzielającego (S) (obejmującą jony oddzielające S1, S2 oraz S3), zatężoną strefę T elektrolitu terminującego (T zatęż.) oraz rozcieńczoną strefę T (T zatęż./X), którą rozcieńczono w oparciu o współczynnik X tutaj opisany. [0048] Sekcja 18B (FIG. 18b): Warunki przedstawiające obszar rozdziału w przypadku dodania próbki do przepływu elektrolitów jak zobrazowano na Fig. 4a. Na tym etapie miejsce wprowadzenia próbki (14) jest zlokalizowane pomiędzy pierwszą i drugą elektrodą a próbka obejmująca jony próbki S1 oraz S2 jest wprowadzana do mediów rozdzielających. W strefie B, PZ/1765/AR 10 EP 2 167 951 B1 pole elektryczne może być już wytworzone, lub pole elektryczne zostanie wytworzone na chwilę po, podczas gdy próbka jest zlokalizowana pomiędzy sekcjami B i C. [0049] Sekcja 18C (FIG. 18c): Stan przedstawiający ruch i efekt uporządkowania podczas izotachoforezy wywołany polem elektrycznym wytworzonym pomiędzy pierwszą i drugą elektrodą. Stan utworzony jest przez odpowiedni dobór i pozycjonowanie L, jonów próbki (A1 i A2), jonów oddzielających (S1, S2 i S3), T zatęż., T zatęż./X oraz Ts dil (wysoce rozcieńczonego) jak zdefiniowano powyżej. Strefa Ts dil elektrolitu terminującego jest utworzona w taki sposób, że stężenie terminującego T w strefie Ts dil jest niższe nawet od stężenia T zatęż./X w strefie T zatęż./X. Stężenie strefy T terminującego elektrolitu jest określone poprzez stężenie stref elektrolitu wiodącego oraz próbki w oparciu o równanie Kohlrausch'a. Szczegółowy Opis Wynalazku [0050] Niniejszy wynalazek przedstawia metodę analizy, identyfikacji i analizy ilościowej analitów metodą spektroskopii masowej, obejmującą etap FFE wykorzystujący lotne media rozdzielające. [0051] Niniejsze media rozdzielające, obejmujące lotne związki buforujące, posiadają korzystne właściwości ponieważ pozwalają z jednej strony na niezawodny i powtarzalny rozdział lub frakcjonowanie analitów metodą FFE a z drugiej strony ich zaletą jest fakt, że lotny układ buforów (rozpuszczalnik i cząsteczki buforu) mogą być w łatwy, niepozostawiający niechcianych składników, sposób usunięte ("usunięcie bezszczątkowe"), niekompatybilnych z późniejszymi metodami opartymi analitycznymi o spektrometrię mas. Innymi słowy, etap rozdziału FFE, wykorzystujący lotne media rozdzielające według niniejszego wynalazku, pozwala na uzyskanie frakcji, które mogą być bezpośrednio (tzn. bez konieczności prowadzenia czynności oczyszczających lub etapów wymiany buforu) użyte podczas dalszych analiz, wybranych spośród, ale nieograniczonych do MS, MALDI MS, ESI MS, SELDI MS, LC-MS(/MS), MALDI-TOF-MS(/MS). [0052] Na podstawie Przykładów omówionych poniżej oczywistym będzie, że media rozdzielające mogą być z łatwością przygotowane, są ogólnie nieszkodliwe i zapewniają stabilne i powtarzalne warunki elektroforetyczne, umożliwiające wydajny i czuły rozdział analitów w próbce, prowadzony metodami FFE. [0053] W znaczeniu tutaj użytym, termin "próbka" odnosi się do dowolnego preparatu, którego przynajmniej część jest poddana rozdziałowi metodą elektroforezy swobodnej i/lub analizom. Zazwyczaj, próbka obejmuje lub przypuszcza się, że obejmuje, przynajmniej jeden analit będący przedmiotem zainteresowania. [0054] "Strefę rozdziału" w znaczeniu tutaj użytym, należy rozumieć jako zlokalizowaną pomiędzy dwiema elektrodami aparatu odpowiedniego do przeprowadzenie rozdziału techniką PZ/1765/AR 11 EP 2 167 951 B1 elektroforezy swobodnej. Strefa rozdziału jest utworzona przez przynajmniej jedno medium rozdzielające. Zazwyczaj strefa rozdziału ograniczona będzie z każdej strony przez medium stabilizujące, medium ogniskujące, lub medium elektrodowe. W pewnych korzystnych realizacjach, medium rozdzielające formuje strefę medium ogniskującego, tzn. strefa rozdzielająca obejmuje medium ogniskujące. W dalszych korzystnych realizacjach, medium ogniskujące może nawet działać jako medium stabilizujące, tzn. strefa rozdziału może zawierać medium ogniskujące działające na sposób medium stabilizującego. [0055] Termin "medium ogniskujące" w znaczeniu tutaj użytym odnosi się do buforowego medium rozdzielającego obejmującego odpowiednio kwas dla anodowego medium ogniskującego lub zasadę dla katodowego medium ogniskującego, które tworzy skok przewodności i opcjonalnie, skok pH w zależności od sąsiedniego buforowego medium rozdzielającego. Strefa ogniskująca utworzona przez przynajmniej jedno buforowe medium rozdzielające ogranicza ruch analitów w stronę anody lub katody zasadniczo do zera ze względu na skok przewodności. Taki skok przewodności może być osiągnięty poprzez dodatek mocnego kwasu lub mocnej zasady do buforowego medium rozdzielającego, tworzącego strefę ogniskowania. Stężenie kwasu i zasady wybrane będzie w sposób umożliwiający znaczący wzrost przewodności przynajmniej jednego buforowego medium rozdzielającego, korzystnie w oparciu o współczynnik przynajmniej 2, korzystniej o przynajmniej 3, przynajmniej 5 lub nawet większy, w zależności od sąsiedniego buforowego medium rozdzielającego. Taki ostry wzrost przewodności elektrycznej medium jest użyteczny podczas akumulacji analitów o różnych pI, ponieważ zakres pH buforowych mediów rozdzielających na granicy dwóch mediów wykazujących różną wartość przewodności, ze względu ruchliwość analitów przemieszczających się do odpowiednio anody lub katody, jest obniżony zasadniczo do zera. Wytyczne dla "medium ogniskującego" opisane są w np. U.S. Patent 7,169,278, oraz później opublikowanym WO 2008/087218. Jak stanie się zrozumiałym, strefa ogniskowania jest zazwyczaj tworzona przez jedno medium ogniskujące. [0056] W znaczeniu niniejszego wniosku, terminy "rozdzielać" oraz "rozdział" oznaczają dowolne przestrzenne porcjowanie mieszaniny jednego lub więcej analitów, w oparciu o ich różne zachowanie w polu elektrycznym. Dlatego też, rozdział obejmuje, ale nie jest ograniczony do frakcjonowania jak również do specyficznego i selektywnego wzbogacania lub zubożania, zatężania i/lub izolacji określonych frakcji lub analitów zawartych w próbce. Jednakże, docenionym będzie fakt, że frakcjonowanie ogólnie rozumie się jako porcjowanie lub zubożanie pewnych analitów w obrębie próbki z pozostałości analitów, niezależnie od tego, czy rzeczone inne anality są dodatkowo rozdzielane podczas etapu elektroforetycznego. Oczywistym już jest, że nie istnieje oczywiste rozróżnienie pomiędzy terminami frakcjonowanie i rozdział, jednakże ostatni oznacza lepsze i bardziej szczegółowe porcjowanie przestrzenne różnych analitów w próbce. Tak więc, w dowolnym przypadku gdy wniosek odnosi się do terminów "rozdzielać" lub PZ/1765/AR 12 EP 2 167 951 B1 "rozdział", obejmują one przynajmniej jedno z powyższych znaczeń, obejmując rozdział, frakcjonowanie lub zubożanie. [0057] Proces rozdziału może być prowadzony głównie na sposób preparatywny tak, że określone frakcje są następnie zbierane lub na sposób jedynie analityczny, w którym analit będący przedmiotem zainteresowania lub jego obecność w określonej frakcji jest jedynie wykrywana przy użyciu odpowiedniej techniki, ale on sam nie jest zbierany np. w celu późniejszego wykorzystania. [0058] Zrozumiałym będzie, że większość procesów elektroforezy swobodnej, ze względów praktycznych dotychczasowo prowadzono w temperaturze od 0 ° do 40° (zazwyczaj w C C temperaturze pokojowej), jednakże nie są one ograniczone do takiego zakresu temperatur. Wybrana temperatura zasadniczo zależy od analitu lub analitów będących przedmiotem zainteresowania. Dlatego też termin "podwyższona temperatura" użyty w odniesieniu do lotnych składników buforowych według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku, odnosi się do temperatur wyższych od obserwowanych dla warunków roboczych, stosowanych podczas standardowego przebiegu FFE. [0059] Zazwyczaj anality, które mogą być rozdzielane dowolną metodą FFE według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie są ograniczone do biocząstek, biopolimerów i biocząsteczek takich jak białka, a zwłaszcza białka związane z błoną, integralne białka błonowe i białka lipofilowe, agregaty białkowe, kompleksy białkowe, peptydy, peptydy hydrofobowe, kompleksy białek z DNA, błony, fragmenty błon, lipidy, cukry i ich pochodne, wielocukry i ich pochodne, hormony, liposomy, cząstki wirusowe, przeciwciała, kompleksy przeciwciał, nanocząstki lub ich dowolne pochodne, jak również inne cząsteczki nieorganiczne lub organiczne, np. zmodyfikowane naładowane powierzchniowo polimery i cząstki takie jak składniki tworzyw sztucznych, żywice melaminowe, cząstki farb lateksowych, polistyreny, polimetylometakrylany, dekstrany, pochodne celulozy, polikwasy, leki farmaceutyczne, proleki, metabolity leków, substancje wybuchowe, toksyny, karcynogeny, trucizny, alergeny, czynniki infekcyjne lub dowolne ich kombinacje. [0060] Próbka poddawana rozdziałowi jest albo dodawana do medium rozdzielającego obecnego w obszarze rozdziału lub do komory separacyjnej pomiędzy anodą (anodami) i katodą (katodami) aparatu do FFE, lub korzystnie jest wprowadzana niezależnie do obszaru rozdziału aparatu, zazwyczaj poprzez przeznaczony do tego wlot zamieszczony w aparacie do FFE. Różne anality próbki są następnie rozdzielane w medium rozdzielającym pod wpływem wytworzonego pola elektrycznego i przemieszczane do końca wylotowego aparatu do FFE. Odpowiednie urządzenia do FFE są znane w dziedzinie i są sprzedawane np. pod nazwą BD? Free Flow Electrophoresis System (BD GmbH, Germany). Dodatkowo, odpowiednie urządzenia do FFE, które mogą być stosowane z mediami rozdzielającymi i stabilizującymi według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku opisano w kilku wnioskach patentowych, obejmujących US Pat. 5,275,706, US Pat. 6,328,868, wnioskach US 2004/050697, US PZ/1765/AR 13 EP 2 167 951 B1 2004/050698, US 2004/045826, oraz US 2004/026251 i pośrednich dokumentach WO 2008/053047 oraz WO 2008/025806. [0061] Osobom biegłym w dziedzinie znanych jest kilka metod prowadzenia FFE i metody te są rozważane w odniesieniu do korzystnych realizacji niniejszego wynalazku. Na przykład, próbka i medium rozdzielające, pod wpływem pola elektrycznego wytworzonego pomiędzy anodą i katodą aparatu do FFE, mogą być stale przemieszczane w stronę końca wylotowego ("metoda ciągła"). Metodę ciągłą w odniesieniu do FFE należy rozumieć jako oznaczającą, że etap iniekcji jak również etap rozdziału zachodzi na sposób ciągły i jednoczesny. Rozdział elektroforetyczny następuje podczas przepływu medium i analitów poprzez komorę elektroforetyczną, w której różne indywidua rozdzielane są według ich pI (IEF), gęstości ładunku netto (ZE) lub ruchliwości elektroforetycznej (ITP). Metoda ciągła FFE umożliwia ciągłą iniekcję i odzysk analitów, bez konieczności prowadzenia kilku niezależnych "przebiegów" (jeden przebieg jest rozumiany jako sekwencję obejmującą iniekcję próbki, rozdział i następujące zebranie próbki i/lub detekcja). Docenionym będzie, że metoda ciągła FFE obejmuje techniki rozdziału, w których przepływ objętościowy jest ograniczony, (ale nie jest zatrzymany) w porównaniu do wyjściowego poziomu przepływu objętościowego podczas gdy anality przemieszczają się przez obszar rozdziału pomiędzy elektrodami, w celu wydłużenia czasu rozdziału. W tym ostatnim przypadku jednakże, nie można już mówić o prawdziwej metodzie ciągłej ponieważ obniżenie przepływu objętościowego ma sens jedynie dla ograniczonej ilości próbki. [0062] W odniesieniu do zastosowań FFE, w dziedzinie opisano również inną metodę FFE, znaną jako tak zwana "metoda interwałowa". Na przykład proces nieciągłej (tzn. interwałowej) elektroforezy odwróconej jest przedstawiony w patencie U.S. 6,328,868. W patencie tym próbka i medium rozdzielające wprowadzane są do komory elektroforetycznej, a następnie rozdzielane z zastosowaniem metody elektroforetycznej, takiej jak elektroforeza strefowa, izotachoforeza lub ogniskowanie izoelektryczne i ostatecznie usuwane są z komory poprzez wyloty frakcjonujące. Korzystne realizacje patentu '868 opisują ruch medium rozdzielającego i próbki jako bezkierunkowy, postępujący od końca wsadowego do końca wylotowego komory. Kierunek ten, w odróżnieniu do tradycyjnej elektroforezy kapilarnej, jest zasługą orientacji wydłużonych elektrod. W statycznej metodzie interwałowej, opisanej np. w wynalazku '868, przyspieszenie próbki pomiędzy elektrodami, wywołane przez pompę lub inny element przemieszczający płyn, następuje jedynie w przypadku gdy pole elektryczne jest wyłączone lub przynajmniej napięcie jest zbyt niskie, by mogło wywołać migrację elektroforetyczną, tzn. wtedy gdy żadna część próbki nie poddana jest działaniu efektywnego pola elektrycznego. [0063] Innymi słowy, proces interwałowy charakteryzuje się fazą ładowania, podczas której próbka i media wprowadzane są do komory separacyjnej aparatu elektroforetycznego, po której następuje proces rozdziału, podczas którego przepływ objętościowy medium obejmującego PZ/1765/AR 14 EP 2 167 951 B1 próbkę jest zatrzymany w chwili przyłożenia pola elektrycznego w celu osiągnięcia rozdziału. Po rozdziale/ frakcjonowaniu próbki, pole elektryczne jest odłączane lub zmniejszane do nieefektywnego a przepływ objętościowy ponownie uruchamiany tak, że frakcjonowana próbka przemieszczana jest w kierunku wylotu, a następnie zbierana/ wykrywana w odpowiednim zbiorniku, np. płytce do mikromiareczkowania. [0064] Tak zwana metoda cykliczna lub cykliczno- interwałowa w odniesieniu do FFE, jak tutaj zastosowanej, opisana została w pośrednim dokumencie WO 2008/025806. Podsumowując, metoda cykliczno- interwałowa charakteryzuje się przynajmniej jednym a możliwie wielokrotnym odwróceniem kierunku przepływu objętościowego, podczas gdy próbka utrzymywana jest w polu elektroforetycznym pomiędzy wydłużonymi elektrodami. W przeciwieństwie do statycznej metody interwałowej, próbka pozostaje w ciągłym ruchu, co umożliwia uzyskanie pola o większej sile, a tym samym lepszego (lub szybszego) rozdziału. Dodatkowo, poprzez odwracanie przepływu objętościowego próbki pomiędzy wydłużonymi elektrodami, czas przebywania analitu w polu elektrycznym może być znacząco wydłużony, co skutkuje wydłużonym czasem rozdziału i/lub wyższą wydajnością rozdziału oraz wyższą rozdzielczością. Odwrócenie przepływu objętościowego w dowolnym równoległym kierunku wydłużonych elektrod (określane jako cykl) może być powtarzane tak często, jak jest to koniecznym w określonej sytuacji, jednakże, względy praktyczne jak również chęć przeprowadzenia rozdziału w krótkim czasie zazwyczaj będzie ograniczać liczbę cykli prowadzonych podczas tej metody. [0065] Zazwyczaj czas rozdziału (czas przepływu analitu w medium), podczas którego przyłożone jest pole elektryczne, mieści się w zakresie od kilku minut do około godziny na jeden przebieg rozdziału FFE, jednakże w pewnych warunkach dłuższy proces rozdziału również może być możliwy. Czas przepływu analitów próbki będzie zależeć od szybkości przepływu objętości medium rozdzielającego przemieszczającego się w aparacie do FFE i zazwyczaj wynosi przynajmniej 10 minut, w szczególności gdy media rozdzielające stosowane są wraz z mediami stabilizującymi według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku. W dowolnym wypadku, media rozdzielające tutaj opisane, mogą w pewnych warunkach pozwalać na wydajny rozdział/ frakcjonowanie analitów nawet w czasie krótszym niż 10 minut, a nawet jeszcze krótszym niż 7 lub 5 minut. Ogólnie, procesy rozdziału prowadzone metodą ZE będą zazwyczaj krótsze niż te prowadzone metodą IEF, szczególnie gdy prowadzone będą metodą cyklicznointerwałową, w której czas przepływu zwykle może być wydłużony na tyle, na ile jest to wymaganym, zapewniając tym samym wystarczająco stałe warunki w obszarze rozdziału podczas procesu separacji. [0066] Po uzyskaniu pożądanego rozdziału lub frakcjonowania analitów w próbce, pole elektryczne jest zazwyczaj odłączane a rozdzielone/ frakcjonowane anality będące przedmiotem zainteresowania są następnie albo pobierane, zazwyczaj w odpowiedniej liczbie frakcji, z aparatu do FFE (zastosowania preparatywne), lub przynajmniej wykrywane odpowiednimi metodami (zastosowania analityczne) w odpowiednich zbiornikach, np. w PZ/1765/AR 15 EP 2 167 951 B1 płytkach do mikromiareczkowania. Jak jest to już oczywistym, szczególnie w przypadku zastosowań preparatywnych (które w kontekście niniejszego wynalazku oznaczają zastosowania obejmujące następujące później zastosowania analityczne wykorzystujące MS, podczas których wymagana jest obecność analitu/ analitów), zaletą rozdziału według niniejszego wynalazku jest fakt, że zebrane próbki mogą być w wygodny i szybki sposób przygotowane do kolejnych analiz. Lotne Media Rozdzielające do FFE [0067] Lotne media rozdzielające do FFE stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem występują zazwyczaj w wodnych roztworach. Oczywiście, media tutaj opisane mogą również występować w postaci zatężonych roztworów i być rozcieńczane do odpowiedniego stężenia, lub nawet w postaci suchej (np. krystalicznej, amorficznej lub nawet zliofilizowanej) obejmującej różne składniki medium w zawarte pojedynczym opakowaniu lub dystrybuowane w kilku opakowaniach (np. w formie zestawu). Suche składniki mogą być następnie rozpuszczane w wodzie, tuż przed zastosowaniem podczas FFE. [0068] Lotne media rozdzielające do FFE stosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem należy rozumieć jako występujące w kompozycji gotowej do użycia, korzystnie wodnej kompozycji, zawierającej układ buforów obejmujący przynajmniej jeden kwas buforowy i przynajmniej jedną zasadę buforową, w którym wszystkie składniki buforowe są lotne. Pożądanym jest aby lotne medium rozdzielające składało się jedynie z lotnych składników buforowych i wody, tzn. medium nie zawiera dodatkowych mocnych kwasów i zasad i/lub kwasów i zasad buforowych, które nie są lotnymi. Opcjonalnie, przynajmniej jeden ze składników buforowych może służyć jako (lotna) matryca podczas spektrometrii mas, szczególnie podczas zastosowań MALDI. [0069] Termin "lotny" użyty w odniesieniu do układu buforów niniejszego wynalazku należy rozumieć jako odnoszący się do zdolności składników buforowych (tzn. kwasów buforowych i zasad buforowych) do ich całkowitego usunięcia z wodnej próbki w warunkach roboczych spektrometrii mas MALDI, tzn. składniki buforowe mogą być odparowane nie pozostawiając żadnych szczątkowych składników (np. soli), tzn. bezszczątkowo. W przeciwieństwie, termin "nielotne" w znaczeniu tutaj użytym odnosi się do składników buforowych, które nie mogą być usunięte bezszczątkowo, tzn. przynajmniej jeden składnik układu buforów jest nielotny i nie może zostać odparowany w rzeczonych warunkach. [0070] W najszerszym rozumieniu, lotny składnik buforu według niniejszego wynalazku może być usunięty bezszczątkowo w warunkach roboczych spektroskopii mas MALDI, jednakże docenionym będzie, że lotny składnik buforowy musi być w znacznym stopniu "nielotny w warunkach roboczych FFE" (tzn. pod ciśnieniem atmosferycznym i w temperaturze mieszczącej się zazwyczaj w granicach 0 do 40 ° jak wyja śniono powyżej). C PZ/1765/AR 16 EP 2 167 951 B1 [0071] Termin "nielotny w warunkach roboczych FFE" oznacza lotność składnika buforu prowadzącą do obniżenia stężenia odpowiadającego składnika buforu w medium rozdzielającym mniejszego niż 5% w/v lub, korzystnie mniejszego niż 2% w/v, w warunkach roboczych i podczas trwania rozdziału metodą FFE. Najkorzystniej gdy obniżenie stężenia nie będzie obserwowane we wszystkich warunkach roboczych i podczas trwania rozdziału FFE. [0072] W takim znaczeniu, osoba biegła w dziedzinie będzie rozumiała, że analit (y), który jest (są) obecne w próbce obejmującej lotne składniki buforów będzie nielotny we wcześniej wspomnianych warunkach, tzn. analit (y) pozostaje (ą) zasadniczo niezmodyfikowany (np. poprzez fragmentację lub utlenienie) i pozostaje (ą) w roztworze lub w swoim (swoich) stanie stałych. W warunkach roboczych spektroskopii mas, analit (y) również będą lotne i jonizowalne (co jest wymaganym podczas detekcji techniką MS). [0073] Termin "bezszczątkowo" w znaczeniu niniejszego wynalazku należy rozumieć tak, że lotny składnik samoistnie całkowicie odparowuje, ale że pozostałości spowodowane np. zanieczyszczeniem użytych substancji, mogą być nielotne. Jednakże, osobom biegłym w dziedzinie wiadomym jest, że jedynie składniki wykazujące najwyższy dostępny stopień czystości powinny być używane w celach analitycznych, a zwłaszcza podczas analizy spektroskopii mas. [0074] Usunięcie rozpuszczalnika i składników buforowych na drodze "odparowania", w znaczeniu tutaj użytym, należy rozumieć jako odnoszące się do usunięcia z analitów będących przedmiotem zainteresowania na drodze przemiany składników w fazę gazową a następnie eliminację z fazy gazowej odpowiednimi metodami. Zatem, odparowanie, jak tutaj zdefiniowano, różni się od eliminacji składników buforowych prowadzonej technikami powszechnie znanymi jako wymiana buforów (czasem określanymi również jako "odsalanie"), obejmującymi chromatografię kolumnową, dializę lub metody filtracji odcinającej lub techniki znane jako ekstrakcja w fazie stałej lub precypitacja analitu. Alternatywnie, w pewnych zastosowaniach, nie objętych terminem odparowanie, składniki buforowe obecne w formie soli są zwyczajnie odmywane z wodą, jednakże postępowanie takie oczywiście prowadzi do niepożądanej utraty materiału próbki i, co więcej, nieilościowego usunięcia składników buforowych. Osoby biegłe w dziedzinie docenią, że lotne składniki buforowe jak tutaj zdefiniowane, przynajmniej ogólnie, podobnie mogą być usunięte na drodze wymiany buforów lub technik ekstrakcji w fazie stałej, jednakże postępowanie takie oczywiście zaniedba istotną zaletę wykazywaną przez lotne bufory (i nie ma sensu w świetle potencjalnych problemów związanych z technikami wymiany buforów, np. skomplikowane procedury i niski odzysk próbki). [0075] Odpowiednie przykładowe techniki usuwania rozpuszczalnika i lotnych składników buforowych z próbki zebranej podczas etapu rozdziału FFE na drodze odparowania obejmują, ale nie są ograniczone do, wirowania próżniowego wykorzystującego odpowiednie urządzenia takie jak wyparka próżniowa, wirówka próżniowa znana na przykład pod nazwą SpeedVac?, do PZ/1765/AR 17 EP 2 167 951 B1 liofilizacji lub (delikatnego) ogrzewania wodnej próbki. Inne możliwości odparowania rozpuszczalnika i składników buforowych obejmują odparowanie w warunkach obniżonego ciśnienia, np. zastosowanie próżni do próbki umieszczonej na płytce docelowej używanej podczas analiz spektroskopii mas. Osoby biegłe w dziedzinie docenią, że większość metod spektroskopii mas pracuje w warunkach próżniowych (na przykład próżniowa MALDI) więc lotne składniki buforowe są w wygodny sposób usunięte po wprowadzeniu próbki do urządzenia MS, ale przed jonizacją. [0076] Korzystnie, lotne składniki buforowe są usuwalne w warunkach obniżonego ciśnienia i/lub podwyższonej temperatury. Ponadto, lotne składniki buforowe mogą być nawet odparowane nawet w temperaturze otoczenia i w warunkach ciśnienia atmosferycznego, zwłaszcza jeśli próbka zawierająca lotny bufor występuje w małej objętości (np. do analiz spektrometrii mas). Jednakże, w większości przypadków przynajmniej część roztworu buforu nie odparuje w takich warunkach lub lotne składniki buforowe mogą być usunięte w warunkach ostrzejszych (np. w próżni i/lub wysokich temperaturach, opcjonalnie podczas napromieniowania, takiego jak w warunkach roboczych spektroskopii mas). [0077] W pewnych korzystnych realizacjach niniejszego wynalazku, media rozdzielające do FFE obejmują lotne składniki buforowe, w których przynajmniej jeden z lotnych składników buforowych może służyć jako (lotna) matryca do analiz spektroskopii mas, tzn. składnik może być usunięty jedynie w warunkach roboczych spektroskopii mas. [0078] Składnik matrycy w znaczeniu tutaj użytym może być płynem w temperaturze pokojowej lub opcjonalnie krystalicznym ciałem stałym, które jest rozpuszczalne w wodzie przynajmniej w stężeniu pozwalającym na utworzenie układu lotnego buforu odpowiedniego dla FFE. Lotna matryca jest matrycą "absorbującą światło". W znaczeniu tutaj użytym, termin "absorbująca światło" odnosi się do zdolności matrycy do absorpcji światła desorpcji, tak aby wspomagać desorpcję i jonizację analitu. Korzystna matryca wykazuje wysoki poziom sublimacji w warunkach spektroskopii mas i silnie absorbuje światło desorpcji (np. napromieniowanie laserem w temperaturze pokojowej i próżni). [0079] Mieszanina matrycy i analitu do zastosowań MALDI zazwyczaj obejmuje fizyczną mieszaninę matrycy ze związkiem poddawanym analizie. Mieszaniny matrycy i analitu stosowane jako próbki w analizach spektrometrii mas mogą oczywiście obejmować więcej niż jeden analit. Dodatkowo, mogą obejmować jeden lub więcej lotnych składników buforowych i/lub dalszych dodatków. Mieszanina matrycy i analitu może, lub może nie obejmować adduktów matrycy z cząsteczką. Jednakże, jeśli tworzą się addukty, będą one zazwyczaj jedynie słabo zasocjowane w sposób umożliwiający ich łatwą dysocjację pod wpływem napromieniowania, desorpcji i jonizacji. [0080] Pod warunkiem, że składnik spełnia wymagania lotności tutaj stawiane, kwas buforowy oznacza dowolny związek chemiczny posiadający przynajmniej jedno ugrupowanie kwasowe, tzn. związek musi być zdolnym do oddania protonu podczas reakcji (kwas Bronsted'a- PZ/1765/AR 18 EP 2 167 951 B1 Lowry'ego). Podobnie, zasada buforowa oznacza związek chemiczny posiadający przynajmniej jedną grupę zasadową, tzn. związek musi być zdolnym do przyjęcia protonu podczas reakcji (zasada Bronsted'a-Lowry'ego). [0081] W dziedzinie wiadomym jest, że pKa związku determinuje jaka część grupy kwasowej jest zdeprotonowana i jaka posiada wciąż przyłączony atom wodoru w danym pH, w warunkach równowagi. Na przykład, w przypadku kwasów z jedną grupą kwasową 50% cząsteczek jest zdeprotonowanych (a tym samym zwiększony jest ładunek ujemny związku) gdy pH wodnego roztworu jest równe pKa tego związku. Kiedy pKa jest o jednostkę wyższe niż pH roztworu, jedynie 10% cząsteczek będzie zdeprotonowanych, podczas gdy 90% będzie zdeprotonowanych w pKa o jednostkę niższym od pH. [0082] Przynajmniej niewielka część kwasu buforowego stosowanego w medium rozdzielającym powinna być zdeprotonowana i niewielka część zasady buforowej powinna być uprotonowana w danym pH lub zakresie pH, w celu zapewnienia wystarczającej liczby naładowanych indywiduów w roztworze koniecznym dla uzyskania odpowiedniej przewodności elektrycznej w medium rozdzielającym. [0083] Zasada buforowa podobnie powinna charakteryzować się zasadowością (dla wygody porównania wyrażonej jako wartość pKa (tzn. kwasowość) odpowiadającego kwasu) której wynikiem, w danym pH, będzie uprotonowanie pewnej części cząsteczek oraz obecność kolejnej części cząsteczek, które nadal nie będą posiadały przyłączonego protonu. [0084] Innymi słowy, osoba biegła w dziedzinie rozumieć będzie, że wartość pKa (wskazująca na "siłę" kwasu lub zasady) kwasów buforowych i zasad buforowych, w idealnym przypadku powinna być niezbyt różna od pH medium rozdzielającego. W znaczeniu tym, podkreśla się, że odniesienie do pH medium rozdzielającego, należy rozumieć jako odniesienie do pH wodnego roztworu obejmującego wszystkie składniki przed przyłożeniem pola elektrycznego. Takie pH może być łatwo wyznaczone, np. poprzez konwencjonalne pH metry, przed wprowadzeniem medium do obszaru rozdziału w aparacie elektroforetycznym. W zależności od składników medium rozdzielającego i stabilizującego, przyłożenie pola elektrycznego prowadzić będzie do utworzenia gradientu pH w medium rozdzielającym, wskutek czego medium rozdzielające nie będzie już utrzymywało jednorodnego pH w całym obszarze rozdziału. Dlatego też, jeżeli inaczej nie wskazano, dowolne odniesienie do pH medium rozdzielającego w niniejszym wniosku zawsze odnosi się do pH przed wytworzeniem pola elektrycznego. [0085] Dodatkowo, ponieważ składniki buforowe muszą być lotne, istotnym jest taki wybór kwasu buforowego i zasady buforowej aby równica ich pKa nie była zbyt duża, ponieważ w przeciwnym wypadku składniki będą zjonizowane co ograniczy lub uniemożliwi ich lotność. Innymi słowy, różnica pKa pomiędzy kwasem buforowym i zasadą buforową nie powinna przekraczać 4 jednostek pH. PZ/1765/AR 19 EP 2 167 951 B1 [0086] Osoby biegłe w dziedzinie będą potrafić obliczyć pH roztworu w przypadku, gdy znane są wartości pKa oraz stężenia kwasów i zasad buforowych w roztworze (np. poprzez zastosowanie równania Henderson'a-Hasselbalch'a). Na przykład, w wyniku zmieszania równomolowej ilości wodnego roztworu jednego kwasu o pKa 8.0 i roztworu jednej zasady o pKa równym 6.0 otrzyma się roztwór o pH wynoszącym około 7.0 (pKa[kwas]+pKa[zasada]/2). [0087] Ogólnie, lotne kwasy buforowe i zasady buforowe wybrano tak, aby pH medium rozdzielającego mieściło się w zakresie od około 2 do 12, jednakże korzystnie gdy, pH będzie się mieściło w zakresie od 3 do 11. Ponieważ typowe problemy podczas rozdziału dotyczyć będą próbek pochodzenia biologicznego, korzystne wartości pH medium rozdzielającego ( zarówno stałe pH jak i końcowe wartości gradientu pH) będą często zawierać się w zakresie pomiędzy pH równym 4 a 10, a nawet pomiędzy pH 5 a 9, jednakże oczywistym jest, że pH medium rozdzielającego będzie zależeć od konkretnych problemów związanych z rozdziałem i natury analitów. [0088] Jako ogólną zasadę można przyjąć, że dla dużych zakresów pH, zazwyczaj koniecznych jest więcej niż jeden kwas buforowy i zasada buforowa, w celu zapewnienia wystarczającej pojemności buforowej i wydajności elektroforetycznej w całym zakresie pH, podczas gdy odpowiednie media rozdzielające wykazujące stałe pH lub niski gradient pH mogą być zaprojektowane w oparciu o jeden kwas buforowy i jedną zasadę buforową. Podczas gdy lotne media rozdzielające mogą obejmować więcej niż jeden kwas buforowy i więcej niż jedną zasadę buforową, pożądanym jest utrzymywanie liczby składników na jak najniższym, możliwym poziomie, zwłaszcza, że dodatkowe składniki buforujące również muszą być lotne. Dodatkowo, koszta związane ze zwiększoną liczbą różnych indywiduów obecnych w obszarze rozdziału, skutkującą bardziej złożoną mieszaniną rozdziałową, pogłębiają zalety stosowania binarnych układów buforowych. [0089] Zgodnie z tym, lotne media rozdzielające do FFE mogą zawierać wodny binarny układ lotnych buforów obejmujący wyłącznie jeden lotny kwas buforowy i jedną lotną zasadę buforową, szczególnie gdy rozdział może być prowadzony poprzez utworzenie raczej poziomego profilu pH w obszarze rozdziału aparatu do FFE. [0090] Lotne media rozdzielające do FFE utworzą gradient pH w obszarze rozdziału pomiędzy anodą i katodą aparatu do FFE. Gradient może występować zarówno jako gradient zasadniczo liniowy lub w formie gradientu nieliniowego, np. skokowy "gradient" pH, w którym różnica pH pomiędzy najniższym pH i najwyższym pH w medium rozdzielającym podczas elektroforezy generalnie wynosi więcej niż 0.2 jednostki pH i mniej niż 5 jednostek pH. Korzystnie, gdy różnica pH mieści się w zakresie od 0.5 do 4 jednostek pH. [0091] W przypadkach gdy utworzenie podczas elektroforezy gradientu pH o zakresie od 0.2 do 5 jednostek pH jest wymaganym lub pożądanym (tzn. dla rozdziałów FFE prowadzonych metodą IEF), zrozumiałym będzie, że lotne medium rozdzielające do FFE będzie typowo składać się z kilku odrębnych frakcji (odrębne media rozdzielające) obejmujących zróżnicowane PZ/1765/AR 20 EP 2 167 951 B1 stężenia kwasów buforowych i zasad buforowych w medium w celu ustalenia inicjacyjnego gradientu pH. Innymi słowy, medium rozdzielające może obejmować mnogość frakcji mediów rozdzielających wykazujących różną wartość pH w celu wytworzenia gradientu pH pomiędzy anodą i katodą aparatu FFE. Zazwyczaj liczba oddzielnych frakcji (mediów rozdzielających) wynosić będzie przynajmniej 2, a ze względów praktycznych, rzadko przekraczać będzie liczbę 15 frakcji. Dla określonych korzystnych realizacji liczba frakcji posiadających różne stężenia kwasu i zasady lub stosunki stężeń mieści się w zakresie 2 do 15, 3 do 12, 4 do 9 lub nawet 5 do 8 frakcji. Wartość pH każdej frakcji może być zasadniczo taka sama lub może różnić się od każdej innej frakcji. Alternatywnie, kilka frakcji może wykazywać zasadniczo takie samo pH, ale może wykazywać różne pH w stosunku do jeszcze innych frakcji, a tym samym tworzyć skoki pH w obrębie medium rozdzielającego. [0092] Podczas gdy liczba subfrakcji nie jest technicznie ograniczona, w praktyce liczba ta będzie determinowana lub przynajmniej regulowana przez liczbę różnych wlotów dla medium, zamieszczonych w aparacie do elektroforezy, stosowanym podczas rozdziału. Media rozdzielające mogą tworzyć gradient skokowy, który może obejmować skoki wzrastającego i obniżającego się pH w zróżnicowanej kolejności. Alternatywnie, media rozdzielające mogą tworzyć gradient, w którym pH frakcji medium rozdzielającego wprowadzonego do aparatu do FFE wzrasta od anody w kierunku katody aparatu do FFE, tworząc gradient pH o niskiej wartości pH przy anodzie i wysokiej wartości pH przy katodzie. Pomimo, że lotne media rozdzielające są szczególnie użyteczne podczas swobodnej IEF, ich zastosowanie nie jest ściśle ograniczone do swobodnej IEF. Jednakże, korzystnie gdy, lotne media rozdzielające stosowane są podczas swobodnej IEF. [0093] W innych korzystnych realizacjach, lotne medium rozdzielające będzie wykazywać zasadniczo stałe pH pomiędzy katodą i anodą aparatu do FFE, przynajmniej na początku etapu rozdziału FFE i z tego względu będzie szczególnie użytecznym w metodach rozdziału FFE prowadzonych np. metodą elektroforezy obszarowej (FF-ZE). [0094] Dla lotnych mediów rozdzielających do FFE, względne stężenia kwasów buforowych i zasad buforowych powinny mieścić się w pewnym stosunku. A zatem, stosunek pomiędzy stężeniem wszystkich kwasów buforowych i zasad buforowych powinien mieścić się typowo pomiędzy około 9:1 i około 1:9. W korzystnych realizacjach, stosunek ten jest nawet niższy i mieści się pomiędzy 4:1 a 1:4, lub po między 3:1 i 1:3, a jeszcze lepiej pomiędzy 2:1 i 1:2. Szczególnie w przypadku zastosowań, w których pożądanym jest stałe pH, korzystnym jest aby (tzn. w zastosowaniach ZE), stosunek ten wynosił około 1, tzn. stężenie kwasu buforowego jest zasadniczo równe stężeniu zasady buforowej. [0095] Niezależnie od powyższego, osoba biegła w dziedzinie rozumieć będzie, że właściwe stężenie określonego kwasu lub zasady może zależeć od kilku czynników obejmujących naturę próbki, obecność dodatkowych substancji (patrz poniżej) i że pożądane pH medium rozdzielającego może być odpowiednio dostosowane. Jednakże, wydajność buforowa i PZ/1765/AR 21 EP 2 167 951 B1 elektroforetyczna medium w pewnym momencie będzie utracona, w przypadku gdy wybrane stężenie jednego ze składników (albo kwasu buforowego albo zasady buforowej) będzie za niskie, tzn. będzie wykraczać poza wymienione powyżej stosunki. [0096] W odniesieniu do wyboru absolutnych stężeń składników buforowych, wymaganych w celu uzyskania satysfakcjonującego rozdziału, osoba biegła w dziedzinie będzie świadoma, że nie istnieje kategoryczna reguła, jednakże powinno być ogólnie zrozumiałym, że stężenie powinno być na tyle wysokie, by zapewnić wystarczające przewodnictwo i pojemność buforową, ale jednocześnie tak niskie jak to możliwe, szczególnie w przypadku, gdy próbka zebrana podczas etapu rozdziału elektroforetycznego ma być poddana późniejszej analizie, takiej jak MS, w której składniki buforu powinny zostać z próbki usunięte. Anality wykazujące wysoką (powierzchniową) gęstość ładunku (np. białka lub peptydy) będą generalnie wymagały wyższych stężeń składników buforowych niż anality o względnie niskiej gęstości ładunku (np. komórki lub organella komórkowe). Podobnie, dla zastosowań w których medium rozdzielające wykazuje stałe pH (tzn. poziomy profil pH), w celu uzyskania pożądanej pojemności buforowej, wymagane jest niższe stężenie składników buforowych, podczas gdy dla gradientów pH (np. w zastosowaniach IEF) stężenie powinno być wyższe, szczególnie w przypadkach stosowania wyłącznie jednego lub dwóch kwasów/zasad buforowych, ponieważ różnica pomiędzy pH i pKa składnika buforowego może być większa, prowadząc do słabszej jonizacji (odpowiednio uprotonowanie lub deprotonacja)składnika. [0097] Pamiętając o powyższych zasadach, rozważa się stosowanie lotnych mediów rozdzielających obejmujących lotne kwasy buforowe i lotne zasady buforowe w stężeniach przynajmniej około 1 mM do około 200 mM, korzystniej gdy stężenia lotnych składników buforowych są dobierane niezależnie z zakresu od 2mM do 100 mM, a najkorzystniej z 5 mM do około 50 mM. W odniesieniu do stężenia buforowych odpowiednio kwasów i zasad, docenionym będzie, że przedstawione liczby odnoszą się do całkowitego stężenia dowolnego (jeśli występuje więcej niż jeden) kwasu buforowego/ zasady buforowej w danym medium rozdzielającym (jak również stabilizującym). [0098] Odpowiednie lotne kwasy buforowe, które mogą być stosowane podczas rozdziału analitów, zwłaszcza analitów biologicznego pochodzenia, obejmują, ale nie są ograniczone do kwasu mrówkowego, kwasu octowego, kwasu pikolinowego, diacetyloaceton, o-, m- i p- krezol, o-, m- and p-chlorofenole, hydroksypirydyny, fluorowane alkohole i fluorowane związki karbonylowe, takie jak trifluoroetanol, tetrafluoropropanol, tetrafluoroaceton i podobne. Zrozumiałym będzie, że powyższa lista nie jest wyczerpującą lub w jakikolwiek sposób ograniczająca, jako że osoba biegła w dziedzinie będzie zdolna do wskazania licznych możliwych kwasów buforowych posiadających odpowiednie pKa i właściwości lotne, wymagane w celu ich włączenia do medium rozdzielającego. [0099] Podobnie, odpowiednie lotne zasady buforowe obejmują, ale nie są ograniczone do buforowych składników TRIS, różnych hydroksypirydyn, amidu kwasu izonikotynowego, PZ/1765/AR różnych karbinoli pirydynowych, 22 dietanoloaminy, benzyloaminy, EP 2 167 951 B1 pirydynoetanolu, oraz dimetyloaminopropionitrylu. Ponownie, lista nie jest wyczerpującą lub ograniczającą, jako że osoba biegła w dziedzinie będzie zdolna do wskazania innych możliwych zasad buforowych posiadających odpowiednie pKa i właściwości lotne wymagane w celu ich włączenia do medium rozdzielającego. [0100] Media rozdzielające mogą obejmować wyłącznie jeden kwas buforowy i jedną zasadę buforową, na przykład, kwas octowy i TRIS, kwas pikolinowy i dietanoloaminę, kwas octowy i dimetyloaminopropionitryl, kwas pikolinowy i 2-pirydynoetanol, benzyloaminę i 2- hydroksypirydynę, tri-n-propyloaminę i trifluoroetanol, jak opisano bardziej szczegółowo w sekcji Przykłady. [0101] Osoba biegła w dziedzinie doceni, że idealne medium rozdzielające obejmuje jedynie wodne układy lotnych buforów, jednakże szczególnie rozważanym tutaj jest, że medium rozdzielające może również obejmować dodatkowe składniki w celu np. utrzymania integralności lub funkcji analitu. Oczywiście takie substancje dodatkowe mogą być dodane jedynie w przypadku absolutnej konieczności i tylko w najniższym możliwym stężeniu, wymaganym w celu osiągnięcia zamierzonego efektu, zwłaszcza w przypadku, gdy wiadomo, że są niekompatybilne z następującą po rozdziale analizą prowadzoną techniką MS. [0102] Korzystnie gdy możliwe substancje dodatkowe są wybrane spośród, ale nie są ograniczone do innych kwasów i/lub zasad, "istotnych" mono- i biwalentnych anionów i kationów, substancji zwiększających lepkość, czynników poprawiających rozpuszczalność, ligandów powinowactwa, czynników protekcyjnych lub czynników redukujących. Istotne mono- i biwalentne aniony i kationy w rozumieniu niniejszego wniosku to jony, które mogą być konieczne w celu utrzymania strukturalnej i/lub funkcjonalnej integralności analitów w próbce. Jony takie jak jony wapnia, jony magnezu, jony cynku lub jony żelaza mogą być obecne w bardzo niskich stężeniach. Substancje zwiększające lepkość i czynniki poprawiające rozpuszczalność (takie jak hydroksypropylo-metyloceluloza, pochodne hydrofilowych polimerów obejmujące glikol polietylenowy lub polialkohole, węglowodany (takie jak sacharoza, dekstryny, cyklodekstryny i lektyny) również mogą być obecne w próbce, jak również niskie stężenia ligandów powinowactwa (takie jak EDTA lub EGTA) lub czynniki protekcyjne zapobiegające zanieczyszczeniu próbki przez mikroorganizmy (np. azydek). W pewnych wypadkach, koniecznym może być dodatek czynnika redukującego w celu uniknięcia utlenienia analitu w roztworze. Odpowiedni czynnik redukujący, który może być dodany do próbki i/lub medium rozdzielającego obejmuje merkaptoetanol, ditiotreitol (DTT), kwas askorbinowy i podobne. Lotne bufory w kombinacji z rozszczepialnymi surfaktantami [0103] Jedna z korzystnych realizacji niniejszego wynalazku odnosi się do zastosowania mediów obejmujących lotne składniki buforowe w kombinacji z kompatybilnymi z MS PZ/1765/AR 23 EP 2 167 951 B1 surfaktantami obojnaczymi lub niejonowymi jak opisano poniżej. Obojnacza lub niejonowa natura tych surfaktantów czyni je odpowiednimi dla elektroforezy swobodnej. [0104] Terminy "surfaktant", "detergent", "czynnik zwilżający" oraz "emulsyfikator" mogą być tutaj stosowane zamiennie i odnoszą się do cząsteczek lub kompozycji zdolnych do obniżania napięcia powierzchniowego wody. Na przykład, surfaktant sprzyja utrzymaniu hydrofobowych peptydów i białek w roztworach wodnych. [0105] Termin "obojnacze lub niejonowe surfaktanty kompatybilne z MS" w znaczeniu tutaj użytym oznacza surfaktanty kompatybilne z MS, które mogą być jonami obojnaczymi lub cząsteczkami niejonowymi. Surfaktanty obojnacze lub niejonowe mogą być w sumie naładowane pozytywnie lub negatywnie, w zależności od pH określonego obszaru pomiędzy dwiema elektrodami, ale niejonowy surfaktant kompatybilny z MS w dowolnym wypadku pozostaje nienaładowany w zakresie pH, w którym zamieszczono analit, będący przedmiotem zainteresowania, wydzielany z aparatu odpowiedniego dla elektroforezy swobodnej. Ponadto, należy rozumieć, że punkt izoelektryczny obojnaczego surfaktantu kompatybilnego z MS w zastosowaniu według niniejszego wynalazku znajduje się zazwyczaj w zakresie pH strefy rozdziału. Termin "surfaktant kompatybilny z MS" i "surfaktant obojnaczy lub niejonowy kompatybilny z MS", w znaczeniu tutaj użytym, może być stosowany zamiennie, ponieważ surfaktant odpowiedni dla FFE, w zakresie pH strefy rozdziału, musi występować w postaci jonu obojnaczego bądź cząsteczki niejonowej. [0106] Termin "obojnaczy", w znaczeniu tutaj użytym, w odniesieniu do surfaktantów, odnosi się do związku chemicznego, który jest elektrycznie obojętny, ale niesie formalne ładunki pozytywne i negatywne zlokalizowane na różnych atomach. Przykładami, których nie należy rozumieć jako ograniczające, są np. pochodne betainy, korzystnie sulfobetainy takie jak 3(trimetyloamonio)-propylosulfonian lub fosfobetainy. Zazwyczaj punkt izoelektryczny surfaktantów obojnaczych, w znaczeniu niniejszego wynalazku, mieści się w zakresie pH strefy rozdziału. [0107] Termin "niejonowy" jak tutaj użyty w odniesieniu do surfaktantów odnosi się do związków dipolarnych. Przykłady obejmują, ale nie są ograniczone do pochodnych węglowodanów. Zazwyczaj niejonowy surfaktant nie jest obdarzony ładunkiem w zakresie pH strefy rozdziału. Jednakże, w zależności od zakresu pH rzeczonej strefy, możliwym jest, że w określonym pH spoza zakresu pH wykorzystywanego podczas rozdziału analitu będącego przedmiotem zainteresowania, związek niejonowy pomimo to zostanie obdarzony ładunkiem. [0108] Termin "kompatybilny z MS" w znaczeniu tutaj użytym oznacza surfaktanty, które mogą być stosowane podczas analiz MS. Termin "surfaktanty kompatybilne z MS" obejmuje surfaktanty, które są samoistnie odpowiednie dla analiz MS, tzn. nie wymagają modyfikacji, oraz obejmuje "rozszczepialne" surfaktanty, które nie są kompatybilne z MS w stanie nierozszczepionym, ale które mogą ulec rozszczepieniu przynajmniej w jednej pozycji do przynajmniej dwóch ugrupowań. Rzeczone ugrupowania mogą być kompatybilne z MS lub PZ/1765/AR 24 EP 2 167 951 B1 niekompatybilne z MS. Ugrupowanie niekompatybilne z MS surfaktantu rozszczepialnego, jak tutaj opisany, może być łatwo usunięte poprzez np. wirowanie, filtrację lub odparowanie, podczas gdy ugrupowanie kompatybilne z MS może pozostać w roztworze i być obecne podczas późniejszej analizy lub w pewnych warunkach podobnie może być usunięte poprzez wirowanie, filtrację lub odparowanie. W pewnych korzystnych realizacjach, więcej niż jedno z otrzymanych ugrupowań jest kompatybilne z MS. Takie rozszczepialne surfaktanty kompatybilne z MS są odpowiednie dla np. metod obejmujących etap trawienia białka. Białko może być nierozpuszczalne w wodzie, ale jego fragmenty lub część fragmentów otrzymane podczas trawienia mogą być rozpuszczalne i mogą być analizowane z zastosowaniem np. MS. [0109] Nieograniczającym przykładem korzyści dostarczanych przez rozszczepialne surfaktanty jest, opisana tutaj, czułość detekcji analitu metodą spektrometrii mass w obecności odpowiedniego surfaktantu, która jest znacznie wyższa niż czułość detekcji analitu metodą spektrometrii mas prowadzonej w obecności np. SDS. W większości przypadków widmo masowe próbki zawierającej SDS nie wykazuje sygnału, lub wykazuje jedynie słabe sygnały analitu traktowanego SDS lub produktów rozpadu rzeczonego analitu. W przeciwieństwie, próbka obejmująca rzeczony analit, gdy poddana analizie metodą spektrometrii mas w obecności surfaktantu kompatybilnego z MS zamiast SDS-u, wykazuje sygnały związane z analitem i produktami rozpadu rzeczonego analitu. [0110] Zgodnie z tym, surfaktant kompatybilny z MS można rozumieć jako surfaktant, którego obecność w próbce obejmującej rozpuszczalny analit kontrolny o określonym stężeniu (próbka S), poddanej analizie spektrometrii mas umożliwia otrzymanie widma masowego przedstawiającego zasadniczo przynajmniej takie same piki masowe (o podobnej a nawet wyższej intensywności) w porównaniu do widma masowego próbki zawierającej rzeczony analit kontrolny w takim samym określonym stężeniu, ale nie zawierającej surfaktantu (próbka C (kontrolna)), tzn. widma masowe są zasadniczo takie same. W niektórych korzystnych realizacjach, widmo MS otrzymane dla próbki S ze względu na produkty rozpadu analitu kontrolnego, może nawet obejmować więcej pików masowych, w porównaniu do widma MS otrzymanego dla próbki C, np. w przypadku gdy analit kontrolny jest przed analizą spektrometrii mas trawiony, a produkty rozpadu są hydrofobowe i precypitowane w próbce C przed analizą spektrometrii mas. [0111] Odpowiednia procedura identyfikacji surfaktantów kompatybilnych z MS jest na przykład opisana w WO 2006/047614. BSA, które jest powszechnie stosowane jako białko testowe, może być zastosowane jako nietraktowane białko a trawiona trypsyną ß-galaktozydaza (t-betagal) może być zastosowana jako przykładowa mieszanina peptydów. Fragmenty ßgalaktozydazy powstałe w wyniku trawienia trypsyną wykazują zakres rozpuszczalności związków od hydrofilowych po hydrofobowe. Ponadto, wiele innych substancji może również służyć jako anality kontrolne, jeśli tylko są na tyle rozpuszczalne w wodzie by możliwym było uzyskanie widma MS. PZ/1765/AR 25 EP 2 167 951 B1 [0112] Jako nieograniczający przykład, analiza MALDI-TOF ß-galaktozydazy próbki S może być porównana z analizą MALDI-TOF ekwiwalentnej próbki C. Supresja jonizacji w zakresie 9003700 m/z może być określona na drodze porównania dopasowań mas jonów zidentyfikowanych w próbkach S i C. Osoba biegła w dziedzinie będzie wiedziała jak przeprowadzić użyteczną analizę MALDI-TOF. [0113] Korzystnie gdy intensywność każdego z dopasowanych pików masowych próbki S jest nie mniejsza niż 25%, w porównaniu do intensywności identycznego piku masowego dla próbki C, korzystniej, gdy jest zasadniczo taka sama lub najbardziej korzystnie gdy jest nawet wyższa niż intensywność tego samego piku w próbce C. [0114] W odniesieniu do zaledwie słabo rozpuszczalnych lub nierozpuszczalnych analitów lub produktów trawienia (kontrolnego) analitu, korzystnym jest gdy intensywność piku masowego w widmie masowym próbki, obejmującej rzeczony zaledwie słabo rozpuszczalny lub nierozpuszczalny analit/ produkt trawienia i surfaktant kompatybilny z MS, jest przynajmniej 1, 1.5, 3 5, 10, 100 lub 1000 razy wyższa niż intensywność identycznego piku masowego w widmie masowym otrzymanym dla próbki w ogóle nie zawierającej surfaktantów. [0115] "Zasadniczo identyczne" w znaczeniu tutaj użytym oznacza, że przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, korzystnie przynajmniej 80%, korzystniej przynajmniej 90% i najkorzystniej około 100% piku masowego, pochodzącego od produktów rozpadu analitu kontrolnego próbki C jest również obecnych na widmie dla próbki S. Wyszukiwarki internetowe takie jak MASCOT? mogą być wykorzystane w celu porównania widma MS dla np. trawionej t-beta-gal lub BSA z teoretycznym widmem MS dla trawionej t-beta-gal lub teoretycznym widmem MS dla BSA. Zazwyczaj pod uwagę powinien być brany zakres od 900 do 2600 m/z. [0116] Innymi słowy, widmo masowe otrzymane w obecności surfaktantów obojnaczych lub niejonowych kompatybilnych z MS, według niniejszego wynalazku, obejmują przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, korzystnie przynajmniej 80%, korzystniej przynajmniej 90% i najkorzystniej około 100% piku masowego, pochodzącego od produktów rozpadu analitu kontrolnego próbki C. [0117] Różnica masy pomiędzy sygnałem masowym próbki C a identycznym sygnałem masowym próbki S może różnić się w granicach błędu pomiaru, w zależności od zastosowanej metody i oprzyrządowania. Dla osoby biegłej w dziedzinie zrozumiałym będzie jak wyznaczyć taki błąd pomiaru. Na przykład, dokładność pomiaru masy dokonywanego za pomocą spektrometru mas z pułapką jonową zazwyczaj wyznacza się pomiędzy 0.5 a 2.5 daltona, podczas gdy dokładność pomiaru masy z błędami mniejszymi niż 50 ppm lub nawet mniejszymi niż 25 ppm uzyskuje się poprzez pomiar sygnału masowego mieszczącego się w zakresie od około 900 do 3700 daltonów, wykonywanego za pomocą zastosowań MALDI-TOF. [0118] Niezależnie od kompatybilności surfaktantów niniejszego wynalazku, zrozumiałym będzie, że stężenie surfaktantu podczas elektroforezy swobodnej i późniejszej analizy techniką MS powinno być tak niskie jak jest to możliwym, korzystnie bliskie jego krytycznemu stężeniu PZ/1765/AR 26 EP 2 167 951 B1 micelizacji (CMC). Odpowiednie, znane w dziedzinie, metody określania CMC surfaktantu znane są osobom biegłym w dziedzinie. Ponadto, CMC dla wielu surfaktantów jest już znane. [0119] Surfaktanty kompatybilne z MS stosowane są zazwyczaj w stężeniach poniżej 100 mM. W zależności od surfaktantu, odpowiednimi mogą być stężenia poniżej 50 mM, poniżej 30 mM, poniżej 15, poniżej 5, poniżej 1 a nawet poniżej 0.1 mM. Na przykład ilość rozszczepialnego surfaktantu PPS w próbce poddanej elektroforezie swobodnej, w zastosowaniu według niniejszego wynalazku wynosiła 0.1% (w/v). Ilość taka odpowiada stężeniu mieszczącym się w granicach od 2 do 10 mM (w zależności od kombinacji łańcuchów alkilowych w PPS). [0120] Osoba biegła w dziedzinie z łatwością wytypuje surfaktant kompatybilny z MS, jak tutaj opisano, poprzez porównanie widm masowych próbki C oraz próbki S, z których każda zawiera analit kontrolny o określonym stężeniu. Metoda ta pozwala osobie biegłej w dziedzinie na stwierdzenie, czy surfaktant jest kompatybilny z MS czy nie. W szczególności, przewiduje się, że anality praktycznie nierozpuszczalne lub nierozpuszczalne w wodzie (bez surfaktantu), charakteryzowałyby się widmem masowym praktycznie nie możliwym do analizy w przypadku, gdy przygotowanie próbki nie obejmowałoby zastosowania surfaktantu. Dlatego też, rozdział analitu będącego przedmiotem zainteresowania, prowadzony techniką elektroforezy swobodnej w obecności surfaktantu kompatybilnego z MS zapewniałby próbki, które nadają się do identyfikacji i charakterystyki takich analitów w późniejszych analizach prowadzonych za pomocą spektrometrii mas. [0121] W niektórych korzystnych realizacjach, koniecznym może być dodatek surfaktantów w metodach według niniejszego wynalazku. W ostatnim wypadku najkorzystniej jest, gdy taki surfaktant jest surfaktantem obojnaczym lub niejonowym, kompatybilnym z MS. Zrozumiałym będzie, że obojnaczy lun niejonowy surfaktant kompatybilny z MS, jak tutaj opisano, może być zawarty w medium próbki, i/lub w medium rozdzielającym. Innymi słowy, metoda rozdziału analitów w próbce oparta o elektroforezę swobodną według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku, może obejmować zastosowanie przynajmniej jednego surfaktantu obojnaczego lub niejonowego, kompatybilnego z MS, gdzie rzeczony surfaktant obecny jest w medium próbki i/lub przynajmniej jednym medium rozdzielającym. Pomimo, że zrozumiałym będzie, że obecność jedynie jednego surfaktantu obojnaczego lub niejonowego, kompatybilnego z MS w medium próbki lub medium rozdzielającym jest korzystnym, dowolna kombinacja wielu surfaktantów obojnaczych lub niejonowych, kompatybilnych z MS zawartych w medium próbki i/lub medium rozdzielającym, jest możliwa. W przypadku gdy surfaktant lub surfaktanty muszą być zawarte w przynajmniej jednym medium według niniejszego wynalazku, zaletą byłoby, aby wszystkie surfaktanty były surfaktantami obojnaczymi lub niejonowymi, kompatybilnymi z MS. Osoba biegła w dziedzinie zrozumie, że każdy spośród surfaktantów może być obecny w medium próbki i/lub przynajmniej jednym medium rozdzielającym. [0122] Ponadto, surfaktant kompatybilny z MS, jak tutaj opisano, może być samoistnie kompatybilny z MS podczas rozdziału metodą elektroforezy swobodnej, lub może stać się PZ/1765/AR 27 EP 2 167 951 B1 kompatybilnym z MS w wyniku rozszczepienia surfaktantu. W ostatnim przypadku surfaktant kompatybilny z MS jest rozszczepialnym surfaktantem kompatybilnym z MS. Korzystnym może być, aby przynajmniej jeden obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS był rozszczepialny, jednakże obecne mogą być również inne obojnacze lub niejonowe surfaktanty kompatybilne z MS. Zaleta może być, gdy wszystkie surfaktanty kompatybilne z MS w obrębie medium próbki i/lub medium rozdzielającego są surfaktantami rozszczepialnymi. [0123] Terminy "rozszczepialny obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS", "rozszczepialny surfaktant kompatybilny z MS" lub "rozszczepialny surfaktant" są tutaj używane zamiennie i odnoszą się do surfaktantów, które, w określonych warunkach, mogą być rozszczepione do przynajmniej dwóch ugrupowań. W jednej z korzystnych realizacji, przynajmniej jedno z ugrupowań powstałych w wyniku rozszczepienia, jest kompatybilne z MS, jak zdefiniowano powyżej. Takie ugrupowanie kompatybilne z MS może podczas analizy spektrometrii mas być obecne lub nie być obecne, np. może zostać odparowane przez analizą MS. Ugrupowania niekompatybilne z MS ulegają po rozszczepieniu precypitacji lub mogą zostać odparowane przed analizą MS. [0124] Jak zostanie to wyjaśnione poniżej, zrozumiałym będzie, że podczas etapu rozszczepienia mogą powstać więcej niż dwa ugrupowania. Przykładowo, surfaktant kompatybilny z MS może zostać rozszczepiony na hydrofilową grupę główki, kompatybilną z MS i pozostać w roztworze oraz hydrofobowy ogon, niekompatybilny z MS, który z łatwością może zostać z próbki usunięty na drodze wirowania lub filtracji. Zgodnie z tym, metoda może obejmować zastosowanie przynajmniej jednego rozszczepialnego obojnaczego lub niejonowego surfaktantu kompatybilnego z MS, z którego powstaje przynajmniej jedno ugrupowanie, które, po rozszczepieniu, może zostać usunięte z próbki lub próbki frakcjonowanej na drodze filtracji, wirowania i/lub odparowania. [0125] Dowolny surfaktant posiadający wiązanie łączące ugrupowanie hydrofobowe (ogon) z ugrupowaniem hydrofilowym (grupa główki), które może być zerwane pod wpływem działania czynnika rozszczepiającego, w którym korzystnie analit, będący przedmiotem zainteresowania, jest zasadniczo stabilny i dla którego wszystkie otrzymane ugrupowania niekompatybilne mogą być z łatwością usunięte na drodze wirowania, filtracji lub odparowania, jest odpowiedni do zastosowania jako rozszczepialny surfaktant kompatybilny z MS. Wiązanie takie będzie określane jako wiązanie rozszczepialne. Korzystnie gdy takie wiązanie jest rozszczepiane w warunkach, w których analit będący przedmiotem zainteresowania jest zasadniczo stabilny. Analit zasadniczo stabilny w warunkach sprzyjających rozszczepieniu surfaktantu rozszczepialnego, należy rozumieć jako analit będący przedmiotem zainteresowania, którego przynajmniej około 80%, około 90%, korzystnie około 97%, korzystniej około 99% i najkorzystniej 100% ilości rzeczonego analitu, obecnego podczas etapu rozszczepienia, pozostaje niezmodyfikowane po etapie rozszczepienia, tzn. analit jest w przeważającej mierze, korzystnie gdy całkowicie, obojętny względem reakcji chemicznej zachodzącej w określonych PZ/1765/AR 28 EP 2 167 951 B1 warunkach podczas etapu rozszczepienia. Obojętny względem reakcji chemicznej, w znaczeniu tutaj użytym, oznacza, że żadne spośród wiązań kowalencyjnych obecnych w analicie, nie ulega zerwaniu lub nie zostaje utworzone podczas etapu rozszczepiania surfaktantu. [0126] "Czynnik rozszczepiający", w znaczeniu tutaj użytym, odnosi się do dowolnego instrumentu lub związku chemicznego lub mieszaniny związków chemicznych w dowolnej formie, odpowiednich do wybiórczego rozszczepienia wiązania w obrębie rozszczepialnego surfaktantu. Nieograniczającymi przykładami związków chemicznych odpowiednich dla wybiórczego rozszczepienia rozszczepialnego surfaktantu, byłyby kwasy lub zasady lub ich roztwory/mieszaniny selektywnie rozszczepiające labilne wiązanie kwasowe lub zasadowe występujące w rozszczepialnym surfaktancie. Ten i dalsze przykłady opisane są bardziej szczegółowo poniżej. Ponadto, termin "czynnik rozszczepiający" obejmuje instrumenty odpowiednie dla wybiórczego rozszczepienia wiązania występującego w rozszczepialnym surfaktancie. Takim instrumentem może być np. instrument emitujący, w celu rozszczepienia fotolabilnego, rozszczepialnego surfaktantu, światło o nieciągłej długości fali. [0127] Termin "roztwór rozszczepiający do rozszczepiania surfaktantu" w znaczeniu tutaj użytym odnosi się do dowolnego roztworu zawierającego czynnik lub kompozycję odpowiednią dla selektywnego w rozszczepienia obrębie jednego lub więcej wiązań pomiędzy linkerem a ugrupowaniem rozszczepialnego surfaktantu, skutkującego wytworzeniem przynajmniej dwóch ugrupowań, spośród których ugrupowania, które nie są kompatybilne z MS, mogą być łatwo usunięte z próbki na drodze wirowania, filtracji lub odparowania, a ugrupowania kompatybilne z MS mogą pozostać w roztworze lub mogą podobnie być usunięte na drodze wirowania, filtracji lub odparowania. [0128] Rozszczepialny surfaktant kompatybilny z MS może obejmować więcej niż jedno rozszczepialne wiązanie, np. dwa rozszczepialne wiązania skutkujące utworzeniem trzech ugrupowań podczas jedno- lub więcej etapowego rozszczepiania. Każde rozszczepialne wiązanie może być wybranym niezależnie spośród grupy obejmującej wiązanie kowalencyjne, wiązanie jonowe, wiązanie wodorowe lub wiązanie koordynacyjne. Korzystnymi są jedno lub więcej wiązań kowalencyjnych. [0129] Przynajmniej jeden rozszczepialny surfaktant obojnaczy lub niejonowy, pochodzący przynajmniej z jednej frakcji próbki rozdzielanej podczas rozdziału metodą elektroforezy swobodnej, może być rozszczepiany po procesie rozdziału elektroforetycznego, tzn. przynajmniej jeden surfaktant obojnaczy lub niejonowy kompatybilny z MS jest rozszczepialny do przynajmniej jednego ugrupowania kompatybilnego z MS i ugrupowania, które z łatwością może być usunięte na drodze filtracji, odparowania lub wirowania. Ponownie, podkreśla się, że ugrupowanie kompatybilne z MS, również może być usunięte na drodze odparowania przed późniejszymi analizami, tzn. ugrupowanie niekompatybilne z MS powstające podczas etapu rozszczepiania nie jest poddawane rzeczonym późniejszym analizom, podczas gdy PZ/1765/AR 29 EP 2 167 951 B1 ugrupowanie kompatybilne z MS może być obecne, lub opcjonalnie, może nie być obecne podczas późniejszych analiz. [0130] Rozszczepialne surfaktanty kompatybilne z MS mogą obejmować przynajmniej jedno labilne wiązanie kwasowe, tzn. surfaktant jest niestabilny w kwasach, lub przynajmniej jedno labilne wiązanie zasadowe, tzn. surfaktant jest niestabilny w zasadach, lub przynajmniej jedno wiązanie fotolabilne, tzn. surfaktant jest fotolabilny, lub przynamniej jedno reaktywne wiązanie chemiczne, tzn. surfaktant jest reaktywny chemicznie. [0131] Rozszczepialne surfaktanty niestabilne w kwasach i zasadach mogą być rozszczepiane w wyniku zmiany pH przynajmniej części frakcjonowanej próbki/ frakcji np. poprzez zakwaszenie lub alkalizację przynajmniej części frakcjonowanej próbki/frakcji zawierającej rozszczepialny surfaktant niestabilny w kwasach lub zasadach. Fotolabilne rozszczepialne surfaktanty mogą być rozszczepiane z wykorzystaniem promieniowania, tzn. rozszczepienie rozszczepialnego surfaktantu prowadzi się poprzez poddanie przynajmniej części frakcjonowanej próbki/frakcji, zawierającej przynajmniej jeden fotolabilny rozszczepialny surfaktant, działaniu promieniowania światła obejmującego lub składającego się z określonej długości fali, odpowiedniej dla wybiórczego zerwania wiązania pomiędzy linkerem a ugrupowaniem rzeczonego surfaktantu. Reaktywne chemiczne rozszczepialne surfaktanty mogą być rozszczepiane poprzez dodatek reaktywnego czynnika, tzn. rozszczepienie rozszczepialnego surfaktantu prowadzi się poprzez dodanie, do przynajmniej części frakcjonowanej próbki/frakcji, reagenta, który zdolny jest do zerwania wiązania w obrębie reaktywnego chemicznie surfaktantu. Na przykład, odpowiednim reagentem dla zerwania wiązań disiarczkowych i podobnych, jest DTT (ditiotreitol) lub reagentem odpowiednim dla rozszczepienia związków silanowych o wzorze ogólnym: gdzie R1 jest wybrany spośród alkili C7-C20 lub aryloalkili C7-C30 R2, R3, R4, R5 oraz R6 są niezależnie alkilami C1-C5 A jest N lub P X- jest halogenkiem n wynosi 1-5 PZ/1765/AR 30 EP 2 167 951 B1 [0132] Jednym z korzystnych aktywnych chemicznie rozszczepialnych surfaktantów dla zastosowań podczas rozdziału FFE według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku jest bromek {2-[(dimetylo-oktylo-silanylo)-etoksy]-2-hydroksyetylo}-trimetyloamonu. [0133] Grupę fotolabilnych surfaktantów stanowią np. estry kwasu cynamonowego takie jak ester octanowy kwasu 3-(2,4,6- trihydroksyfenylo)- akrylowego. [0134] Nieograniczającym przykładem rozszczepialnego surfaktantu niestabilnego w wodzie jest 3-[3-(1,1-bisalkoksyetylo)pirydyn-1-ylo)propano-1-sulfonian (PPS). [0135] Dla rozszczepialnych surfaktantów reaktywnych chemicznie, a zwłaszcza dla rozszczepialnych surfaktantów niestabilnych w kwasach lub zasadach, metody FFE dostarczają istotnych korzyści w porównaniu do pozostałych technik/metod elektroforetycznych. W rzeczywistości, FFE umożliwia zastosowanie ogromnej różnorodności rozszczepialnych surfaktantów, które nie jest możliwe dla innych technik elektroforetycznych. Na przykład, surfaktanty rozszczepialne niestabilne w kwasach takie jak PPS są wysoce higroskopijne i są powoli rozkładane w wodzie w warunkach obojętnego pH oraz szybciej w kwasowym lub zasadowym pH. Według Protein Discovery, producenta PPS, poleca się by zaraz po otwarciu opakowania, jego zawartość natychmiast rozpuścić w wodnym buforze (pH 7-8), chronić przed podwyższonymi temperaturami i zużyć w ciągu 12 godzin. Oznacza to, że zwłaszcza rozszczepialne surfaktanty niestabilne w zależności od pH, mogą być stosowane podczas elektroforezy jedynie w przypadku, gdy doświadczenie jest względnie krótkie. Maksymalny czas doświadczenia jest nawet jeszcze krótszy w przypadku, gdy pH jest obniżone lub podwyższone. Dlatego też, w pH różnym od obojętnego, eksperyment elektroforetyczny musi być przeprowadzony w ciągu jeszcze węższego przedziału czasowego. Zaletą FFE jest fakt, że rozdział elektroforetyczny np. swobodna IEF, może być przeprowadzony w takim wąskim przedziale czasowym, wymaganym dla utrzymania stabilności surfaktantu. W przeciwieństwie, IEF przeprowadzona w pierwszym wymiarze żelowej elektroforezy 2D (lub w aparacie nie wymagającym użycia żelu) zazwyczaj wymaga prowadzenia eksperymentu przez 5 godzin lub więcej, lub nawet dłużej (aż do 7-9 godzin lub więcej). Zatem, rozszczepialne detergenty byłyby w znacznym stopniu zdegradowane, zwłaszcza w bardzo niskim lub bardzo wysokim pH. [0136] Ponadto, swobodna (interwałowa) elektroforeza strefowa, mająca na celu rozdział analitów, może być prowadzona w stałym pH, w którym surfaktant jest stabilny przez wystarczająco długi okres czasu. [0137] Dodatkowo, zastosowanie mediów przeciwprzepływowych może stabilizować rozszczepialny detergent natychmiast po przeprowadzonym rozdziale. Pozwala to na rozdział analitów w wysoce kwasowym lub zasadowym pH w bardzo wąskim przedziale czasowym (np. około 5 minut) po którym, poprzez przeciwprzepływ, następuje natychmiastowa regulacja pH. Zgodnie z tym, jedna z korzystnych realizacji niniejszego wynalazku odnosi się do metody FFE, w której medium przeciwprzepływowe jest zastosowane w celu przystosowania warunków PZ/1765/AR 31 EP 2 167 951 B1 medium, tak aby możliwą była stabilizacja rozszczepialnego detergentu w nim zawartego, po elektroforezie swobodnej, np. poprzez regulację pH określonych frakcji następującą po etapie rozdziału metodą elektroforezy swobodnej. [0138] Zrozumiałym będzie, że zasady te, jak opisano w powyższych nieograniczających przykładach mogą być zastosowane do innych typów rozszczepialnych detergentów, które są stabilne w określonych warunkach rozdziału jedynie przez ograniczony okres czasu. [0139] Media przeciwprzepływowe mogą być również zastosowane w inny sposób, np. w celu wprowadzenia czynnika rozszczepiającego, który rozszczepia surfaktant w celu dalszej natychmiastowej obróbki frakcji FFE. [0140] Zgodnie z tym, w kolejnej korzystnej realizacji niniejszego wynalazku, metoda obejmuje etap elektroforezy swobodnej, w którym medium przeciwprzepływowe obejmujące czynnik rozszczepiający, zastosowane jest w celu dostarczenia rzeczonego czynnika rozszczepiającego do próbki lub jej frakcji, po rozdziale metodą elektroforezy swobodnej obejmującej rozszczepialny surfaktant, w celu rozszczepienia rzeczonego rozszczepialnego surfaktantu. [0141] W przypadku gdy analit, będący przedmiotem zainteresowania jest białkiem lub polipeptydem, trawienie rzeczonego białka lub polipeptydu może zostać przeprowadzone przed lub po etapie elektroforezy swobodnej. Osobie biegłej w dziedzinie znane są sposoby prowadzenia trawienia białek, np. z wykorzystaniem trypsyny. Koniecznym jest również usunięcie surfaktantów kompatybilnych z MS stosowanych podczas elektroforezy swobodnej, w celu przeprowadzenia rzeczonego trawienia. W przeciwieństwie, obecność rzeczonych surfaktantów może nawet usprawnić trawienie, podczas gdy np. mocznik należy przynajmniej częściowo usunąć przed rzeczonym etapem trawienia. [0142] Trawienie białka może być prowadzone przynajmniej w jednej frakcji zebranej podczas etapu elektroforezy swobodnej lub kolejno po etapie rozszczepiania surfaktantu rozszczepialnego jak tutaj opisano. [0143] Zazwyczaj, usunięcie ugrupowań niekompatybilnych z MS można z łatwością przeprowadzić za pomocą dobrze znanych technik, które nie prowadzą lub prowadzą w nikłym stopniu do utraty próbki. Etap oczyszczania jest zazwyczaj dobierany spośród grupy składającej się z odparowania, filtracji oraz wirowania i prowadzi do usunięcia precypitowanych ugrupowań surfaktantu rozszczepialnego. [0144] Termin "nikły stopień utraty próbki" w znaczeniu tutaj użytym oznacza, że mniej niż 5% analitu będącego przedmiotem zainteresowania, korzystnie gdy mniej niż 1%, korzystniej gdy mniej niż 0.2% i najkorzystniej gdy mniej niż 0.1% może np. zatrzymać się na filtrze zastosowanym w celu usunięcia precypitowanych ugrupowań rozszczepionego surfaktantu lub może pozostać w obrębie peletu precypitowanych ugrupowań rozszczepionego surfaktantu, usuwanych na drodze wirowania, lub może wyparować wraz z ugrupowaniami rozszczepionego surfaktantu bądź wraz z lotnym składnikiem buforowym. PZ/1765/AR 32 EP 2 167 951 B1 [0145] W dowolnym wypadku, w celu uzyskania satysfakcjonujących wyników w późniejszych analizach prowadzonych w oparciu o zastosowania spektroskopii mas adduktów, takich jak wspomniane powyżej, powinno się a niekiedy należy unikać, nie tylko ze względu na fakt, że wiadomym jest iż większość adduktów jest generalnie niekompatybilna ze spektrometrią mas, a przynajmniej jeśli występują powyżej pewnych poziomów tła, które są powszechnie znane w dziedzinie. [0146] Obecność surfaktantów kompatybilnych z MS, które są samoistnie kompatybilne z MS, lub które mogą być rozszczepione dając przynajmniej jedno ugrupowanie kompatybilne z MS i, opcjonalnie, ugrupowania niekompatybilne z MS, które mogą być łatwo usunięte, jest korzystną ponieważ niepożądanymi są etapy oczyszczania, które są czasochłonne i/lub prowadzą do utraty próbki. Zgodnie z tym, metoda według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku, która obejmuje zastosowanie surfaktantów kompatybilnych z MS jak tutaj opisano, prowadzona jest z pominięciem etapu oczyszczania, którego celem jest usunięcie surfaktantów, wybranego spośród grupy obejmującej dializę, chromatografię, chromatografię odwróconej fazy, chromatografię jonowymienną, wymianę surfaktanta, precypitację białka, chromatografię powinowactwa, elektro- blotting, ekstrakcję fazową w układzie ciecz- ciecz oraz ekstrakcję fazową w układzie ciało stałe- ciecz. Innymi słowy, nie jest koniecznym poddanie frakcji uzyskanej podczas rozdziału FFE według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku, takim procesom oczyszczania przed następującymi później analizami. [0147] Zaletą kombinacji lotnych składników buforowych i surfaktantów kompatybilnych z MS, jak tutaj opisano, jest znacznie ograniczona preparacja próbki z frakcji rozdzielonej podczas FFE według niniejszego wynalazku. [0148] Zgodnie z tym, jedna z korzystnych realizacji niniejszego wynalazku odnosi się do metody analizy analitów, jak tutaj opisano, w której etap FFE wykorzystuje medium rozdzielające, zawierające układ lotnych buforów, który dodatkowo obejmuje przynajmniej jeden obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS. [0149] Konkretne przykłady odpowiednich mediów rozdzielających opisano poniżej w sekcji Przykłady. [0150] Niniejsi wynalazcy odkryli, że lotne media rozdzielające, tutaj opisane, są szczególnie odpowiednie i korzystne dla zastosowań nie wykorzystujących matrycy takich jak FFE, ponieważ pozwalają one na zadowalający rozdział analitów i przynoszą dodatkową korzyść, związaną z faktem, że składniki buforu mogą być z łatwością i bezszczątkowo usunięte, po elucji z urządzenia FFE rozdzielonych frakcji zawierających analit (y), będące przedmiotem zainteresowania. Media tutaj opisane są szczególnie korzystne dla rozdziału FFE prowadzonego w warunkach natywnych (tzn. niezaburzających strukturalnej integralności analitów). [0150] Ponadto, dla osoby biegłej w dziedzinie, oczywistym będzie, że większość zastosowań elektroforezy będzie z korzyścią wykorzystywać jednocześnie media rozdzielające i media PZ/1765/AR 33 EP 2 167 951 B1 stabilizujące, przystosowane do określonych zastosowań i aparatu użytego podczas rozdziału/ frakcjonowania. Jednakże, pewne korzystne realizacje niniejszego wynalazku mogą wykorzystywać lotne media rozdzielające w połączeniu z komercyjnie dostępnymi, prawnie zastrzeżonymi mediami stabilizującymi (np. dostępnymi w BD GmbH, Niemcy). Zestawy Obejmujące Media Elektroforetyczne [0152] Dla osoby biegłej w dziedzinie oczywistym będzie, że lotne media rozdzielające tutaj opisane mogą być wybrane, przygotowane i stosowane samodzielnie, lub alternatywnie, odpowiednio razem z mediami stabilizującymi i innymi mediami rozdzielającymi. [0153] Zgodnie z tym, zestaw do prowadzenia elektroforezy FFE, może obejmować przynajmniej jedno spośród lotnych mediów rozdzielających tutaj opisanych. [0154] Zestawy do prowadzenia etapu rozdziału FFE mogą obejmować przynajmniej jedno medium stabilizujące w połączeniu z jednym lub więcej niż jednym lotnym medium rozdzielającym. Media stabilizujące w odniesieniu do zastosowań FFE zdolne są do stabilizacji warunków elektrochemicznych (np. pH) w obszarze rozdziału urządzenia do elektroforezy, a tym samym do przeciwdziałania wystąpieniu niepożądanych efektów lub artefaktów, które w przeciwnym wypadku, mogłyby być podczas obserwowane FFE. Jako podczas takie, procesu rozdziału mediów elektroforetycznego, szczególnie zastosowanie stabilizujących zapewnia zwiększoną dokładność, czułość i powtarzalność podczas rozdziału/ frakcjonowania analitów w próbce. [0155] Medium stabilizujące może być katodowym medium stabilizującym lub anodowym medium stabilizującym. Są one zazwyczaj zlokalizowane odpowiednio pomiędzy anodą/ katodą i medium rozdzielającym. Media stabilizujące charakteryzują się zazwyczaj przewodnością elektryczną wyższą niż przewodność medium rozdzielającego. Na mocy swojej wysokiej przewodności elektrycznej, medium stabilizujące zapobiega migracji analitów przez całą drogę do odpowiednio anody i katody. [0156] Przewodność może być zwiększona o współczynnik równy 2, korzystnie o współczynnik równy 3 i najkorzystniej o współczynnik większy niż 3. Różnice w przewodności pomiędzy mediami rozdzielającymi i mediami stabilizującymi osiągane są poprzez dodatek dodatkowych wysoce przewodzących jonów do mediów stabilizujących lub poprzez zwiększenie stężenia składników buforowych w mediach stabilizujących. Typowe wartości przewodności obserwowane dla mediów stabilizujących wynoszą zazwyczaj więcej niż około 500 ?S/cm, często więcej niż 1,000 lub nawet 2,000 ?S/cm, a w określonych wypadkach mogą nawet osiągać wartość 10,000 lub 20,000 ?S/cm. [0157] Pomimo, że przewodność elektryczna mediów stabilizujących jest wyższa niż przewodność mediów rozdzielających, pH mediów stabilizujących może być wyższe, niemal równe lub nawet niższe niż pH sąsiedniego medium rozdzielającego, w zależności od celu PZ/1765/AR 34 EP 2 167 951 B1 rozdziału. Zazwyczaj jednakże, pH anodowego medium stabilizującego będzie niższe niż pH medium rozdzielającego, a pH katodowego medium stabilizującego będzie wyższe niż pH medium rozdzielającego. [0158] Składniki buforowe mediów stabilizujących mogą być identyczne ze składnikami buforowymi mediów rozdzielających lub mogą być różne. Ponieważ próbka, która ma być odzyskana po etapie rozdziału FFE zazwyczaj nie przejdzie do medium stabilizującego ze względu na utworzoną przez medium barierę przewodności, użycie lotnych składników buforowych w mediach stabilizujących nie jest absolutnie koniecznym. Niemniej jednak często wygodnym jest zastosowanie takich samych składników w przypadku gdy frakcje znajdujące się przy lub w pobliżu medium stabilizującego, mają następnie być poddane analizom prowadzonym techniką spektrometrii mas. Jednakże, jeśli składniki buforowe zastosowane w mediach stabilizujących różnią się od użytych (lotnych) w medium rozdzielającym, kwasy buforowe w anodowym medium stabilizującym powinny być silniejsze (tzn. posiadają niższe pKa) niż kwasy buforowe w medium rozdzielającym. Podobnie, zasady buforowe w katodowym medium stabilizującym również powinny być silniejsze (tzn. posiadają wyższe pKa) niż odpowiednie zasady buforowe w medium rozdzielającym. Ponadto, stężenie tych buforowych kwasów/ zasad powinno być wystarczająco wysokie, aby zapewnić pożądany wzrost przewodności. [0159] Ponieważ anodowe i katodowe media stabilizujące będą równie bardzo użyteczne podczas satysfakcjonującej FFE, zestawy stosowane w metodach według niniejszego wynalazku będą obejmować jedno katodowe i jedno anodowe medium stabilizujące jak tutaj zdefiniowano, jako dodatek do lotnych mediów rozdzielających tutaj opisanych. Zestawy mogą obejmować katodowe i/lub anodowe media stabilizujące, użyteczne podczas zastosowań ZE, lub zestawy mogą obejmować katodowe i/lub anodowe media stabilizujące użyteczne podczas zastosowań IEF. [0160] Zrozumiałym będzie, że korzyścią oferowaną przez kombinację układów lotnych buforów i surfaktantów obojnaczych lub niejonowych kompatybilnych z MS, jest istotnie zredukowane i/lub uproszczone przygotowanie próbki przed analizami następującymi po rozdziale metodą elektroforezy swobodnej, według niniejszego wynalazku. Dlatego też, jedna z korzystnych realizacji, odnosząca się do metody wykorzystującej zestaw, w którym przynajmniej jedno medium rozdzielające obejmuje przynajmniej jeden obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS jak tutaj opisano. [0161] Kolejna korzystna realizacja wykorzystująca zestaw, w którym przynajmniej jedno medium rozdzielające obejmuje przynajmniej jeden obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS, który jest surfaktantem rozszczepialnym jak tutaj opisano. [0162] Zestaw może obejmować wszystkie media wymagane dla danego rozdziału elektroforetycznego, tzn. katodowe i anodowe medium stabilizujące, jak również medium rozdzielające (które samodzielnie może zawierać kilka subfrakcji jak wyjaśniono powyżej). W PZ/1765/AR 35 EP 2 167 951 B1 takich korzystnych realizacjach, lotne media rozdzielające i media stabilizujące będą oczywiście wybrane tak, aby były użytecznymi dla zamierzonego trybu pracy, czy to ZE czy IEF. [0163] Zestaw może obejmować jedno lub kilka mediów rozdzielających oraz dodatkowe media, takie jak media stabilizujące, media przeciwprzepływowe, w postaci jednego lub więcej wodnych roztworów, gotowych do użycia (tzn. wszystkie składniki są obecne w stężeniach odpowiednich dla procesu rozdziału elektrycznego), lub może obejmować jedno lub kilka mediów w postaci zatężonych roztworów, które należy przed użyciem rozcieńczyć za pomocą określonej ilości rozpuszczalnika. Alternatywnie, zestaw może obejmować kilka mediów w postaci suchej lub postaci zliofilizowanej obejmującej różne składniki medium w kilku, ale korzystnie gdy w jednym opakowaniu, które mogą być następnie rozpuszczone w określonej ilości rozpuszczalnika, przed zastosowaniem w procesie rozdziału elektroforetycznego. [0164] Korzystnie gdy, każde medium (medium rozdzielające, katodowe medium stabilizujące, anodowe medium stabilizujące) będzie zawarte w oddzielnych pojemnikach, jednakże dla osoby biegłej w dziedzinie oczywistym będzie, że inne kombinacje oraz sposoby pakowania, w określonych sytuacjach, mogą być możliwymi i użytecznymi. Na przykład, powyżej wspomniano, że media rozdzielające dla zastosowań IEF mogą składać się z określonej liczby "subfrakcji" wykazujących różne stężenia składników (a tym samym różne pH) w celu utworzenia w aparacie do elektroforezy wstępnego gradientu pH. [0165] pH każdego medium rozdzielającego stosowanego w celu utworzenia gradientu może być różne. Liczba subfrakcji wykorzystanych w zastosowaniach IEF zależeć będzie od celu rozdziału, pożądanej rozpiętości pH uzyskanej za pomocą medium rozdzielającego oraz aparatu do elektroforezy użytego podczas rozdziału. pH mediów rozdzielających zazwyczaj mieści się w zakresie pomiędzy pH 2 i pH 13, jednakże w większości przypadków, szczególnie podczas pracy z próbkami o pochodzeniu biologicznym, pH medium rozdzielającego najczęściej będzie mieścić się w zakresie od pH 4 do pH 10. Osoba biegła w dziedzinie rozumieć będzie, że gradient pH, który może zostać utworzony za pomocą lotnych składników buforowych, w szczególności gdy medium rozdzielające jest medium binarnym, zawierającym jedynie jeden kwas buforowy i jedną zasadę buforową, jest często nieco węższy, np. od pH 4 do pH 9 lub nawet od pH 4 do pH 8 lub od pH 5 do pH 9. [0166] W zastosowaniach dla elektroforezy swobodnej, aparat będzie zazwyczaj zawierał kilka wlotów medium (np. N=7, 8 lub 9 wlotów) tak więc subfrakcje tworzące obszar rozdziału w aparacie mogą być do niego wprowadzane poprzez przynajmniej jeden do maksymalnie N-2 wlotów (przynajmniej jeden wlot po każdej stronie zazwyczaj zarezerwowany jest dla medium stabilizującego, jeśli jest obecne). Liczba mediów rozdzielających, która może być wprowadzona do aparatu odpowiedniego dla FFE, zazwyczaj mieści się pomiędzy 2 i 15, korzystnie 3 i 12, a najkorzystniej pomiędzy 4 a 9. Poprzez wprowadzenie subfrakcji lotnych mediów rozdzielających wykazujących pH wzrastające od anody do katody, ogólnie możliwym jest wytworzenie tzw. "prefabrykowanego gradientu" w obrębie aparatu do FFE. PZ/1765/AR 36 EP 2 167 951 B1 [0167] Lotne media rozdzielające w zestawie mogą stanowić media binarne, obejmujące wyłącznie jeden kwas buforujący i jedną zasadę buforującą jak wyjaśniono powyżej. Rozważa się, że wszystkie media rozdzielające i media stabilizujące tutaj opisane, mogą być zawarte w zestawach. [0168] Opcjonalnie, zestawy stosowane w metodach niniejszego wynalazku mogą dodatkowo obejmować instrukcje użytkowania mediów w zastosowaniach elektroforetycznych. [0169] Dla osób biegłych w dziedzinie oczywistym będzie, że lotne media rozdzielające, zwłaszcza w kombinacjach z mediami stabilizującymi jak tutaj opisano, są zdolne zapewnić doskonałe warunki dla satysfakcjonującego rozdziału analitów drogą elektroforezy swobodnej, a ich dodatkową zaletą jest fakt, że odzyskane próbki mogą być bezpośrednio, z pominięciem etapu oczyszczania, wykorzystane w późniejszych zastosowaniach, ponieważ składniki buforowe wykorzystane podczas rozdziału FFE mogą być w wygodny sposób usunięte metodą prostego odparowania. [0170] Niektóre z korzystnych realizacji niniejszego wynalazku odnoszą się do metod, w których w medium próbki i/lub medium rozdzielającym znajduje się rozszczepialny surfaktant obojnaczy lub niejonowy kompatybilny z MS. Docenionym będzie, że odparowania lotnych składników buforowych i usunięcia ugrupowań powstałych w wyniku rozszczepienia rozszczepialnego surfaktantu kompatybilnego z MS prowadzone drogą prostej filtracji, wirowania lub odparowania, nie należy rozumieć jako tak czasochłonnego lub niekorzystnego lub jako etapów oczyszczania, których można uniknąć jak tutaj opisano. Metody FFE Wykorzystujące Lotne Media Rozdzielające [0171] Metoda rozdziału analitów na drodze FFE wykorzystująca lotne medium rozdzielające lub zestaw tutaj opisany zazwyczaj obejmuje etapy: a) wprowadzenia analitu do aparatu odpowiedniego dla FFE zawierającego lotne media rozdzielające; b) rozdział analitów na drodze FFE; c) elucję próbki z aparatu FFE i opcjonalnie zebranie przynajmniej części próbki z wielu frakcji [0172] Rozdział FFE opisany powyżej prowadzony jest w celu otrzymania próbki odpowiedniej dla późniejszej metody analitycznej opartej o spektrometrię mas. [0173] Jak wskazano wcześniej, rozdział FFE może być prowadzony z zastosowaniem dowolnego spośród lotnych mediów rozdzielających, korzystnie w połączeniu z mediami stabilizującymi tutaj opisanymi. Zatem, metody rozdziału FFE według korzystnych realizacji PZ/1765/AR 37 EP 2 167 951 B1 niniejszego wynalazku mogą być prowadzone w wygodny sposób dzięki wykorzystaniu zestawów zawierających media rozdzielające i opcjonalnie media stabilizujące tutaj omawiane. [0174] Jak tutaj omówiono, metoda rozdziału FFE jest przede wszystkim zdolna do rozdziału dowolnego analitu, włączając cząsteczki organiczne, cząsteczki nieorganiczne, biocząstki, biopolimery lub biocząsteczki, wykazującego wystarczająco wysoką rozpuszczalność w wodnych lotnych mediach rozdzielających. Przykłady analitów biologicznego pochodzenia, które mogą być rozdzielane za pomocą metody rozdziału FFE według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku obejmują białka, agregaty białek, peptydy, hormony, kompleksy DNA i białek takie jak chromatyna, DNA, przeciwciała, komórki, organella komórkowe, wirusy lub cząstki wirusowe, błony, fragmenty błon, lipidy, cukry, wielocukry, liposomy, nanocząstki lub mieszaniny dowolnych z nich. [0175] Szczególnie gdy próbka poddawana rozdziałowi jest biologicznego pochodzenia, na przykład zawiera głównie materiał białkowy, metoda rozdziału FFE może być prowadzona w warunkach natywnych, które nie zaburzają integralności strukturalnej analitów. Ponadto, osobom biegłym w dziedzinie wiadomym jest, że większość czynników używanych w celu denaturacji próbki podczas elektroforezy, znanych jest z braku kompatybilności wykazywanego względem mającej nastąpić później MS i należy je usunąć przed analizami, podważając tym samym korzyści niesione przez lotne media rozdzielające według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku. Niezależnie od tego, w pewnych korzystnych realizacjach np. jeśli analit będący przedmiotem zainteresowania jest białkiem lipofilowym, metoda może być wykorzystywana w obecności przynajmniej jednego obojnaczego lub niejonowego surfaktantu kompatybilnego z MS jak tutaj opisano, a jej zaletą jest fakt, że surfaktant nie wymaga usunięcia przed późniejszymi analizami MS. W przypadku gdy surfaktant kompatybilny z MS jest surfaktantem rozszczepialnym, powstałe z rozszczepionego surfaktantu ugrupowania niekompatybilne z MS, mogą być łatwo usunięte na drodze prostego wirowania, filtracji lub odparowania. [0176] Ogólnie, wynalazek odnosi się do metody analizy analitów, obejmującej rozdział FFE i następujące później analizy przynajmniej jednego analitu, będącego przedmiotem zainteresowania, techniką spektrometrii mas (MS). Rzeczona późniejsza analiza przynajmniej jednej frakcji otrzymanej podczas rzeczonego rozdziału FFE jest wybrana spośród grupy obejmującej MALDI MS, ESI MS, SELDI MS, LC-MS(/MS) oraz MALDI-TOF-MS(/MS). [0177] W praktyce, metoda analizy analitów obejmująca rozdział FFE wykorzystujący lotne media rozdzielające jak tutaj opisane, prowadzony przed późniejszą analizą (tzn. analizą spektrometrii mas) zazwyczaj obejmuje następujące etapy: a) rozdział analitów w próbce wprowadzonej do aparatu odpowiedniego dla elektroforezy swobodnej; b) elucja analitu (analitów) otrzymanego podczas etapu rozdziału FFE do wielu frakcji; PZ/1765/AR 38 EP 2 167 951 B1 c) zebranie przynajmniej jednej frakcji zawierającej analit (anality) będące przedmiotem analizy; oraz d) poddanie przynajmniej jednej spośród frakcji analizie spektrometrii mas z pominięciem etapu porządkowania lub oczyszczania. [0178] Dzięki zaletom wykazywanym przez lotne składniki buforowe stosowane podczas rozdziału FFE, żadne dodatkowe etapy porządkowania lub oczyszczania, mające na celu usunięcie lotnych składników buforowych, nie są koniecznymi przed przeprowadzeniem analizy MS. Z tego względu, brak etapów porządkowania lub oczyszczania, jak użyty w tym kontekście, oznacza, że lotne składniki buforowe usuwane są jedynie na drodze odparowania. Innymi słowy, metoda ta pozwala na uniknięcie czasochłonnych i potencjalnie niekorzystnych etapów prowadzących do utraty cennego analitu, takich jak np. filtracja na sitach molekularnych, dializy, chromatografia odwróconej fazy, chromatografia powinowactwa, precypitacja analitu (np. precypitacja białek), ekstrakcja w cieczy lub zastosowanie reagentów par jonowych. [0179] Jednakże, w pewnych korzystnych realizacjach, surfaktanty mogą być zastosowane w celu np. zwiększenia rozpuszczalności analitów będących przedmiotem zainteresowania. W takich korzystnych realizacjach pożądanym jest aby przynajmniej jeden surfaktant był obojnaczym lub niejonowym surfaktantem kompatybilnym z MS jak tutaj opisano. Korzystnie, wszystkie surfaktanty zawarte w przynajmniej jednym medium rozdzielającym i/lub jednym medium próbki są obojnaczymi lub niejonowymi surfaktantami kompatybilnymi z MS. [0180] Szczególnie, obojnaczy lub niejonowy surfaktant wykorzystywany w metodzie według niniejszego wynalazku może być surfaktantem rozszczepialnym. [0181] Zrozumiałym będzie, że w obecności przynajmniej jednego rozszczepialnego surfaktantu kompatybilnego z MS jak tutaj opisano, koniecznym może być rozszczepienie rzeczonego rozszczepialnego surfaktantu i późniejsze usunięcie ugrupowania powstałego w wyniku rozszczepienia, w oparciu o proste wirowanie, filtrację lub odparowanie. Rzeczonych, wyżej wymienionych etapów wirowania, filtracji lub odparowania nie należy rozumieć jako czasochłonnych i niekorzystnych etapów porządkowania lub wirowania prowadzonych w celu usunięcia surfaktantów lub ugrupowań surfaktantów, jak zdefiniowano tutaj poniżej. [0182] W niektórych korzystnych realizacjach, korzystnym jest aby metoda obejmowała zastosowanie przynajmniej jednego medium przeciwprzepływowego, zawierającego czynnik rozszczepiający. Kiedy rzeczone medium przeciwprzepływowe wchodzi w kontakt z i/lub jest mieszane z frakcją powstałą w wyniku rozdziału FFE, np. w komorze separacyjnej lub podczas elucji rzeczonej frakcji z komory separacyjnej, rzeczone medium przeciwprzepływowe np. umożliwia rozszczepienie rozszczepialnego surfaktantu bezpośrednio po rzeczonym rozdziale FFE. [0183] W innych korzystnych realizacjach, metoda według niniejszego wynalazku może obejmować zastosowanie medium przeciwprzepływowego, które przystosowuje warunki PZ/1765/AR 39 EP 2 167 951 B1 medium dla przynajmniej jednej frakcji powstałej w wyniku rozdziału FFE do warunków, które stabilizują rozszczepialny detergent, który może być w rzeczonej frakcji obecny, tzn. medium przeciwprzepływowe jest wykorzystywane w celu stabilizacji rozszczepialnego surfaktantu zawartego przynajmniej w jednej frakcji po rozdziale metodą elektroforezy swobodnej. Jako nielimitujący przykład, taka stabilizacja może być osiągnięta poprzez dostosowanie pH roztworu, tzn. pH frakcji uzyskanej podczas FFE może prowadzić do rozkładu rozszczepialnego detergentu, podczas gdy połączony roztwór z medium przeciwprzepływowym wykazuje pH, w którym rozszczepialny surfaktant jest zasadniczo stabilny, tzn. medium przeciwprzepływowe jest wykorzystywane w celu stabilizacji rozszczepialnego surfaktantu zawartego przynajmniej w jednej frakcji po rozdziale metodą elektroforezy swobodnej. [0184] W korzystnych realizacjach, w których obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS jest rozszczepialnym surfaktantem, rozszczepienie rzeczonego rozszczepialnego surfaktantu skutkuje utworzeniem przynajmniej dwóch ugrupowań, które albo są kompatybilne z MS i/lub mogą być w łatwy sposób usunięte z roztworu zawierającego analit będący przedmiotem zainteresowania, na drodze filtracji, wirowania i/lub odparowania. Innymi słowy, metoda według korzystnych realizacji niniejszego wynalazku nie wymaga etapu oczyszczania prowadzonego w celu usunięcia surfaktantu lub ugrupowań powstałych w wyniku rozszczepienia surfaktantów, takiego jak dializa, chromatografia, chromatografia odwróconej fazy, chromatografia jonowymienna, wymiana surfaktantu, precypitacja białka, chromatografia powinowactwa, elektro- blotting, ekstrakcja fazowa w układzie ciecz- ciecz i/lub ekstrakcja w układzie ciało stałe- ciecz. [0185] Niezależnie od powyższego, rozważa się tutaj zwłaszcza, że następujące później metody analizy według wynalazku (tzn. analiza spektroskopii mas) niemniej jednak mogą obejmować dodatkowe etapy, np. w celu fragmentacji analitów otrzymanych w cyniku rozdziału FFE, ale prowadzone przed późniejszym etapem analizy. Fragmentację zazwyczaj prowadzi się w celu obniżenia masy cząsteczkowej analitu, w celu uzyskania fragmentów lotnych rzeczonego analitu lub w celu uzyskania modelu fragmentacji analitu, który ma podlegać identyfikacji lub analizie na drodze MS. Etap fragmentacji może być wybrany, ale nie jest ograniczony do grupy składającej się z fragmentacji fizycznej (bombardowanie strumieniem elektronów o wysokiej energii), fragmentacji chemicznej (np. słabe kwasy dla peptydów) lub trawienia (np. przez enzymy) analitów. [0186] W pewnych korzystnych realizacjach, metoda może dodatkowo obejmować etap dodatku do przynajmniej jednej frakcji, uzyskanej podczas etapu rozdziału FFE, czynnika obniżającego masę molekularną analitów, które mają być poddane późniejszej analizie takiej jak MS. Szczególnie gdy analit (y) jest (są) głównie białkiem (białkami) lub peptydem (peptydami), czynnik obniżający masę molową analitu może być proteazą lub mieszaniną proteaz. W innych korzystnych realizacjach, w których rozdzielany (e) jest (są) nukleotyd (y), czynnik ten może być nukleazą lub mieszaniną nukleaz. PZ/1765/AR 40 EP 2 167 951 B1 [0187] A zatem, przynajmniej część lotnych składników buforowych i rozpuszczalnika (tzn. wody) są korzystnie usuwane z zebranej porcji próbki, która ma być analizowana podczas późniejszej analizy MS, na drodze prostego odparowania przed rzeczoną późniejszą analizą. Usunięcie przynajmniej części lotnych składników buforowych i rozpuszczalnika prowadzi się po rozdziale analitów metodą FFE, ale przed ich późniejszą analizą. Jako nieograniczający przykład, wystarczająca część lotnych składników buforowych i rozpuszczalnika jest usuwana w celu umożliwienia prawidłowej interpretacji wynikowego widma MS otrzymanego w wyniku późniejszej analizy MS. Usunięta część lotnych składników buforowych i rozpuszczalnika może obejmować przynajmniej 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, lub całe 100% (masy) całkowitej masy lotnych składników buforowych i rozpuszczalnika. Korzystnie gdy, zasadniczo całość lotnych składników buforowych i rozpuszczalnika jest usunięta po rozdziale analitów metodą FFE, ale przed ich późniejszą analizą MS. Wiele wygodnych metod usuwania rozpuszczalnika i lotnych składników buforowych jest znanych osobom biegłym w dziedzinie i zostało również opisanych tutaj. Na przykład, usunięcie może być przeprowadzone, między innymi, na drodze wirowania próżniowego lub liofilizacji. Próbka może być również ogrzana w celu ułatwienia odparowania rozpuszczalnika i lotnych buforów. [0188] Następujący po rozdziale FFE etap analizy metodą spektrometrii mas może być prowadzony w celu identyfikacji nieznanych związków w oparciu o masę cząsteczki związku lub jej fragmentów, w celu określenia składu izotopowego cząstek związku, w celu określenia struktury związku poprzez analizę sposobu jego fragmentacji, w celu wyznaczenia ilości związku w próbce, w celu badania podstaw chemii jonów w fazie gazowej (chemia jonów i cząsteczek obojętnych w próżni) lub, w połączeniu z różnymi innymi technikami, w celu określenia innych fizycznych, chemicznych, a nawet biologicznych właściwości związku. [0189] W dziedzinie występuje wiele różnych metod spektroskopii mas. Metoda spektroskopii mas stosowana w metodach niniejszego wynalazku jest wybrana spośród metod obejmujących jonizację elektrosprejem (elektro spray ionization, ESI), desorpcję laserową z wykorzystaniem matrycy (MALDI) lub powierzchniowo wzmocnionej laserowej desorpcji/ jonizacji (SELDI). Obie metody ESI i MALDI są szczególnie korzystnymi technikami analizy spektrometrii mas w zastosowaniach proteomicznych. [0190] W innych korzystnych realizacjach lotne składniki buforowe usuwane są na drodze odparowania nie przed, ale podczas późniejszego etapu analizy metodą spektrometrii mas. Ponownie, podczas stosowania lotnych mediów buforowych tutaj opisanych, nie wymagane są dodatkowe etapy mające na celu wymianę lub usunięcie lotnych składników buforowych. Wiele metod MS pracuje w warunkach obniżonego ciśnienia, które mogą być wystarczającymi w celu całkowitego i bezszczątkowego odparowania rozpuszczalnika i składników buforowych, pozostawiając czystą próbkę i opcjonalnie (na przykład w przypadku MALDI), składnik służący za matrycę. Zrozumiałym będzie, że termin matryca w znaczeniu spektrometrii mas (MS) jak tutaj użyty, różni się od terminu "matryca" stosowanego w odniesieniu do elektroforezy (np. PZ/1765/AR 41 EP 2 167 951 B1 poliakrylamid czy agaroza). Z tego względu, w niektórych korzystnych realizacjach, w których późniejszą analizą jest na przykład analiza MALDI, składnik matrycy dla analizy MALDI jest dodawany do buforowego roztworu analitu przed analizą spektrometrii mas. [0191] W innych korzystnych realizacjach, medium rozdzielające stosowane podczas etapu rozdziału FFE od razu zawiera przynajmniej jeden składnik buforowy, który może stanowić matrycę podczas analizy MALDI a pozostałe składniki buforowe są lotne, jak tutaj zdefiniowano. [0192] W pewnej korzystnej realizacji tego aspektu niniejszego wynalazku, w której medium rozdzielające FFE obejmuje lotne składniki buforowe, a późniejszą analizą MS jest MALDI, metoda analizy analitów techniką spektrometrii mas wykorzystująca etap rozdziału FFE przed analizą spektrometrii mas MALDI obejmuje etapy: a) wprowadzenia analitu do aparatu odpowiedniego dla FFE zawierającego lotne media rozdzielające; b) rozdział analitów na drodze FFE; c) dodatek składnika matrycy dla analizy MALDI do roztworu buforowego zebranego analitu; d) usunięcie przynajmniej części rozpuszczalnika i lotnych składników buforowych; oraz e) poddanie wysuszonej mieszaniny analitu w matrycy analizie MALDI, z pominięciem dodatkowych etapów oczyszczania. [0193] Alternatywna korzystna realizacja tego aspektu niniejszego wynalazku odnosi się do metody analizy analitów techniką spektrometrii mas wykorzystującą etap rozdziału FFE przed rzeczoną analizą spektrometrii mas, w której medium rozdzielające zawiera przynajmniej jeden składnik buforowy, który może pełnić funkcję matrycy podczas analizy MALDI i w której inne składniki buforowe są lotne. Taka alternatywna metoda obejmuje etapy: a) wprowadzenia analitu do aparatu odpowiedniego dla FFE zawierającego media rozdzielające; b) rozdziału analitów na drodze FFE; c) usunięcia przynajmniej części rozpuszczalnika; oraz d) poddanie wysuszonej mieszaniny analitu w matrycy analizie MALDI, z pominięciem dodatkowych etapów porządkowania lub oczyszczania próbki. [0194] Aby móc pełnić funkcję matrycy MALDI, związek musi spełniać jednocześnie kilka wymagań. Powinien być zdolny do wytrącenia i izolacji analitu (np. poprzez współkrystalizację), być rozpuszczalny w rozpuszczalnikach kompatybilnych z analitem, być stabilnym w próżni, absorbować długość fali lasera, powodować współdesorpcję analitu pod wpływem promieniowania lasera i ułatwiać jonizację analitu. Związki z labilnymi protonami, takie jak PZ/1765/AR 42 EP 2 167 951 B1 kwasy karboksylowe, znane są ze swojej użyteczności jako matryce podczas analizy MALDI w trybie jonów dodatnich, ponieważ łatwo protonują obojętne cząsteczki analitu w grzebieniu. Jednakże, kwasowe środowisko nie zawsze jest pożądanym, szczególnie, gdy należy uniknąć denaturacji trzeciorzędowej struktury biocząsteczki. Dlatego też w przeważającej mierze, podczas pomiarów dla białek, stosuje się niekwasowe matryce. [0195] Odpowiednie składniki matryc dla MALDI obejmują, ale nie są ograniczone do kwasu alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowego, soli dietyloaminowej kwasu alfa-cyjano-4- hydroksycynamonowego, soli butyloaminowej kwasu alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowego, kwasu sinapowego, kwasu 2-(4-hydroksyfenyloazo) benzoesowego (HABA), 2- merkaptobenzotiazolu, kwasu bursztynowego, 2,6-dihydroksyacetofenonu, kwasu ferulowego, kwasu kawowego, 4-nitroaniliny, 2,4,6-trihydroksyacetofenonu, kwasu 3-hydroksypikolinowego, kwasu antranilowego, kwasu nikotynowego, salicylamidu, kwasu 3-indoloakrylowego, ditranolu, kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB), izowaniliny oraz 3-aminochinoliny (w zależności od analitu i rodzaju lasera wykorzystywanego podczas analizy MALDI). [0196] Ponieważ metody tutaj przedstawione nie są ograniczone do określonych analitów, docenionym będzie, że są one szczególnie użyteczne podczas rozdziału cząsteczek organicznych, nieorganicznych lub próbek biologicznego pochodzenia zawierających biocząstki, biopolimery i biocząsteczki ze względu na dobrze określony skład mediów oraz ich łatwą do uzyskania powtarzalność. [0197] We wszystkich korzystnych realizacjach, metoda rozdziału FFE może być prowadzona zarówno na sposób ciągły, sposób interwałowy (nazywany również parcjalnym) lub na sposób cykliczno- interwałowy. [0198] Korzystne realizacje niniejszego wynalazku obejmują metody rozdziału FFE prowadzone techniką elektroforezy strefowej (FFZE). Pozostałe metody rozdziału FFE prowadzone są techniką ogniskowania izoelektrycznego (FF-IEF). Jeszcze inne metody rozdziału FFE prowadzone są techniką izotachoforezy (FF-ITP). [0199] W pewnych korzystnych realizacjach, rozdział FFE prowadzony jest na sposób ciągłej FFE-IEF. Ta ostatnia jest szczególnie użyteczna podczas ciągłej iniekcji próbki do komory separacyjnej aparatu do FFE. W innych, alternatywnych realizacjach, etap rozdziału FFE prowadzony jest na sposób interwałowej lub cykliczno- interwałowej FFE-IEF, jak opisano powyżej. [0200] Oczywistym będzie, że układy lotnych buforów są odpowiednie do stosowania podczas rozdziału FFE. Niezależnie od tego, korzystnym może być łączne stosowanie układów lotnych buforów tutaj przedstawionych z innymi układami buforów nielotnych, takich jak układy buforowe utworzone przez komercyjne amfolity, binarne układy kwas buforowy/zasada buforowa (medium A/B) jak opisano w Później opublikowanym WO 2008/087218 lub układy wielokrotnych komplementarnych par buforowych (CMPBS). CMPBS jest mieszaniną buforową złożoną ze starannie dobranych kwasów i zasad, tak że mieszanina ta zapewnia, w przypadku PZ/1765/AR 43 EP 2 167 951 B1 przepływu prądu przez układ buforowy, gładki gradient pH. Do mieszaniny dobiera się organiczne kwasy i zasady o niskiej masie cząsteczkowej, które umożliwiają zwiększenie pojemności buforowej w porównaniu do komercyjnie dostępnych amfolitów o wysokiej masie cząsteczkowej. Takie mieszaniny starannie dobranych kwasów i zasad są doskonale scharakteryzowane pod kątem masy cząsteczkowej, pI, czystości i toksyczności. Ogólnie, kwasy i zasady posiadają niższą masę cząsteczkową niż masa komercyjnych amfolitów. Układy wielokrotnych komplementarnych par buforowych znane są w dziedzinie. Ściślej mówiąc, mieszanina o zakresie pH mieszczącym się w granicach od 3 do 5 sprzedawana jest przez BD GmbH Germany jako BD FFE Separation medium 1 podczas gdy mieszanina o pH w zakresie 5 do 8 sprzedawana jest jako BD FFE Separation medium 2. Takie układy buforowe były na przykład opisane w ogólnej formie we amerykańskim wniosku patentowym US 2004/0101973 oraz w EP 1 320 747. [0201] Osoba biegła w dziedzinie rozumieć będzie, że stosowanie takich układów buforowych mediów nielotnych jest ograniczone do obszarów strefy rozdziału, które nie zawierają po rozdziale analitu (analitów) będącego przedmiotem zainteresowania, tzn. analit (y) będący przedmiotem zainteresowania jest (są) eluowany ze strefy rozdziału w lotnym medium buforowym. [0202] Oznacza to, że w ostatnim przypadku strefa rozdziału obejmuje przynajmniej dwa różne typy mediów buforowych. W szczególności, termin "typ buforu", w znaczeniu tutaj użytym, odnosi się odpowiednio do jednego typu buforowego medium rozdzielającego obejmującego układ buforów lotnych, oraz do jednego typu buforowego medium rozdzielającego, obejmującego układ buforów nielotnych. A zatem, buforowe medium rozdzielające (SBM) typu A w znaczeniu tutaj użytym odnosi się do SBM obejmującego układ lotnych buforów, a SBM typu B w znaczeniu tutaj użytym odnosi się do SBM obejmującego układ buforów nielotnych. Jedno SBM typu A lub kilka sąsiadujących SBM typu A mogą w strefie rozdziału tworzyć strefę A, a jedno SBM typu B lub kilka sąsiadujących SBM typu B mogą tworzyć strefę B. [0203] Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek odnosi się do metody obejmującej etap rozdziału FFE obejmujący: utworzenie pomiędzy elektrodami aparatu, odpowiedniego dla elektroforezy swobodnej, strefy rozdziału pomiędzy anodą i katodą obejmującej strefę A utworzoną przez przynajmniej jedno buforowe medium rozdzielające (SBM) typu A, w którym układem buforowym jest układ lotnych buforów oraz strefę B utworzoną przez przynajmniej jedno buforowe medium rozdzielające typu B, w którym układem buforowym jest układ nielotnych buforów; w której rzeczona strefa A jest umiejscowiona w strefie rozdziału w taki sposób, że przynajmniej jeden analit, będący przedmiotem zainteresowania, może być eluowany ze PZ/1765/AR 44 EP 2 167 951 B1 strefy rozdziału w rzeczonej strefie A, tzn. przynajmniej jeden analit będący przedmiotem zainteresowania jest po rozdziale obecny w SBM typu A; rozdział analitów w próbce wprowadzonej do rzeczonego aparatu odpowiedniego dla elektroforezy swobodnej; elucję przynajmniej jednego analitu będącego przedmiotem zainteresowania ze strefy rozdziału w SBM typu A. [0204] W jednej z korzystnych realizacji, próbka wprowadzana jest do strefy A i przynajmniej jeden analit będący przedmiotem zainteresowania pozostaje w rzeczonej strefie A, tzn. eluuje we frakcji (frakcjach) SBM typu A. Nieograniczający przykład stanowi tutaj rozdział metodą swobodnej ITP, w którym próbka jest wprowadzana do regionu oddzielającego, utworzonego przez strefę A otoczoną przez dwie strefy B (patrz FIGy. 17 i 18). [0205] W innej korzystnej realizacji, próbka wprowadzana jest do strefy B i przynajmniej jeden analit będący przedmiotem zainteresowania jest przenoszony podczas rozdziału FFE do strefy A, tzn. przynajmniej jeden analit będący przedmiotem zainteresowania, korzystnie gdy wszystkie anality będące przedmiotem zainteresowania, eluują ze strefy rozdziału jako frakcje utworzone przez SBM typu A. Nieograniczającym przykładem jest tutaj cykliczno- interwałowe ogniskowanie izoelektryczne jak schematycznie przedstawiono na FIG.16. Próbka wprowadzana jest do SBM typu B tworzącego razem z dodatkowym SBM typu B strefę B, a analit będący przedmiotem zainteresowania jest przenoszony podczas rozdziału do strefy A i eluuje z komory separacyjnej w SBM typu A. [0206] SBM typu A może dodatkowo obejmować obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS. [0207] SBM typu B może obejmować układ buforów wybrany spośród komercyjnie dostępnych amfolitów, binarnych układów buforowych kwas/zasada (medium A/B) lub układ wielokrotnych komplementarnych par buforowych (CMPBS). [0208] Korzystne realizacje niniejszego wynalazku i ich zalety są dodatkowo zobrazowane w następujących, nieograniczających przykładach. Przykłady PRZYKŁAD 1: Rozdział białek ludzkiego osocza w warunkach natywnych [0209] Medium rozdzielające oraz media stabilizujące badano z zastosowaniem BD? Free Flow Electrophoresis System i metody FFIEF, wykorzystując roztwór kontroli jakości. Aparat złożono w sposób uwzględniający dziewięć wlotów dla mediów (E1-E9) i cztery wloty dla próbek PZ/1765/AR 45 EP 2 167 951 B1 (S1-S4). Anodowe medium stabilizujące doprowadzono do wlotu E1. Katodowe medium stabilizujące wprowadzono do wlotu E9, a próbkę wprowadzono poprzez wlot dla próbki S2. Całkowity czas elektroforezy wynosił około 10 minut. Przyłożone napięcie wynosiło 500V a natężenie wynosiło 30 mA. Przepływ próbki i mediów ustalono na poziomie odpowiednio 1.5 ml/h oraz 120 ml/h. [0210] Anodowe medium stabilizujące: 450 mM HAc, 225 mM TRIS (pH = 4.5; przewodność: 9080 ?S/cm) (E1) [0211] Katodowe medium stabilizujące: 225 mM HAc, 1148 mM TRIS (pH = 8,40; przewodność: 7730 ?S/cm) (E9) [0212] Medium rozdzielające: Wlot Mediów Media E2 150 mM HAc 25 mM TRIS 100 mM betainy E3 15 mM TRIS x mM HAc* E4 15 mM TRIS x mM HAc* E5 15 mM TRIS 15 mM HAc E6 15 mM HAc x mM TRIS* E7 15 mM HAc x mM TRIS* E8 100 mM HAc x mM TRIS* 100 mM EACA pH Przewodność (?S/cm) 4.03 1494 4.70 912 5.42 891 6.37 881 7.80 894 8.32 896 9.04 777 *: Roztwory miareczkowano do uzyskania wymienionego pH albo HAc lub TRIS, pomiary pH wykonywano za pomocą elektrody pH [0213] pH każdej z frakcji FFE określono przy użyciu elektrody pH i przedstawiono na wykresie na FIG.1. Zabarwione markery pI poddano separacji w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja frakcji przy długości fali ?=420, 515 oraz 595 nm, reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI również została przedstawiona na FIG.1. [0214] Żele SDS dla kilku frakcji barwione srebrem przedstawiające rozdział białek z ludzkiego osocza przedstawiono na FIG.2. PRZYKŁAD 2: Natywne zubożanie albuminy surowicy w ludzkim osoczu [0215] Medium rozdzielające oraz media stabilizujące badano z zastosowaniem BD? Free Flow Electrophoresis System i metody FFIEF, wykorzystując roztwór kontroli jakości. Aparat złożono w sposób uwzględniający dziewięć wlotów dla mediów (E1-E9) i cztery wloty dla próbek PZ/1765/AR 46 EP 2 167 951 B1 (S1-S4). Anodowe medium stabilizujące doprowadzono do wlotu E1. Katodowe medium stabilizujące wprowadzono do wlotu E9 a próbkę wprowadzono poprzez wlot dla próbki S2. Całkowity czas elektroforezy wynosił około 10 minut. Przyłożone napięcie wynosiło 500V a natężenie wynosiło 31 mA. Przepływ próbki i mediów ustalono na poziomie odpowiednio 1.5 ml/h oraz 120 ml/h. [0216] Anodowe medium stabilizujące: 450 mM HAc, 225 mM TRIS (pH = 4.5; przewodność: 9080 ?S/cm) (E1) [0217] Katodowe medium stabilizujące: 225 mM HAc, 1148 mM TRIS (pH = 8,40; przewodność: 7730 ?S/cm) (E9); [0218] Medium rozdzielające: Wlot Mediów Media E2 150 mM HAc 25 mM TRIS E3 15 mM TRIS x mM HAc* E4 15 mM TRIS x mM HAc* E5 15 mM TRIS 15 mM HAc E6 15 mM TRIS x mM HAc* E7 15 mM TRIS x mM HAc* E8 100 mM HAc x mM TRIS* 100 mM betainy pH Przewodność (?S/cm) 4.03 1494 4.43 904 4.71 901 4.84 895 5.03 899 6.06 881 100 mM EACA 7.47 3770 *: Roztwory miareczkowano do uzyskania wymienionego pH albo HAc lub TRIS, pomiary pH wykonywano za pomocą elektrody pH [0219] pH każdej z frakcji FFE określono przy użyciu elektrody pH i przedstawiono na wykresie na FIG.3. Zabarwione markery pI poddano separacji w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja frakcji przy długości fali ?=420, 515 oraz 595 nm, reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI została przedstawiona na FIG.5. [0220] Żele SDS dla kilku frakcji barwione srebrem przedstawiające rozdział białek z ludzkiego osocza przedstawiono na FIG.4. PRZYKŁAD 3: rozdział FFE metodą cykliczno- interwałową [0221] Medium rozdzielające oraz media stabilizujące badano z zastosowaniem BD? Free Flow Electrophoresis System i metody FFIEF, wykorzystując roztwór kontroli jakości. Aparat PZ/1765/AR 47 EP 2 167 951 B1 złożono w sposób uwzględniający dziewięć wlotów dla mediów (E1-E9) i cztery wloty dla próbek (S1-S4). Anodowe medium stabilizujące doprowadzono do wlotu E1. Katodowe medium stabilizujące wprowadzono do wlotu E9 a próbkę wprowadzono poprzez wlot dla próbki S2. Całkowity czas elektroforezy wynosił około 40 minut. Przyłożone napięcie wynosiło 500V a natężenie wynosiło 30 mA. Przepływ próbki i mediów ustalono na poziomie odpowiednio 1.5 ml/h oraz 150 ml/h. Rozdział prowadzono metodą cykliczno- interwałowej FF-IEF dla przepływu ustalonego na poziomie 50 ml/h, a frakcjonowaną próbkę eluowano w przepływie 150 ml/h. [0222] Anodowe medium stabilizujące: 450 mM HAc, 225 mM TRIS (pH = 4.54; przewodność: 9120 ?S/cm) (E1); [0223] Katodowe medium stabilizujące: 225 mM HAc, 1148 mM TRIS (pH = 8,40; przewodność: 8040 ?S/cm) (E9); [0224] Medium rozdzielające: Wlot Mediów Media E2 150 mM HAc 25 mM TRIS E3 15 mM TRIS x mM HAc* E4 15 mM TRIS x mM HAc* E5 15 mM TRIS 15 mM HAc E6 15 mM HAc x mM TRIS* E7 15 mM HAc x mM TRIS* E8 100 mM HAc x mM* TRIS 100 mM betainy pH Przewodność (?S/cm) 3.97 1432 4.73 915 5.60 900 6.38 885 7.66 892 8.34 886 100 mM EACA 9.05 791 *: Roztwory miareczkowano do uzyskania wymienionego pH albo HAc lub TRIS, pomiary pH wykonywano za pomocą elektrody pH [0225] pH każdej z frakcji FFE określono przy użyciu elektrody pH i przedstawiono na wykresie na FIG.5. Zabarwione markery pI poddano separacji w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja frakcji przy długości fali ?=420 nm, 515 nm oraz 595 nm, reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI została przedstawiona na FIG.5. PRZYKŁAD 4: Rozdział białek komórek lizatu komórek HeLa poprzedzający analizę LCMS/MS [0226] Komórki HeLa trawiono zgodnie z następującym protokołem trawienia enzymatycznego: PZ/1765/AR 48 EP 2 167 951 B1 1.Dodać 200 mM roztworu TCEP do uzyskania stężenie końcowego 5 mM. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 200 mM roztworu jodoacetamidu do uzyskania stężenie 15 mM i inkubować przez 60 minut w ciemności. 2. Za pomocą wodorowęglanu amonu o stężeniu 100 mM ustalić pH roztworu na poziomie 7.8. 3. Dodać trypsyny tak aby stosunek enzymu i białka wynosił 1:37.5 i inkubować 4 godziny w temperaturze 37° C. 4. Zakwasić roztwór za pomocą 0.1% kwasu trifluorooctowego (TFA) w celu zatrzymania procesu trawienia. 5. Przy użyciu wkładów odwróconej fazy SepPak? C18 oczyścić powstałe peptydy: Zrównoważyć wkład za pomocą dwóch porcji 1 mL acetonitrylu i dodatkowych dwóch porcji 1 mL 0.1 % TFA. Załadować próbkę. Płukać dwukrotnie za pomocą 1 mL 0.1 %TFA. Eluować peptydy do probówek mikrowirówkowych za pomocą 400 ?L 70% acetonitrylu. 6. Odparować próbkę do sucha na drodze wirowania próżniowego a następnie zawiesić z medium rozdzielającym do FFE. [0227] Medium rozdzielające oraz media stabilizujące badano z zastosowaniem BD? Free Flow Electrophoresis System i metody FFIEF, wykorzystując roztwór kontroli jakości. Aparat złożono w sposób uwzględniający dziewięć wlotów dla mediów (E1-E9) i cztery wloty dla próbek (S1-S4). Anodowe medium stabilizujące doprowadzono do wlotu E1. Katodowe medium stabilizujące wprowadzono do wlotu E9 a próbkę wprowadzono poprzez wlot dla próbki S2. Całkowity czas elektroforezy wynosił około 10 minut. Przyłożone napięcie wynosiło 550V a natężenie wynosiło 112 mA. Przepływ próbki i mediów ustalono na poziomie odpowiednio 2.5 ml/h oraz 150 ml/h. [0228] Anodowe media stabilizujące: 1567 mM HAc, 450 mM TRIS (pH = 4.09; przewodność: 6550 ?S/cm) (E1); [0229] Katodowe medium stabilizujące: 450 mM HAc, 900 mM TRIS (pH = 8.35; przewodność: 8360 ?S/cm) (E9); [0230] Medium rozdzielające: 150 mM HAc, 25 mM TRIS, 100 mM betainy (pH = 3.98; przewodność: 1563 ?S/cm) (E2); 10 mM TRIS + 300 ?l HAc w 300 ml (pH=4.85; przewodność= 622 ?S/cm) (E3-E5); 10 mM HAc + 260 mg TRIS w 200 ml (pH = 6.4, przewodność = 667 PZ/1765/AR 49 EP 2 167 951 B1 ?S/cm) (E6-E7); 150 mM HAc, 150 mM TRIS + 560 mg TRIS w 100 ml (pH = 7.82;przewodność: 6730 ?S/cm) (E8); [0213] pH każdej z frakcji FFE określono przy użyciu elektrody pH i przedstawiono na wykresie na FIG.6. Zabarwione markery pI poddano separacji w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja frakcji przy długości fali ?=420 nm, 515 nm oraz 595 nm, reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI została przedstawiona na FIG.6. [0232] Frakcję 42 zebrano i pominąwszy dodatkowe etapy porządkowania, poddano późniejszej analizie LC-MS/MS. 100 ?l zebranej frakcji FFE z zastosowaniem SpeedVac odparowano do sucha i rozpuszczono w 25 ?l 0.1% TFA. Objętość 5 ?l wykorzystano podczas eksperymentu LC-MS/MS. Analizy LC-MS/MS na bazie ESI (HCTultra, Bruker, Bremen, Germany) prowadzono z zastosowaniem nanopompy Agilent 1100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) w kolumnie mikrokapilarnej z odwróconą fazą o wymiarach 75 ?m x 15 cm, wypełnionej krzemionką (Agilent). Objętość próbki naniesiono na kolumnę wstępną (kolumna z odwróconą fazą (C18) o wymiarach 300 ?m x 0.5 cm od Agilent) o przepływie 10 ?l/min przez 5 minut z zastosowaniem mikroprzepływowej CapPump (Agilent). Po załadowaniu próbki, próbkę rozdzielono i analizowano w przepływie 200 nl/min w gradiencie od 2 % B do 40 % B przez 30 minut. Kolumna była bezpośrednio połączona z igłą natryskującą New Objective (Woburn, MA, USA). Fazę ruchomą A stanowił 0.1% kwas mrówkowy a fazę mobilną B 100% acetonitryl. Peptydy eluowane z kolumny kapilarnej selekcjonowano pod kątem CID za pomocą spektrometru mas, wykorzystując protokół zmienny oparty od jeden skan MS (300-1500 m/z) do trzech skanów MS/MS. Trzy najliczniej występujące podczas każdego skanu jony prekursorowe wytypowano do CID, jeśli intensywność piku dla jonu prekursorowego przekraczała 10000 jednostek jonowych. Napięcie elektrospreju ustalono na poziomie 1.8 kV a specyficzną wartość m/z dla peptydu pofragmentowanego podczas CID wyłączono z ponownej analizy na 2 minuty. Pik podstawowy chromatogramu otrzymany podczas eksperymentu LC-MS/MS przedstawiono na FIG.7. Dla każdego widma MS/MS przeszukano w bazie danych IPI Human, nr publikacji 3.18. Lista białek zidentyfikowanych we frakcji 42 otrzymanej podczas FFE została przedstawiona w Tabeli 1. TABELA 1 Białka zidentyfikowane podczas analizy LC-MS/MS 42 frakcji FFE Izoforma 1 białka pokrewnego białkom szoku cieplnego o masie 71 kDa Białko szoku cieplnego 1A o masie 70 kDa PZ/1765/AR Białko hipotetyczne 50 EP 2 167 951 B1 Białko stresu 70, prekursor mitochondrialny Filamina A, alfa Aktyna, cytoplazmatyczna 1 Kofilina-1 Izoforma 1 syntazy karbamoilofosforanu Eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 4B Izomeraza glukozo-6-fosforanu Enzym aktywujący ubikwitynę E1 Izoforma M1 izozymów M1/M2 kinazy pirogronianowej Czynnik elongacyjny 1-delta Aldolaza A fruktozo-difosforanu Białko 5 typu tioredoksyny Dehydrogenaza mleczanowa A Faszyna Łańcuch tubuliny beta-2 Białko 1 wewnątrzkomórkowych kanałów chlorkowych Wielofunkcyjne białko ADE2 OTTHUMP00000021786 Transketolaza Białko 14-3-3 dzeta/delta Alfa-aktynina 1 Ubikwityna i prekursor białka rybosomalnego S27 Składnik E1 podjednostki alfa dehydrogenazy pirogronianowej Izoforma b białka wiążącego poli(rC) 2 Czynnik elongacyjny 1-gamma PRZEWIDYWANE: podobne do izomerazy A peptydyloprolilu Transportyna 1 Kinaza A difosforanów nukleozydów Dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa, dekarboksylatyna (decarboxylatin) Białko szoku cieplnego 4 o masie 70 kDA Motyw TPR bogaty w glutaminę Alfa-aktynina 4 PZ/1765/AR 51 Heterogeniczny rybonukleoproteid jądrowy A1 Mózgowe białko rozpuszczalne w kwasie 1 Podjednostka importyny beta-1 Izoforma 1 jądrowego białka autoimmunogennego spermy Białko szoku cieplnego 60 Izoforma 1 serpiny B13 Składnik U5 niewielkiego rybonukleoproteidu jądrowego o masie 116 kDa Podjednostka beta białka kompleksu T 1 Izoforma 1 białka hipotetycznego LOC64423 Białko S100-A11 Homolog B białka naprawczego delecje UV RAD23 Izoforma 1 ekspresjonowana hematologicznie i neurologicznie PRZEWIDYWANE: podobne do izoformy rybosomalnego białka S3a EP 2 167 951 B1 PRZYKŁAD 5: Rozdział FFE poprzedzający analizę ludzkiego osocza techniką MALDITOF [3951] [0233] Medium rozdzielające oraz media stabilizujące badano z zastosowaniem BD? Free Flow Electrophoresis System i metody FFIEF, wykorzystując roztwór kontroli jakości. Aparat złożono w sposób uwzględniający dziewięć wlotów dla mediów (E1-E9) i cztery wloty dla próbek (S1-S4). Anodowe medium stabilizujące doprowadzono do wlotu E1. Katodowe medium stabilizujące wprowadzono do wlotu E9 a próbkę wprowadzono poprzez wlot dla próbki S2. Całkowity czas elektroforezy wynosił około 10 minut. Przyłożone napięcie wynosiło 500V a natężenie wynosiło 81 mA. Przepływ próbki i mediów ustalono na poziomie odpowiednio 3.0 ml/h oraz 150 ml/h. [0234] Anodowe media stabilizujące: 1567 mM HAc, 450 mM TRIS (pH = 4.09; przewodność: 8880 ?S/cm) (E1); [0235] Katodowe medium stabilizujące: 450 mM HAc, 900 mM TRIS (pH = 8.32; przewodność: 8360 ?S/cm) (E9); [0236] Medium rozdzielające: 150 mM HAc, 25 mM TRIS, 100 mM betainy (pH = 3.94; przewodność: 1456 ?S/cm) (E2); 10 mM TRIS + 300 ?l HAc w 300 ml (pH = 4.85; przewodność = 630 ?S/cm) (E3-E5); 10 mM HAc + 230 mg TRIS w 200 ml (pH = 6.42, przewodność: 603 PZ/1765/AR 52 EP 2 167 951 B1 ?S/cm) (E6-E7); 150 mM HAc, 150 mM TRIS + 560 mg TRIS w 100 ml (pH = 7.82; przewodność: 6800 ?S/cm) (E8). [0213] pH każdej z frakcji FFE określono przy użyciu elektrody pH i przedstawiono na wykresach na FIG.8. Zabarwione markery pI poddano separacji w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja każdej frakcji przy długości fali ?=420nm, 515nm oraz 595 nm, reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI została przedstawiona na FIG.8. [0238] Żele SDS dla kilku frakcji barwione srebrem przedstawiające rozdział białek z ludzkiego osocza przedstawiono na FIG.9. Widmo MALDI-TOF dla frakcji 53 ujawniono na FIG. 10. Na widmie można zidentyfikować kilka pików dla szerokiego zakresu masy, każdy reprezentujący pojedyncze białko. Najprawdopodobniej kilka tych pików wywodzi się od adiponektyny o masie monomeru wynoszącej około 28kDa. PRZYKŁAD 6: rozdział liofilizowanego ekstraktu białek osy w warunkach natywnych [4176p3] [0239] Medium rozdzielające oraz media stabilizujące badano z zastosowaniem BD? Free Flow Electrophoresis System i metody FFIEF, wykorzystując roztwór kontroli jakości. Aparat złożono w sposób uwzględniający dziewięć wlotów dla mediów (E1-E9) i cztery wloty dla próbek (S1-S4). Anodowe medium stabilizujące doprowadzono do wlotu E1. Katodowe medium stabilizujące wprowadzono do wlotu E9 a próbkę wprowadzono poprzez wlot dla próbki S3. Całkowity czas elektroforezy wynosił około 10 minut. Przyłożone napięcie wynosiło 550V a natężenie wynosiło 85 mA. Przepływ próbki i mediów ustalono na poziomie odpowiednio 1.5 ml/h oraz 150 ml/h. [0240] Anodowe medium stabilizujące: 100 mM DEA, 46 mM kwasu pikolinowego (pH=6.0; przewodność: 4350 ?S/cm) (E1); [0241] Katodowe medium stabilizujące: 149 mM DEA, 100 mM kwasu pikolinowego (pH=9,50; przewodność: 3850 ?S/cm) (E8+E9); [0242] Medium rozdzielające: Wlot Mediów Media E2 E3 E4 E5 E6 E7 10 mM DEA 4,6 mM Kwasu pikolinowe 10 mM DEA xmM DEA* xmM DEA* xmM DEA* xmM DEA* xmM Kwasu pikolinoweg 10 mM Kwasu pikolinowe 10 mM Kwasu pikolinowe 10 mM Kwasu pikolinowe 10 mM Kwasu pikolinowe PZ/1765/AR go pH Przewodno ść (?S/cm) 6.0 550 o* 7.0 574 53 go 7.8 589 go 8.5 592 go 9.2 EP 2 167 951 B1 go 9,5 597 599 *: Roztwory miareczkowano do uzyskania wymienionego pH albo DEA lub kwasem pikolinowym, pomiary pH wykonywano za pomocą elektrody pH [0243] pH każdej z frakcji FFE określono przy użyciu elektrody pH i przedstawiono na wykresie na FIG.11. Zabarwione markery pI poddano separacji w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja frakcji przy długości fali ?=420 nm, 515 nm oraz 595 nm, reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI została przedstawiona na FIG.11. [0244] Żele SDS dla kilku frakcji barwione srebrem przedstawiające rozdział liofilizowanych białek osy przedstawiono na FIG.12. PRZYKŁAD 7: Rozdział surowicy python sebae prowadzony w obecności i bez użycia PPS [0245] Surowicę pobrano od python sebae. Próbkę surowicy rozcieńczono w stosunku 1:10 w medium rozdzielającym. Medium rozdzielające zawierało jedynie składniki buforowe dobrze znane ze swej kompatybilności z MALDI-TOF. Dodatkowo, jeden eksperyment przeprowadzono z PPS, rozszczepialnym detergentem kompatybilnym z MALDI-TOF, dodanym do próbki jak również do medium rozdzielającego. [0246] Rozdział próbki prowadzono w BD? Free Flow Electrophoresis System, wykorzystując metodę swobodnego ogniskowania izoelektrycznego (FF-IEF). Aparat złożono w sposób uwzględniający dziewięć wlotów dla mediów (E1-E9) i cztery wloty dla próbek (S1-S4). Anodowe medium stabilizujące doprowadzono do wlotu E1. Katodowe medium stabilizujące doprowadzono do wlotu E9 a próbkę wprowadzono poprzez wlot dla próbki S2. Przyłożone napięcie wynosiło 550V a natężenie wynosiło 105 mA Przepływ próbki i mediów ustalono na poziomie odpowiednio 2 ml/h oraz 150 ml/h. [0247] Media rozdzielające i stabilizujące w aparacie do FFE: Wlot Mediów Media E2 150 mM HAc/ 25 mM Tris/ E3 E4 E5 E6 E7 E8 100 ml 150 mM HAc/ 150 mM 300 ml 10 mM Tris/300 ?l HAc 200 ml 10 mM HAc/ 260 mg Tris PZ/1765/AR 100 mM betainy pH Przewodność (?S/cm) 3.95 1475 4.85 622 54 EP 2 167 951 B1 Tris/ 560 mg Tris 7.08 611 7.78 6800 [0248] Anodowe medium stabilizujące: 1567 mM HAc/ 450 mM TRIS (pH = 4.11; przewodność: 6610 ?S/cm) (E1) [0249] Katodowe medium stabilizujące: 450 mM HAc, 900 mM TRIS (pH = 8.23; przewodność: 6220 ?S/cm) (E9) [0250] Medium przeciwprzepływowe: Woda (CF1-CF3) [0251] Powyżej opisane media rozdzielające są lotnymi mediami rozdzielającymi, tzn. składniki buforowe są albo kompatybilne z MS, albo mogą być przed analizami MS usunięte poprzez odparowanie. [0252] Podczas obu eksperymentów zebrano 96 frakcji. 0.2 mL każdej frakcji poddano SDSPAGE. Obrazy żeli SDS-PAGE (barwionych srebrem) dla co drugiej frakcji rozdzielanych próbek (jedna próbka zawierająca, jedna próbka niezawierająca PPS) przedstawiono na Figurze 13. [0253] Pomimo, że sposób rozdziału wygląda podobnie, w przypadku, gdy w medium rozdzielającym nie zastosowano detergentu, w komorze separacyjnej obserwowano pewną precypitację białka. Precypitacja była znacząco ograniczona gdy zastosowano w medium rozdzielającym 0.1 % PPS. [0254] Media rozdzielające pozbawione były glicerolu i innych składników, dla których wiadomym jest, że interferują z pomiarami MALDI-TOF. Dlatego też, frakcja uzyskana podczas eksperymentu FFE może bezpośrednio być poddano analizie MALDI. Widmo masowe dla białka o masie 25 kDa pochodzącego z frakcji 26 przedstawiono na Figurze 14. PRZYKŁAD 8: Interwałowy rozdział FFE-ITP z zastosowaniem układu lotnych buforów A i układu nielotnych buforów B [0255] Medium rozdzielające oraz media stabilizujące badano z zastosowaniem BD? Free Flow Electrophoresis System i metody FFIEF, wykorzystując roztwór kontroli jakości. Aparat złożono w sposób uwzględniający dziewięć wlotów dla mediów (E1-E8) i cztery wloty dla próbek (S1-S4). Anodowe medium stabilizujące doprowadzono do wlotu E1. Katodowe medium stabilizujące wprowadzono do wlotu E8 a próbkę wprowadzono poprzez wlot próbki do regionu oddzielającego. FFE-ITP przeprowadzono według zmodyfikowanego protokołu ITP ujawnionego w PCT/EP2007/061840, który jest tutaj w całości włączony. Całkowity czas elektroforezy wynosił około 25 minut. Przyłożone napięcie wynosiło 500V a natężenie wynosiło PZ/1765/AR 55 EP 2 167 951 B1 20 mA. Przepływ dla próbki i mediów ustalono na poziomie odpowiednio 1.5 ml/h oraz 150 ml/h. Cykl prowadzono metodą interwałowej FF-ITP w przepływie 80 ml/h a frakcjonowaną próbkę eluowano stosując przepływ 150 ml/h. [0256] Stabilizujący lider zawierający 100 mM HCl, 200 mM amidu kwasu izonikotynowego (pH=3.4; przewodność: 8060 ?S/cm) wprowadzono poprzez wlot E1. Mniej zatężony lider złożony z HCl (10 mM) i amidu kwasu izonikotynamidowego (20mM) wprowadzono do wlotów od E2 do E5. Lotną kompozycję rozdzielającą zawierającą 6 mM kwasu mrówkowego, 8mM kwasu octowego, 8mM kwasu propionowego, 6 mM kwasu masłowego, 6 mM kwasu piwalinowego oraz 34 mM kwasu e-aminokapronowego (EACA) jak również 34 mM pirydynoetanolu (pH 5.26) doprowadzono do wlotu E6. Rozcieńczony roztwór zatrzymujący zawierający NaOH (10 mM) i kwas e-pirydynoetanosulfonowy (PES) (20 mM) doprowadzono do wlotu E7, i nierozcieńczony roztwór zatrzymujący zawierający NaOH (100 mM) i po rozdziale elektroforetycznym, próbkę i media eulowano do zbiorników frakcji, a frakcje analizowano. [0257] pH każdej z frakcji FFE określono przy użyciu elektrody pH i przedstawiono na wykresie na FIG.15. Zabarwione markery pI poddano separacji w celu określenia wydajności procesu rozdziału uzyskanego za pomocą układu. Absorbancja frakcji przy długości fali ?=420 nm, 515 nm oraz 595 nm, reprezentująca absorbancję odpowiadających markerów pI została przedstawiona na FIG.15. Figura przedstawia rozdział markerów pI w strefie oddzielającej. PZ/1765/AR 56 EP 2 167 951 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób analizy analitów obejmujący a) rozdział analitów drogą elektroforezy swobodnej (FFE) wykorzystującej wodne medium rozdzielające do rozdziału analitów metodą elektroforezy swobodnej, zawierające przynajmniej jeden kwas buforowy i jedną zasadę buforową, przy czym każdy z kwasów buforowych i zasad buforowych jest lotny w warunkach roboczych spektrometrii mas, przy czym opcjonalnie medium rozdzielające jest dostarczane w formie zestawu; oraz b) następującą kolejno analizę co najmniej jednego analitu, będącego przedmiotem zainteresowania, otrzymanego podczas rzeczonego etapu a) rozdziału FFE. znamienny tym, że rzeczona następująca kolejno analiza jest analizą spektrometrii mas wybraną spośród grupy obejmującej jonizację elektrosprejem (electrospray ionization, ESI), powierzchniowo wzmocnioną laserową desorpcję/ jonizację (surface-enhanced laser desorption/ionization, SELDI), jonizację przez desorpcję laserową w matrycy (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI lub MALDITOF-MS(/MS)) oraz LC-MS(/MS). 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że medium jest medium binarnym zawierającym wyłącznie jeden kwas buforowy i jedną zasadę buforową; oraz opcjonalnie, gdzie przynajmniej jeden kwas buforowy wybrany jest spośród grupy obejmującej kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas pikolinowy, diacetyloaceton, o-, m- i p- krezol, o-, m- and pchlorofenole, hydroksypirydyny, fluorowane alkohole i związki karbonylowe takie jak trifluoroetanol, tetrafluoropropanol, tetrafluoropropanol, tetrafuloroaceton, i/lub gdzie przynajmniej jedna zasada buforowa wybrana jest spośród grupy obejmującej TRIS, hydroksypirydyny, amid kwasu izonikotynowego, karbinole pirydynowe, dietanoloaminy, benzyloaminy, pirydynoetanol i dimetyloaminopropionitryl. 3. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 2 znamienny tym, że medium rozdzielające jest w znaczącym stopniu wolne od HPMC, mocznika, glicerolu i/lub PEG-u. 4. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że rozdział analitów metodą elektroforezy swobodnej prowadzony jest w warunkach natywnych. 5. Sposób według dowolnego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że co najmniej jedno medium rozdzielające i/lub próbka zawiera przynajmniej jeden obojnaczy lub niejonowy anionowy PZ/1765/AR 57 EP 2 167 951 B1 surfaktant kompatybilny z MS; przy czym korzystnie przynajmniej jeden obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS, jest surfaktantem rozszczepialnym. 6. Sposób według zastrz. 5 znamienny tym, że przynajmniej jeden obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS jest surfaktantem rozszczepialnym, a medium przeciwprzepływowe zawierające czynnik rozszczepiający wchodzi w kontakt i/lub jest mieszane z frakcją zawierającą rozszczepialny surfaktant i co najmniej częścią próbki po rozdziale elektroforetycznym; lub gdzie medium przeciwprzepływowe jest stosowane w celu stabilizacji rozszczepialnego surfaktantu zawartego po rozdziale metodą elektroforezy swobodnej w przynajmniej jednej frakcji oraz gdzie, opcjonalnie, ugrupowanie rozszczepionego rozszczepialnego surfaktantu jest usuwane na drodze filtracji, wirowania lub odparowania. 7. Sposób według dowolnego spośród zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że obejmuje: utworzenie pomiędzy elektrodami aparatu, odpowiedniego dla elektroforezy swobodnej, strefy rozdziału obejmującej strefę A utworzoną przez co najmniej jedno buforowe medium rozdzielające (SBM) typu A, przy czym rzeczone SBM typu A jest lotnym medium rozdzielającym zdefiniowanym według dowolnego spośród zastrzeżeń 1 do 6 oraz strefę B utworzoną przez co najmniej jedno buforowe medium rozdzielające typu B, przy czym układ buforowy jest układem buforów nielotnych, pomiędzy anodą i katodą; gdzie rzeczona strefa A jest umiejscowiona w strefie rozdziału w taki sposób, że co najmniej jeden analit będący przedmiotem zainteresowania może być eluowany ze strefy rozdziału w rzeczonej strefie A; rozdział analitów w próbce wprowadzonej do rzeczonego aparatu odpowiedniego dla elektroforezy swobodnej; oraz elucję co najmniej jednego analitu będącego przedmiotem zainteresowania ze strefy rozdziału w SBM typu A. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że próbka wprowadzana jest do rzeczonego aparatu do strefy A lub do strefy B; przy czym wszystkie anality będące przedmiotem zainteresowania są eluowane ze strefy rozdziału w SBM typu A; opcjonalnie, gdzie, rzeczone SBM typu A obejmuje co najmniej jeden obojnaczy lub niejonowy surfaktant kompatybilny z MS i gdzie co najmniej jedno SBM typu B obejmuje układ buforów wybrany spośród komercyjnie dostępnych amfolitów, binarnych układów buforowych kwas/zasada (medium A/B) lub układów wielokrotnych komplementarnych par buforowych (CMPBS). PZ/1765/AR 58 EP 2 167 951 B1 9. Sposób według dowolnego spośród zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że obejmuje etapy a) rozdziału analitów w próbce wprowadzonej do aparatu odpowiedniego dla elektroforezy swobodnej; b) elucji analitu (analitów) otrzymanego podczas etapu rozdziału FFE do wielu frakcji; c) zebranie przynajmniej jednej frakcji zawierającej analit (anality) będący (e) przedmiotem analizy; oraz d) poddanie przynajmniej jednej frakcji rzeczonej późniejszej analizie, gdzie rzeczone frakcje nie wymagają dodatkowych etapów porządkowania lub oczyszczania przed rzeczoną późniejszą analizą. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że rzeczona późniejsza analiza jest spektrometrią mas wykorzystującą technikę jonizacji przez desorpcję laserową z wykorzystaniem matrycy (MALDI), oraz i) gdzie składnik matrycy dla analizy MALDI dodawany jest do roztworu buforowego zebranego analitu przed analizą spektrometrii mas; lub ii) gdzie medium rozdzielające zastosowane podczas etapu rozdziału FFE zawiera przynajmniej jeden składnik buforowy, który może stanowić matrycę podczas analizy MALDI i gdzie pozostałe składniki buforowe są lotne w warunkach roboczych spektrometrii mas MALDI; lub iii) gdzie składnik matrycy dla analizy MALDI dodawany jest do roztworu buforowego zebranego analitu przed analizą spektrometrii mas i gdzie medium rozdzielające zastosowane podczas etapu rozdziału FFE zawiera przynajmniej jeden składnik buforowy, który może stanowić matrycę podczas analizy MALDI i gdzie pozostałe składniki buforowe są lotne w warunkach roboczych spektrometrii mas MALDI. 11. Sposób według zastrz. 9 lub zastrz. 10 dodatkowo obejmujący etap dodatku do przynajmniej jednej frakcji otrzymanej podczas etapu rozdziału FFE, czynnika obniżającego masę molekularną analitów, które mają być poddane rzeczonej późniejszej analizie; gdzie korzystnie analit (y) jest (są) głównie białkiem (białkami) lub peptydem (peptydami), i gdzie czynnikiem obniżającym masę cząsteczkową analitu (analitów) jest proteaza lub mieszanina proteaz; lub gdzie analit (y) jest (są) nukleotydem (nukleotydami) i gdzie czynnikiem obniżającym masę cząsteczkową analitu (analitów) jest nukleaza lub mieszanina nukleaz. PZ/1765/AR 59 EP 2 167 951 B1 12. Sposób według dowolnego spośród zastrz. 9 do 12, dodatkowo obejmujący etap usunięcia przynajmniej części rozpuszczalnika i lotnych składników buforowych przed rzeczoną późniejszą analizą; gdzie korzystnie usunięcie następuje na drodze wirowania próżniowego lub liofilizacji. 13. Sposób według dowolnego spośród zastrz. 9 do 12, znamienny tym, że metoda prowadzona jest z pominięciem etapu oczyszczania, mającego na celu usunięcie surfaktantów lub ugrupowań rozszczepionych rozszczepialnych surfaktantów, wybranego spośród grupy obejmującej dializę, chromatografię, chromatografię odwróconej fazy, chromatografię jonowymienną, wymianę surfaktantu, precypitację białka, chromatografię powinowactwa, elektro- blotting, ekstrakcję fazową w układzie ciecz- ciecz oraz ekstrakcję fazową w układzie ciało stałe- ciecz i ich kombinacje. 14. Sposób według dowolnego spośród zastrz. 9 do 13, znamienny tym, że przynajmniej jeden kwas buforowy medium rozdzielającego jest kwasem octowym; lub gdzie przynajmniej jedną zasadą buforową medium rozdzielającego jest TRIS; lub gdzie medium rozdzielające obejmuje binarny układ buforowy złożony z kwasu octowego i TRIS; gdzie korzystnie stężenia kwasu octowego i TRIS są dobierane indywidualnie od 1 mM do około 200 mM, korzystnie od około 2 mM do około 100 mM i najkorzystniej od około 5 do około 50 mM. 15. Sposób według dowolnego spośród zastrz. 1 do 14, znamienny tym, że anality rozdzielane podczas rzeczonego etapu FFE i poddawane analizie podczas rzeczonej późniejszej analizy są biocząstkami, biopolimerami lub biocząsteczkami; gdzie korzystnie biocząstki, biopolimery lub biocząsteczki poddawane rozdziałowi i analizie wybrane są spośród grupy obejmującej białka, agregaty białek, peptydy, hormony, kompleksy DNA- białko takie jak chromatyna, DNA, przeciwciała, komórki, organella komórkowe, wirusy, cząstki wirusowe, błony, fragmenty błon, lipidy, cukry, wielocukry, liposomy, nanocząstki i ich mieszaniny. 16. Sposób według dowolnego spośród zastrz. 1 do 15 znamienny tym, że rozdział analitów następuje na drodze swobodnego ogniskowania izoelektrycznego (free flow isoelectric focusing, FF-IEF), swobodnej izotachoforezy (free flow isotachophoresis, FF-ITP) lub swobodnej elektroforezy strefowej (free flow zone electrophoresis, FF-ZE). PZ/1765/AR 60 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 61 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 62 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 63 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 64 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 65 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 66 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 67 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 68 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 69 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 70 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 71 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 72 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 73 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 74 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 75 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 76 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 77 EP 2 167 951 B1 PZ/1765/AR 78 EP 2 167 951 B1 LITERATURA CYTOWANA W OPISIE Lista cytowanych odniesień literaturowych została przedstawiona wyłącznie dla wygody czytelnika. Nie stanowi ona części dokumentu Patentu Europejskiego. Pomimo, że podczas zestawiania listy odniesień literaturowej dołożono wszelkich starań, nie można wykluczyć błędów i pominięć, a EPO nie ponosi w tym względzie żadnej odpowiedzialności. Dokumenty patentowe cytowane w opisie: ? US 5275706 A [0007] [0060] ? US 6328868 B [0008] [0060] [0062] ? WO 2008025806 A [0009] [0060] [0064] ? WO 0250524 A [0010] ? US 5447612 A, Bier [0011] ? US 7169278 B [0055] ? WO 2008087218 A [0055] ? US 2004050697 A [0060] ? US 2004050698 A [0060] ? US 2004045826 A [0060] ? US 2004026251 A [0060] ? WO 2008053047 A [0060] ? WO 2006047614 A [0111] ? US 20040101973 A [0200] ? EP 1320747 A [0200] ? EP 2007061840 W [0255] Literatura nie będąca dokumentem patentowym cytowana w opisie: ? Analytical Biochemistry. Addison Wesley Longman Limited, 1998 [0003] ? Krivanova L. ; Bocek P. Continuous free-flow electrophoresis. Electrophoresis, 1998, vol. 19, 1064-1074 [0005] ? Bondy B. et al. Sodium chloride in separation medium enhances cell ? Bier et al. Electrophoresis, 1989, vol. 10 (10), 690-697 [0011] ? Nath et al. Biotechnology and Bioengineering, 1996, vol. 51 (1), 15-22 [0011] ? Davidsson P. et al. Anal. Chem., 1999, vol. 71, 642-647 [0016] ?Königsberg, WH ; Henderson, L. Meth. Enzymol., 1983, vol. 91, 254-259 [0016] ? Chirgwin, J. M. et al. Biochemistry, 1979, vol. 18, 5294-5299 [0016] compatibility of free-flow electrophoresis. Electrophoresis, 1995, vol. 16, 92-97 [0006] ? Free-flow Electrophoresis. K. Hannig and K. H. Heidrich [0011]
















































































ANKIETA

Jak oceniasz nowe technologie na mundialu?

Grupy dyskusyjne