Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyPL 207263 B1
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent PL 207263 B1


PL 207263 B1

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL 207263 (13) B1 (11) (51) Int.Cl. C12N 15/62 (2006.01) C07K 14/525 (2006.01) A61K 31/70 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (21) Numer zgłoszenia: 362670 (22) Data zgłoszenia: 13.02.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej 13.02.2001, PCT/EP01/001543 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 23.08.2001, WO01/61017 (54) Zmodyfikowane cytokiny do stosowania w leczeniu raka oraz cDNA (30) Pierwszeństwo: (73) Uprawniony z patentu: 15.02.2000, IT, MI2000A000249 FONDAZIONE CENTRO SAN RAFFAELE DEL MONTE TABOR, Milano, IT (43) Zgłoszenie ogłoszono: (72) Twórca(y) wynalazku: 02.11.2004 BUP 22/04 ANGELO CORTI, Milano, IT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.11.2010 WUP 11/10 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PL 207263 B1 2 PL 207 263 B1 Opis wynalazku Obecny wynalazek dotyczy zmodyfikowanych cytokin do stosowania w leczeniu raka. W szczególności wynalazek dotyczy pochodnych cytokin zdolnych do ?samonaprowadzania? na naczynia guzów i komórki prezentujące antygeny. Działalność przeciwnowotworowa pewnych cytokin jest dobrze znana i opisana. Niektóre cytokiny były już stosowane terapeutycznie także u ludzi (29). Na przykład takie cytokiny jak interleukina-2 (IL-2) i interferon ? (IFN?) wykazały dodatnie działanie przeciwnowotworowe u pacjentów z różnymi typami guzów, takich jak przerzutujący rak nerek, białaczka kosmatokomórkowa, mięsak Kaposiego, czerniak, szpiczak mnogi, i tym podobne. Inne cytokiny takie, jak IFN?, czynnik martwicy nowotworów (TNF) ?, TNF?. IL-1, 4, 6, 12, 15 i Czynniki stymulujące kolonie (CSF) wykazały pewną aktywność przeciwnowotworowa na pewnych typach guzów, tak więc są przedmiotem dalszych badań. Ogólnie terapeutyczne zastosowanie cytokin jest silnie ograniczone przez ich toksyczność ogólnoustrojową. TNF, na przykład, był początkowo ujawniony ze względu na zdolność do indukcji krwotocznej nekrozy pewnych guzów (1) oraz ze względu na efekt cytotoksyczny in vitro na różne linie guzów (2), ale następnie okazał się mieć silną aktywność prozapalną, która może, w przypadku warunków nadprodukcji, niebezpiecznie wpływać na ludzki organizm (3). Jako że toksyczność ogólnoustrojowa jest podstawowym problemem ze stosowaniem farmakologicznie czynnych ilości % cytokin u ludzi, nowe pochodne i strategie terapeutyczne są obecnie oceniane w celu zmniejszenia efektów toksycznych tej klasy efektorów biologicznych zarazem utrzymując ich skuteczność terapeutyczną. Niektóre nowe podejścia są skierowane na: a) opracowanie białek fuzyjnych, które dostarczają TNF do guza i zwiększają stężenia lokalne. Na przykład, wyprodukowano białka fuzyjne złożone z TNF i przeciwciał specyficznych wobec guza (4); b) opracowanie mutantów TNF zachowujących aktywność przeciwnowotworową, a mają obniżoną toksyczność ogólnoustrojową. Tak więc przygotowano już mutanty zdolne do selektywnego rozpoznawania tylko jednego receptora (p55 lub p75) (5); c) zastosowanie przeciwciał anty-TNF zdolnych do redukcji pewnych efektów toksycznych TNF bez upośledzania jego aktywności przeciwnowotworowej. Takie przeciwciała były już opisane w literaturze (30); d) zastosowanie pochodnych TNF z dłuższych okresem półtrwania (na przykład TNF koniugowanych z glikolem polietylenowym). Niedawno opisano wytwarzanie pochodnych TNF zdolnych do selektywnego adresowania miejsc guzów. Na przykład opisano białko fuzyjne uzyskane przez fuzję genu łańcucha ciężkiego mAb anty-receptor transferyny i genu TNF (4) lub białko fuzyjne TNF z regionem ?zawiasowym? monoklonalnego przeciwciała skierowanego przeciwko antygenowi związanemu z guzem TAG72 (6) lub białko fuzyjne Fv-TNF(6). EP 251 494 ujawnia system podawania czynnika diagnostycznego lub terapeutycznego, który obejmuje: przeciwciało skoniugowane z awidyną lub streptawidyną, czynnik zdolny do skompleksowania skoniugowanego przeciwciała i związek złożony z czynnika diagnostycznego lub terapeutycznego skoniugowanego z biotyną, które są podawane kolejno i odpowiednio opóźnione, tak by pozwolić na lokalizację czynnika terapeutycznego lub diagnostycznego przez interakcje biotyna-streptawidyna na komórce docelowej rozpoznawanej przez przeciwciało. Opisane czynniki terapeutyczne lub diagnostyczne obejmują chelaty metali, w szczególności chelaty radionuklidów i czynników przeciwnowotworowych o niskiej masie cząsteczkowej takie jak cis-platyna, doksorubicyna itd. EP 496 074 ujawnia sposób, który dostarcza kolejne podawanie biotynylowanego przeciwciała, awidyny lub streptawidyny i biotynylowanego czynnika diagnostycznego lub terapeutycznego. Choć czynniki cytotoksyczne jak rycyna są wymieniane generycznie, głównie ujawnione jest zastosowanie w odniesieniu do radioaktywnie znakowanych związków. WO 95/15979 ujawnia sposób lokalizacji wysoce toksycznych czynników na celach komórkowych, oparty na podawaniu pierwszego koniugatu zawierającego specyficzną docelową cząsteczkę koniugowaną z ligandem lub anty-ligandem, po czym następuje podanie drugiego koniugatu złożonego z toksycznego czynnika związanego z anty-ligandem lub ligandem. WO 99/13329 ujawnia sposób adresowania cząsteczki do angiogennych naczyń guza w oparciu o koniugację tej cząsteczki z ligandami receptorów NGR. Zasugerowano pewną liczbę cząsteczek PL 207 263 B1 3 jako możliwych kandydatów, ale tylko doksorubicyna jest opisana specyficznie. Nie ujawniono zastosowania ligandów receptorów NGR jako nośników cytokin do indukcji odpowiedzi odpornościowych. Obecnie w sposób zaskakujący stwierdzono, że wskaźnik terapeutyczny pewnych cytokin może być znacznie polepszony i ich właściwości immunoterapeutyczne mogą być zwiększone przez sprzęgnięcie z ligandem receptora aminopeptydazy-N (CD13). CD13 jest transbłonową glikoproteiną o masie 150 kDa, wysoce konserwowaną w różnych gatunkach. Jest wyrażana na normalnych komórkach jak również w liniach nowotworowych komórek szpiku, w angiogennym śródbłonku i na pewnych nabłonkach. Receptor CD13 jest na ogół identyfikowany jako receptor ?NGR? ponieważ jego peptydowe ligandy zawierają motyw aminokwasów ?NGR?. Według pierwszego aspektu wynalazek dostarcza produktu koniugacji cytokiny wybranej z TNF lub IFN? i ligandu receptora CD13. Ten ligand może być przeciwciałem lub jego fragmentem takim, jak Fab, Fv, jednołańcuchowy Fv, peptyd lub peptydomimetyk, a mianowicie peptydopodobna cząsteczka zdolna do wiązania receptora CD13, ewentualnie zawierać zmodyfikowane, niewystępujące w przyrodzie aminokwasy. Ligand jest korzystnie prostym lub cyklicznym peptydem zawierającym motyw NGR, taki jak CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, cykloCVLNGRMEC, lub cykloCNGRC, lub korzystniej peptyd CNGRC. Peptyd może być połączony bezpośrednio do cytokiny lub pośrednio przez przerywnik (ang. spacer), który może być pojedynczym aminokwasem, sekwencją aminokwasową lub resztą organiczną, taką jak 6-aminokaprylo-N-hydroksybursztynoimid. Procedury sprzęgania są znane specjalistom w dziedzinie i obejmują inżynierię genetyczną lub techniki syntezy chemicznej. Ligand peptydu jest korzystnie połączony z N-końcem cytokiny, w ten sposób minimalizując jakiekolwiek przeszkody w wiązaniu zmodyfikowanej cytokiny do jej receptora. Alternatywnie peptyd może być połączony z resztami aminokwasów, które są akceptorami wiązań amidowych lub karboksylowych naturalnie występującymi na cząsteczce lub sztucznie wstawionymi za pomocą technik inżynierii genetycznej. Zmodyfikowana cytokina jest korzystnie przygotowywana przez zastosowanie cDNA zawierającego przylegającą 5' sekwencję kodującą peptyd. Według korzystnego wykonania dostarczony jest produkt koniugacji między TNF i sekwencją CNGRC. Korzystniej N-koniec TNF jest połączony z peptydem CNGRC przez przerywnik G (glicyna). Powstały produkt (NGR-TNF) okazał się bardziej aktywny niż TNF na modelach zwierzęcych chłoniaka RMA-T. Ponadto, zwierzęta traktowane NGR-TNF były zdolne do odrzucania dalszych rakotwórczych dawek RMA-T lub komórek RMA. Zwiększenie aktywności przeciwnowotworowej w porównaniu z normalnym TNF mogło być obserwowane u immunokompetentych zwierząt, ale nie u zwierząt z niedoborem odporności. Wskazuje to, że zwiększenie działania przeciwnowotworowego TNF koniugowanego z peptydami ?NGR? jest wynikiem zwiększonej odpowiedzi odpornościowej, raczej niż bezpośredniej aktywności cytotoksycznej koniugatu. Wykazano także, że efekty odpornościowe in vivo indukowane przez NGR-TNF są bezpośrednio związane z receptorem CD13. Na przykład zaobserwowano, że przeciwciało przeciwko receptorowi CD13 jak i ligand CNGRC współzawodniczą z NGR-TNF in vivo, co sugeruje mechanizm adresowania receptora przez NGR-TNF. Można następnie poprawić wskaźnik terapeutyczny koniugatów TNF/ligand CD13 przez zastosowanie zmutowanej formy TNF zdolnej do selektywnego wiązania jednego z dwóch receptorów TNF, p75TNFR i p55TNFR. Taki mutant TNF może być uzyskany za pomocą mutagenezy ukierunkowanej (5, 7). Farmakokinetyka zmodyfikowanych cytokin według wynalazku może być poprawiona przez przygotowanie pochodnych glikolu polietylenowego, co pozwala na przedłużenie okresu półtrwania samych cytokin. Kolejne wykonanie wynalazku jest dostarczone przez bifunkcjonalne pochodne, w których cytokiny modyfikowane z ligandem CD13 są koniugowane z przeciwciałami lub ich fragmentami, skierowanymi przeciwko antygenom guza lub innym markerom angiogennym guza, np. integrynom ??, metaloproteazom lub naczyniowemu czynnikowi wzrostu, albo przeciwciałami lub ich fragmentami skierowanymi przeciwko składnikom macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak przeciwciała przeciwko tenascynie lub domenie EDB anty-fibronektyny. Niedawno opisano przygotowanie produktu fuzji między TNF i regionem zawiasowym mAb skierowanego przeciwko antygenowi związanemu z guzem TAG72 wyrażanemu przez gruczolakoraka żołądka i jajnika (6). Kolejne wykonanie wynalazku jest dostarczone przez wstępne adresowanie guza systemem biotyna/awidyna. Według tego podejścia uzyskuje się kompleks trzeciorzędowy w miejscu antygenowym guza w różnych stadiach, który jest tworzony przez 1) biotynylowane mAb, 2) awidynę (lub 4 PL 207 263 B1 streptawidynę) i 3) biwalentną cytokinę modyfikowaną ligandem CD13 i biotyną. W szeregu prac udowodniono, że podejście ze wstępnym adresowaniem w porównaniu z konwencjonalnym adresowaniem immunokoniugatów może faktycznie zwiększyć stosunek aktywnej cząsteczki naprowadzanej do celu uwolnienia aktywnej cząsteczki, w ten sposób zmniejszając toksyczność terapii (11, 10, 9, 8). To podejście dało korzystne wyniki z biotynylowanym TNF, który był zdolny do indukowania cytotoksyczności in vitro i zmniejszenia wzrostu komórek guza w warunkach, w których normalny TNF był nieaktywny (14, 26). Podejście ze wstępnym adresowaniem może być też przeprowadzane z dwufazową procedurą przez zastosowanie bispecyficznego przeciwciała, które w tym samym czasie wiąże antygen guza i zmodyfikowaną cytokinę. Zastosowanie bispecyficznego przeciwciała, które jest skierowane przeciwko antygenowi karcynoembrionalnemu i TNF było niedawno opisane jako sposób wstępnego adresowania TNF względem guza (31). Według kolejnego wykonania wynalazek obejmuje cząsteczkę TNF skoniugowaną zarówno z ligandem CD13 i przeciwciałem lub jego fragmentem (bezpośrednio lub pośrednio poprzez mostek biotyną-awidyna), na różnych podjednostkach TNF, przy czym przeciwciało lub jego fragmenty są skierowane przeciwko antygenowi wyrażanemu na komórkach guza lub innym składnikom zrębu guza, np. tenascynie i domenie EDB fibronektyny. To daje dalszą poprawę zdolności zmodyfikowanej cytokiny do naprowadzania na guza oraz poprawę w powolnym uwalnianiu tej ostatniej w mikrośrodowisku guza przez zmiany trimer-monomer-trimer. Jak wykazano w uprzednich pracach, w rzeczywistości modyfikowane podjednostki koniugatów TNF mogą dysocjować z adresujących kompleksów i ponownie asocjować tak, aby wytworzyć niezmodyfikowane trimerowe cząsteczki TNF, które następnie dyfundują w mikrośrodowisku guza. Wykazano, że uwalnianie bioaktywnego TNF zachodzi w ciągu 24-48 godzin po adresowaniu (21). Do zastosowania w terapii modyfikowane cytokiny według wynalazku będą odpowiednio formułowane w preparatach farmaceutycznych do podawania doustnego lub pozajelitowego. Preparaty do podawania pozajelitowego są korzystne i obejmują roztwory lub zawiesiny do zastrzyków i płyny do wlewów. W celu przygotowania form pozajelitowych skuteczna ilość aktywnego składnika będzie rozpuszczona lub zawieszona w sterylnym nośniku, ewentualnie z dodatkiem zarobek takich, jak solubilizatory, czynniki izotoniczności, środki konserwujące, stabilizatory, emulgatory lub środki dyspergujące, a następnie rozmieszczona w szczelnie zamkniętych fiolkach lub ampułkach. Przygotowane cytokin w postaci liposomów może poprawić ich biologiczną aktywność. W rzeczywistości obserwowano, że acylacja grup aminowych TNF indukuje zwiększenie jego hydrofobowości bez utraty aktywności biologicznej in vitro. Ponadto, doniesiono, że cytotoksyczność in vitro, oraz efekty immunomodulujące TNF związanego z lipidami nie ulegają zmianie, podczas gdy toksyczność in vivo ulega zmniejszeniu (12, 13). Maksymalna tolerowana dawka pojedyncza TNF u ludzi wynosi 218-410 ?g/m2 (32) i jest około 10 razy niższa niż jego skuteczna dawka u zwierząt. W oparciu o dane z modeli mysich uważa się, że przynajmniej 10 razy wyższa dawka jest konieczna dla uzyskania efektów przeciwnowotworowych u ludzi (15). W pierwszych badaniach klinicznych nad hipertermiczną perfuzją izolowanej kończyny, uzyskano wysokie częstości odpowiedzi z pojedynczą dawką 4 mg TNF w kombinacji z melfalanem i interferonem ? (16). Inne prace wykazały, że interferon y może być pominięty i nawet niższe dawki TNF mogą być wystarczające do indukcji odpowiedzi terapeutycznej (17, 18). Jako że dwie cytokiny wywierają działania synergistyczne na komórki śródbłonka, ich kombinowane, selektywne adresowanie do nich ma dużą szansę dać w efekcie silniejsze działanie przeciwnowotworowe, w ten sposób pozwalając na przezwyciężenie problemów toksyczności ogólnoustrojowej na ogół spotykane w leczeniu raka tymi samymi cytokinami jak te stosowanymi w kombinacji. Co więcej wiadomo, że TNF może zmniejszać funkcję bariery wyściółki śródbłonkowej naczyń, w ten sposób zwiększając ich przepuszczalność dla makrocząsteczek. Wykorzystując niższą toksyczność leczenia zmodyfikowanymi cząsteczkami według wynalazku i ich właściwości adresowania naczyń guzów, alternatywnym zastosowaniem jest ich wykorzystanie do zwiększenia przenikalności naczyń guza względem innych związków do celów terapeutycznych jak również diagnostycznych. Na przykład, modyfikowany TNF, może być zastosowany do zwiększenia pobierania przez guz radioaktywnie znakowanych przeciwciał lub hormonów (związki obrazujące guzy) w radioimmunoscyntygrafii lub radioimmunoterapii guzów. Alternatywnie pobieranie leków chemoterapeutycznych, immunotoksyn, liposomów niosących leki lub geny, lub inne leki przeciwnowotworowe też może być zwiększone, co spowoduje zwiększenie efektów przeciwnowotworowych. PL 207 263 B1 5 Tak więc cytokiny według wynalazku mogą być stosowane w kombinowanych, rozdzielonych lub kolejnych preparatach, także z innymi substancjami diagnostycznymi lub terapeutycznymi, w leczeniu lub diagnozowaniu raka. Ostatni aspekt wynalazku dotyczy cDNA kodującego koniugowane cytokiny według wynalazku, który może być przygotowany z cDNA cytokin przez dodanie przylegających sekwencji 5' lub 3' kodujących ligand CD13, korzystnie dla peptydów naprowadzających opisanych powyżej. Kombinowany cDNA może być stosowany jako taki lub po insercji do wektorów w celu zastosowania w terapii genowej. Preparatyka i zastosowania terapeutyczne odpowiednich wektorów są ujawnione w (19), które jest niniejszym włączone tu w postaci odniesienia. Opis figur Figura 1: Efekt TNF i NGR-TNF na wzrost chłoniaków RMA-T (a i b) i na wagę zwierząt (c i d). 5 zwierząt/grupę traktowano pojedynczą dawką TNF lub NGR-TNF dootrzewnowe (i.p.) 10 dni po implantacji guza. Z krzywych logarytmicznych interpolowano wartości powierzchni guza w dniu 14 jako funkcję dawki (b) i utratę wagi po terapii (średnie dni 11 i 12) (d). Efekty przeciwnowotworowe indukowane przez 1 ?g lub 9 ?g NGR-TNF w dniu 14 były większe niż indukowane przez porównywalne ilości TNF (P = 0,024 i P = 0,032, odpowiednio) podczas gdy utrata wagi po tych terapiach była podobna. Strzałki wskazują ekstrapolowane dawki TNF i NGR-TNF, które indukują podobne efekty. Figura 2: Efekt mAb R3-63 i CNGRC na aktywność przeciwnowotworowa NGR-TNF (a) i TNF (b) MAb R3-63 lub CNGRC mieszano z NGR-TNF lub TNF i podawano zwierzętom niosącym guzy RMA-T, 12 dni po implantacji (n=5 zwierząt/grupę). W oddzielnym eksperymencie (c) TNF i NGR-TNF podawano razem z CNGRC lub CARAC (peptyd kontrolny) zwierzętom niosącym 11-dniowe guzy (n = 5). Efekt przeciwnowotworowy 1 ?g NGR-TNF był silniejszy niż 9 ?g TNF (P = 0,009, t-test w dniu 20) i był znacząco hamowany przez CNGRC (P = 0,035) i przez mAB R3-63 (P = 0,011). Figura 3: Efekt ograniczonego trawienia trypsyną NGR-TNF i TNF na ich masę (a) i aktywność przeciwnowotworowa (b) Przygotowano trypsynę-agarozę przez połączenie 1 mg trypsyny do 1 ml aktywowanej CH Sepharose (Pharmacia-Upjohn) według instrukcji producenta. NGR-TNF i TNF (po 170 ?g każdego w 300 ?l 0,15 M chlorku sodu, 0,05 M fosforanu sodu, pH 7,3) zmieszano z 15 ?l zawiesiny żywicy (1:4) lub samym buforem i mieszano obracając w 37°C przez wskazaną ilość czasu. Cztery produkty przesączono przez urządzenie 0,22 ?m Spin-X (Costar, Cambridge, MA) i przechowywano w -20°C do użycia. (a) Analiza spektrometrii mas ze strumieniem elektronów. Wartości masy cząsteczkowej i odpowiadające produkty (sekwencje N-końcowe) są wskazane na każdym piku. Strzałki na sekwencjach wskazują miejsce cięcia, (b) Efekt 1 lub 3 ?g NGR-TNF i TNF inkubowanych bez (panele górne) lub z (panele dolne) trypsyną, na wzrost guzów RMA-T i wagę zwierząt (średnia?SE grup traktowanych dawkami 1 i 3 ?g). Zwierzęta traktowano 13 dni po implantacji guza (n=5 zwierząt/grupę). Figura 4: SDS-PAGE i aktywność przeciwnowotworowa ludzkiego NGR-TNF przed i po denaturacji/ponownym zwijaniu SDS-PAGE w warunkach nieredukujących (A) ludzkiego TNF (a), NGR-TNF przed (b) i po (c) procesie denaturacji/ponownego zwijania opisanego w Przykładzie V. Wpływ TNF i niezwiniętego ponownie NGR-TNF na wzrost chłoniaków RMA-T (B) i na wagę ciała (C). Wpływ ludzkiego TNF (D) i zwiniętego ponownie NGR-TNF (złożone z >95% trimerów z wewnątrzłańcuchowymi mostkami dwusiarczkowymi) (E) na wzrost guzów. Zwierzęta (15 lub 5 myszy/grupę jak wskazano w każdym panelu) traktowano jedną dawką i.p. TNF lub NGR-TNF 10 dni po implantacji guza. Następujące przykłady dalej ilustrują wynalazek Przykład I Przygotowanie mysiego TNF i NGR-TNF Mysi zrekombinowany TNF i Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNF (NGR-TNF) wytworzona w ekspresji cytoplazmatycznej cDNA w E. coli. cDNA kodujący mysi Met-TNFi-iss (20) przygotowano w reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) na mRNA wyizolowanym z komórek mysich monocytów-makrofagów RAW-264.7 stymulowanych lipopolisacharydem stosując 5'-CTGGATCCTCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3' i 5'-TGCCTCACATATGCTCAGATCATCTTCTC-3' jako startery 3' i 5'. Zamplifikowany fragment strawiono Ndel i BamHI (New England Biolabs, Beverley, MA) i sklonowano w pET-11b (Novagen, Madison, WI) uprzednio trawionym tymi samymi enzymami (pTNF). 6 PL 207 263 B1 cDNA kodujący Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-TNE1-156 zamplifikowano za pomocą PGR stosując 5'-GCAGATCATATGTGCAACGGCCGTTGCGGCCTCAGATCATCTTCTC-3' jako starter 5' i powyższy starter 3'. Zamplifikowany fragment strawiono i sklonowano w pET-11b jak opisano powyżej i zastosowano do transformacji komórek E. coli BL21(DE3) (Novagen). Ekspresja TNF i NGR-TNF była indukowana przez izopropylo-?-D-tiogalaktozyd według instrukcji producenta pETllb. Rozpuszczalny TNF i NGR-TNF odzyskano z dwulitrowych hodowli przez sonikację bakterii w 2 mM kwasie etylenodiaminotetraoctowym, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 po czym następowało wirowanie (15000 x g 20 min., 4°C). Oba ekstrakty zmieszano z siarczanem amonu (25% nasycenia) i pozostawiono przez 1 godz. w 4°C i wirowano dalej jak opisano wyżej. Siarczan amonu w supernatantach następnie doprowadzono do 65% nasycenia, pozostawiono w 4°C przez 24 godz. i dalej wirowano. Każdy osad rozpuszczono w 200 ml 1 M siarczanu amonu, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 i oczyszczono za pomocą chromatografii interakcji hydrofobowych na Phenyl-Seoharose 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elucja gradientem, bufor A: 50 mM fosforan sodu, pH 8,0 zawierający 1 M siarczan amonu; bufor B: 20% glicerol, 5% metanol, 50 mM fosforan sodu, pH 8,0). Frakcje zawierające materiał TNF-immunoreaktywny (na podstawie techniki Western) połączono, dializowano wobec 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 i dalej oczyszczono za pomocą chromatografii jonowymiennej na DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elucja gradientem, bufor A: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; bufor B: IM chlorek sodu, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0). Frakcje zawierające immunoreaktywność TNF połączono i oczyszczono za pomocą chromatografii żelowej na SephacrylS-3 00 HR (Pharmacia-Upjohn), wstępnie równoważonej i eluowanej 150 mM chlorkiem sodu, 50 mM buforem fosforanowym, pH 7,3 (PBS). Frakcje odpowiadające produktom 40000-50000 Mr łączono, rozporcjowano i przechowywano zamrożone w -20°C. Wszystkie roztwory stosowane w etapach chromatograficznych przygotowywano ze sterylnej wody wolnej od endotoksyn (Salf, Bergamo, Włochy). Ostateczne wydajności wynosiły 45 mg TNF i 34,5 mg NGR-TNF. Masa cząsteczkowa oczyszczonego TNF i NGR-TNF była mierzona za pomocą spektrometrii mas ze strumieniem elektronów. Zawartość białka mierzono stosując handlowy zestaw do oznaczania białka (Pierce, Rockford, IL.). Zawartość endotoksyny w NGR-TNF i TNF wynosiła 0,75 jednostek/?g i 1,3 8 jednostek/?g, odpowiednio jak mierzono za pomocą ilościowego chromogennego testu lizatu amebocytów (LAL) (BioWhittaker). Elektroforezę w siarczanie dodecylu - żelu poliakrylo-amidowym (SDS-PAGE) przeprowadzono stosując 12,5 lub 15% żele poliakryloamidowe za pomocą standardowych procedur. Niewielką ilość TNF i NGR-TNF dalej oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa na rozpuszczalnym receptorze p55-TNF (sTNF-RI)-Sepharose jak następuje: 5 mg zrekombinowanego sTNF-RI przygotowano jak opisano (22) i połączono z 2 ml Activated-CH-Sepharose (Pharmacia), według instrukcji producenta. Dwie oddzielne kolumny (po jednym ml każda) wyczerpująco płukano sterylnymi i wolnymi od endotoksyn roztworami, ładowano oczyszczonym TNF lub NGR-TNF w PBS i poddawano desorpcji przez elucję gradientem (1 godz., bufor A: PBS; bufor B: 0,5 M chlorek sodu, 0,2 M glicyna-HCl). Frakcje zawierające antygen TNF neutralizowano i dializowano wobec sterylnej soli fizjologicznej. Wolną od endotoksyn ludzką albuminę surowiczą dodawano przed dializą (0,5 mg/ml) aby zapobiec absorpcji białek na membranach. Zawartość TNF w każdej frakcji mierzono za pomocą ELISA i oznaczenia cytolitycznego. Nieredukujący SDS-PAGE TNF wykazał pojedynczy prążek 17-18 kDa, jak oczekiwano dla monomerycznego TNF (nie przedstawiono). Odmiennie, nieredukujący SDS-PAGE i błot typu Western NGR-TNF pokazały różne immunoreaktywne formy 18, 36 i 5 0 kDa prawdopodobnie odpowiadające monomerom, dimerom i trimerom. W warunkach redukujących większość prążków 50 i 36 kDa było przekształconych do formy 18 kDa, wskazując na obecność cząsteczek NGR-TNF z międzyłańcuchowymi mostkami dwusiarczkowymi. Prążek 18 kDa odpowiadał za około 2/3 całego materiału, podczas gdy 36 kDa był odpowiedzialny za większość pozostałej części. Te wzory elektroforetyczne sugerują, że NGR-TNF był mieszaniną trimerów z poprawnymi wewnątrz łańcuchowymi dwusiarczakmi (50%), a w pozostałej części głównie trimerami z jednym lub dwoma mostkami dwusiarczkowymi. Prążek 36 kDa nadal obserwowany przy SDS-PAGE sugeruje, że NGR-TNF zawierał także nieodwracalny zdenaturowany dimer (około 10% całości). Masa cząsteczkowa monomerów TNF i NGR-TNF była odpowiednio 17386,1 ? 2,0 Da i 17843,1 ? 2,5 Da, jak stwierdzono w spektrometrii mas ze strumieniem elektronów. Te wartości dobrze odpowiadają masie oczekiwanej dla Met-TNF1-156 (17386,7 Da) i dla CNGRCG-TNF1-156 (17844,2 Da). PL 207 263 B1 7 P r z y k ł a d II Oznaczenie aktywności cytotoksycznej in vitro mysiego TNF i NGR-TNF Bioaktywność TNF i NGR-TNF oznaczono za pomocą cytolitycznego oznaczenia opartego na mysich fibroblastach L-M (ATCC CCL1.2) jak opisano (23). Działanie cytolityczne TNF i NGR-TNF na komórki RMA-T badano w obecności 30 ng/ml aktynomycyny D. Każda próbka była analizowana w dwóch powtórzeniach, w trzech różnych rozcieńczeniach. Wyniki są wyrażone jako średnia?SD dwóch-trzech niezależnych oznaczeń. Aktywność cytotoksyczna in vivo TNF i NGR-TNF wynosiła (1,2 ? 0,14) x 108 jednostek/mg i (1,8 ? 0,7) x 108 jednostek/mg, odpowiednio jak wykazano za pomocą standardowego oznaczenia cytolitycznego z komórkami L-M. Te wyniki wskazują, że reszty CNGRCG w cząsteczce NGR-TNF nie zapobiegają zwijaniu, oligomeryzacji i wiązaniu do receptorów TNF. W poprzednich badaniach wykazaliśmy, że komórki RMA-T mogą być zabite przez TNF w obecności 30 ng/ml aktynomycyny D, podczas gdy w nieobecności inhibitorów transkrypcji te komórki są oporne na TNF nawet po kilku dniach inkubacji. Działanie cytotoksyczne in vitro NGR-TNF na komórki RMA-T w obecności aktynomycyny D wynosiła (1,4 ? 0,8) x 108 jednostek/mg jak mierzono stosując TNF (1,2 ? 0,14) x 108 jednostek/mg) jako standard. Tak więc działanie cytotoksyczne TNF i NGR-TNF było podobne zarówno na komórki L-M jak i RMA-T. P r z y k ł a d III Charakterystyka terapeutycznej i toksycznej aktywności mysiego TNF i NGR-TNF Chłoniak RMA indukowany przez wirus Rauschera pochodzenia C57BL/6 utrzymywano in vitro w RPMI 1640, 5% płodowa surowica bydlęca (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 ?g/ml streptomycyny, 0,25 ?g/ml amfoterycyny B, 2 mM glutaminy i 50 ?g/ml 2-merkaptoetanolu. RMA-T otrzymano z linii komórkowej RMA przez transfekcję konstruktem kodującym allele Thy 1.1 i hodowano jak opisano (14). Komórki czerniaka hodowano w RPMI 1640, 5% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 ?g/ml streptomycyny, 0,25 ?g/ml amfoterycyny B, 2 mM glataminy, 1% MEM nie niezbędne aminokwasy (BioWhittaker Europe, Verviers, Belgia). Badania in vivo na modelach zwierzęcych były dopuszczone przez Komisję Etyczną San Raffaele H Scientific Institute i wykonane według zaleconych wytycznych. C57/BL/6 (Charles River Labora4 tories, Calco, Włochy) (16-18 g) prowokowano 5 x 10 żywych komórek RMA-T lub B16F1, odpowiednio, podskórnie (s.c.) w lewy bok. Dziesięć-dwanaście dni po implantacji guza, myszy traktowano i.p. 250 ?l roztworu TNF lub NGR-TNF rozcieńczone wolnym od endotoksyny 0,9% chlorkiem sodu. Pierwotne eksperymenty wykazały, że aktywność przeciwnowotworowa nie była zmieniona przez dodanie ludzkiej albuminy surowiczej do roztworów TNF i NGR-TNF jako nośnika. Każdy eksperyment przeprowadzono z 5 myszami na grupę. Wzrost guzów monitorowano codziennie przez pomiar wielkości guza cyrklem. Powierzchnię guza oceniano przez wyliczenie r1 x r2, podczas gdy objętość guza wyliczano przez wyliczenie r1 x r2 x r3 x 4/3, gdzie r1 i r2 są podłużnym i bocznym promieniem, i r3 jest grubością guzów sterczących z powierzchni normalnej skóry. Zwierzęta zabijano zanim guz osiągnął 1,0-1,3 cm średnicy. Wielkości guza przestawiono jako średnia?SE (5-10 zwierząt/grupę jak wskazano na podpisach pod figury) i porównywano za pomocą testu T. Aktywność przeciwnowotworowa i toksyczność NGR-TNF porównano z TNF stosując modele chłoniaka RMA-T i czerniaka B16F1 w myszach C57BL6. Ponieważ model RNA-T był uprzednio scharakteryzowany i stosowany do badania aktywności przeciwnowotworowej TNF z różnymi protokołami adresowania (26) postanowiliśmy zastosować ten model także w tych badaniach. Mysi TNF podawany zwierzętom niosącym ustalone guzy RMA-T s.c. powoduje po 24 godzinach zmniejszenie masy guza i nekrozę krwotoczną w centralnej części guza, po czym przez kilka dni następuje znaczne opóźnienie wzrostu (26). Pojedyncze traktowanie TNF nie indukuje całkowitej regresji guza, nawet w dawkach bliskich LD50, jako że komórki żywe pozostające wokół obszaru nekrotycznego zaczynają ponownie rosnąć kilka dni po terapii. W pierwszym zestawie doświadczeń badaliśmy efekt różnych dawek (i.p.) TNF lub NGR-TNF na przeżycie zwierząt. Aby uniknąć nadmiernego cierpienia, zwierzęta zabijano gdy średnica guza była większa niż 1-1,3 cm. Letalność TNF i NGR-TNF 3 dni po terapii była podobne (LD50, 60 ?g i 45 ?g, odpowiednio) podczas gdy aktywność przeciwnowotworowa była znacząco inna (Tabela 1). 8 PL 207 263 B1 PL 207 263 B1 9 Na przykład 1 lub 3 ?g NGR-TNF opóźniało wzrost bardziej efektywnie niż 27 ?g TNF wskazując, że NGR-TNF był przynajmniej o jeden rząd wielkości bardziej aktywny. Jest interesujące, że niektóre zwierzęta były wyleczone dawkami NGR-TNF niższymi niż LD50 podczas gdy żadne zwierzęta nie były wyleczone TNF. Wyzdrowiałe zwierzęta odrzucały dalsze prowokacje dawkami rakotwórczymi zarówno RMA-T i komórek RMA typu dzikiego, sugerując, że pojedyncze traktowanie NGR-TNF było zdolne do indukcji odporności ochronnej. Jest istotne, że zwiększenie dawki TNF lub NGR-TNF powyżej 9-27 ?g znacząco zwiększało toksyczność a słabo lub wcale aktywność terapeutyczną. Utrata wagi w efekcie traktowania TNF jest dobrze znanym znakiem toksyczności ogólnoustrojowej (26). Tak więc aby dalej porównywać stosunek skuteczności/toksyczności TNF i NGR-TNF monitorowaliśmy wzrost guza i wagę zwierzęcia po terapii. Efekt 1 ?g NGR-TNF na wzrost guza był podobny lub większy niż 9 ?g TNF (Fig. 1a) podczas gdy utrata wagi w ciągu jednego-dwu dni po terapii była porównywalna do 1 ?g TNF (Fig. 1c). Gdy interpolowaliśmy dane z krzywą logarytmiczną w wykresie odpowiedzi na dawkę stwierdziliśmy, że efekt terapeutyczny 9 ?g TNF w dniu 14 może być uzyskany z zaledwie 0,6 ?g NGR-TNF (Fig. 1b). Przeciwnie, 8,5 ?g były konieczne do indukcji porównywalnego efektu toksycznego (Fig. 1d). Tak więc wyliczony stosunek skuteczności/toksyczności NGR-TNF w tych warunkach jest 14 razy większy niż dla TNF. Podobne wyniki uzyskano z modelem czerniaka B16F1. Traktowanie 1 ?g NGR-TNF w dniu 11 i dniu 17 indukowało odpowiedź przeciw guzowi w dniu 19 większą niż uzyskana z 4 ?g TNF i podobną do uzyskanej z 12 ?g TNF (dane nieprzedstawione). Przeciwnie, utrata wagi powodowana przez 1 ?g NGR-TNF była znacząco niższa niż powodowana przez 4 i 12 ?g TNF. Terapia 12 )?g NGR-TNF powodowała jeszcze silniejszy efekt przeciwnowotworowy podczas gdy efekt toksyczny był podobny do 12 ?g TNF. Gdy przeprowadzono trzeci zastrzyk w dniu 19 niektóre zgony zwierząt wystąpiły 1-2 dni później we wszystkich grupach (2 z 5 w grupy traktowanej solą fizjologiczną i 12 ?g NGR-TNF i 1 z 5 w pozostałych grupach). Interesujące jest, że 1 zwierzę traktowane 12 ?g NGR-TNF całkowicie odrzuciło guz. Gdy to zwierzę prowokowano drugą rakotwórczą dawką komórek B16F1, po 18 dniach rozwinął się wyczuwalny guz podczas gdy u kontrolnych zwierząt guz rozwinął się w ciągu 6-7 dni. Te wyniki łącznie sugerują, że skuteczność NGR-TNF w hamowaniu wzrostu guza jest 10-15 razy większa niż TNF podczas gdy toksyczność jest podobna. Co więcej, NGR-TNF może indukować ochronne odpowiedzi immunologiczne bardziej wydajnie niż TNF. P r z y k ł a d IV Mechanizm działania NGR-TNF mAB R3-63 anty-mysie CD13 oczyszczono z płynów puchlinowych za pomocą chromatografii białko-G-Sepharose (Pharmacia-Upjohn, Uppsala, Szwecja) i dializowano wobec 0,9% chlorku sodu. Poliklonalną surowicę odpornościową królika nabyto od Primm srl (Mediolan, Włochy) i oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa na białku-A-Sepharose (Pharmacia-Upjohn). Peptydy CNGRC i CARAC przygotowano jak opisano poprzednio (28). Aby dostarczyć dowody, że polepszona aktywność NGR-TNF zależy od adresowania poprzez resztę NGR badaliśmy czy z aktywnością NGR-TNF może częściowo współzawodniczyć CNGRC. W tym celu podawaliśmy NGR-TNF (1 ?g) myszom niosącym guzy RMA-T, z lub bez molowego nadmiaru CNGRC. Równolegle inne zwierzęta traktowano TNF (3 lub 9 ?g) ponownie z lub bez CNGRC. Jak oczekiwano CNGRC znacząco zwiększał działalność przeciwnowotworowa NGR-TNF (Fig. 2a) ale nie TNF (Fig. 2b). Odmiennie peptyd kontrolny (CARAC) nie był zdolny do powodowania znaczącego obniżenia aktywności NGR-TNF (Fig. 2c). Te wyniki sugerują, że CNGRC współzawodniczy o wiązanie NGR-TNF do receptora CNGRC i popierają hipotezę mechanizmu adresowania dla ulepszonej aktywności. Interesujące jest, że CNGRC nie był zdolny do zmniejszenia in vitro aktywności cytotoksycznej NGR-TNF (dane nieprzedstawione). Ponieważ niedawno doniesiono, że aminopeptydaza N (CD13) jest receptorem dla peptydów CNGRC następnie zbadaliśmy udział tego receptora w mechanizmie adresowania NGR-TNF. W tym celu badaliśmy efekt mAB anty-CD13 (R363) na aktywność przeciwnowotorową NGR-TNF i TNF. MAb R3-63 znacząco hamował aktywność przeciwnowotworowa NGR-TNF (Fig. 2a) ale nie TNF (Fig. 2b) wskazując, że CD13 jest faktycznie istotnie zaangażowane w aktywności przeciwnowotworowa NGR-TNF. Nie zaobserwowano ekspresji CD13 na powierzchni komórek RMA-T na podstawie analizy FACS hodowanych komórek z mAB R3-63 (nie przedstawiono) sugerując, że inne komórki były rozpoznawane przez przeciwciało in vivo. 10 PL 207 263 B1 Choć te dane wskazują, że CD13 jest ważnym receptorem NGR-TNF nie możemy całkowicie wykluczyć, że wiązanie do innych jeszcze nie zidentyfikowanych receptorów także ma udział, choć w mniejszym stopniu, w mechanizmie adresowania. Wstępne eksperymenty częściowej proteolizy wykazały, że wiązanie Arg-Ser w N-końcowym odcinku TNF (reszty 2-3) jest bardzo czułe na trypsynę, podczas gdy reszta cząsteczki jest o wiele bardziej odporna. Tak wiec aby dostarczyć dalsze dowody, że poprawiona aktywność NGR-TNF jest związana z resztą NGR staraliśmy się odciąć domenę NGR z N-końcowego regionu muteiny przez częściowe trawienie immobilizowaną trypsyną. Ta procedura przekształcała zarówno NGR-TNF i TNF do cząsteczki odpowiadającej fragmentowi TNF3-156 (oczekiwana masa 16986.2 Da; patrz Fig. 3a dla mierzonej masy i oczekiwanych sekwencji). Podczas gdy trawienie nie zmniejszyło aktywności cytolitycznej NGR-TNF in vitro na komórkach 8 L-M (2,3 ? 1,4 x 10 U/mg) jego aktywności przeciwnowotworowa in vivo była zmniejszona do poziomu TNF (Fig. 3b). Interesujące jest, że toksyczność NGR-TNF i TNF były podobne zarówno przed i po trawieniu, jak oceniono na podstawie utraty wagi ciała zwierząt po jednym dniu terapii (Fig. 3b, prawy panel) sugerując, że mechanizm adresowania zależny od NGR nie zmienia toksyczności. Przykład V Przygotowanie i charakterystyka ludzkiego TNF i NGR-TNF Ludzki zrekombinowany TNF i NGR-TNF (złożony z ludzkiego TNF1-157 w formie fuzji z C-końcem CNGRCG) były przygotowane przez technologię rekombinowanego DNA i oczyszczone zasadniczo jak opisano dla mysiego TNF i NGR-TNF. cDNA kodujący NGR-TNF przygotowano przez PGR na plazmidzie pET11b/hTNF zawierającym sekwencję kodującą hTNF (33) stosując następujące startery: - NGR-hTNF/1 (sensowny): 5' A TAT CAT ATG TGC AAC GGC CGT TGC GGC GTC AGA TCA TCdT TCT CG 3' - NGR-hTNF/2 (antysensowny): 5' TCA GGA TCC TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC 3' Zamplifikowany fragment strawiono i sklonowano w pET-11b (Ndel/BamHI) i stosowano do transformacji komórek BL21(DE3) E. coli (Novagen). Ekspresja NGR-hTNF była indukowana przez izopropylo-?-D-tiogalaktozyd, według instrukcji producenta pET11b. Rozpuszczalny NGR-TNF odzyskano z dwulitrowych kultur za pomocą sonikacji bakterii w 2 mM kwasie etylenodiaminotetraoctowym, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 po czym następowało wirowanie (15000 x g, 20 min, 4°C). Ekstrakt mieszano z siarczanem amonu (35% nasycenia) pozostawiono na 1 godz. w 4°C i dalej wirowano jak powyżej. Siarczan amonu następnie doprowadzono do 65% nasycenia, pozostawiono w 4°C przez 24 godz. i dalej wirowano. Każdy osad rozpuszczono w 1 M siarczanie amonu, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 i oczyszczono za pomocą chromatografii interakcji hydrofobowych na PhenylSepharose 6 Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elucja gradientem, bufor A: 100 mM fosforan sodu, pH 8,0 zawierający 1 M siarczan amonu; bufor B: 70% glikol etylenowy, 5% metanol, 100 mM fosforan sodu, pH 8,0). Frakcje zawierające immunoreaktywny materiał hTNF (na podstawie ELISA) łączono, dializowano wobec 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 i dalej oczyszczono za pomocą chromatografii jonowymienne na DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia-Upjohn) (elucja gradientem, bufor A: 20 mM TrisHCl, pH 8,0; bufor B: 1 M chlorek sodu, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0). Wszystkie roztwory stosowane w etapach chromatografii przygotowano z wodą sterylną i wolną od endotoksyn (Salf, Bergamo, Włochy). W tym momencie odzyskano około 30 mg TNF i 32 mg NGR-TNF z dwulitrowych hodowli. Nieredukujący SDS-PAGE wykazywał prążki odpowiadające monomerom, dimerom i trimerom sugerując, że także ludzki NGR-TNF był mieszaniną trimerów z prawidłowymi wewnątrzłańcuchowymi mostkami dwusiarczkowymi i trimerami z jednym lub więcej mostkami dwusiarczkowymi między łańcuchami (Fig. 4A, ścieżka b) jak zaobserwowano z mysim NGR-TNF. Trimery z prawidłowymi mostkami dwusiarczkowymi wewnątrzłańcuchowymi izolowano z tej mieszaniny za pomocą czteroetapowego procesu ponownego zwijania jak następuje: oczyszczony ludzki NGR-TNF denaturowano 7 M mocznikiem i sączono przez kolumnę HR Sephacryl S-300 (1025 ml) (Pharmacia) wstępnie równoważoną 7M mocznikiem, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0. Frakcje odpowiadające monomerycznemu TNF łączono, ultrasączono przez YM MWCO 10 kDa membranę (Amicon) i ponownie zwijano przez dializę wobec 33 objętości 2,33 M mocznik, 100 mM Tris-HCl, pH 8 w 4°C (140 min) po czym następował 1,55 M mocznik, 100 mM Tris-HCl, pH 8 (140 min) i 1 M mocznik, 100 mM Tris-HCl, pH 8 (140 min). W końcu produkt dializowano wobec 80 objętości 100 mM Tris-HCl (16 godz), wirowano w 13000 x g (30 min), sączono przez membranę SFCS 0,45 ?m (Nalgene) PL 207 263 B1 11 i sączono w żelu przez kolumnę HR Sephacryl S-300 (1020 ml) wstępnie równoważoną 0,15 chlorkiem sodu, 0,05 M fosforanem sodu (PBS). Odzyskano około 23 mg ponownie zwiniętego białka. Końcowy produkt był głównie monomeryczny po nie redukującej SDS-PAGE (Fig. 4A, ścieżka c) i miał objętość hydrodynamiczną podobną do tej dla ludzkiego trimerycznego TNF na podstawie analitycznego sączenia w żelu HPLC na kolumnie Superdex 75 HR (nie przedstawiono) i miał masę cząsteczkową 1793 7,8 + 1,8 Da (oczekiwana dla CNGRCG-TNFl-157, 17937,8 Da) na podstawie spektrometrii masowej w elektrospresju. Aktywności cytolityczne in vitro niezwiniętych i zwiniętych NGRTNF na komórkach myszy L-M były (6,11 x 107) + 4,9 i (5,09 x 107) + 0,3 jednostki/mg, odpowiednio, podczas gdy oczyszczony ludzki TNF był (5,45 x 107) + 3,1 jednostek/mg. Te wyniki sugerują, że proces denaturacji-ponownego zwinięcia nie wpłynął na interakcje ludzkiego NGR-TNF z mysim receptorem p55. Aktywność przeciw nowotoworom in vivo 1 ?g ludzkiego NGR-TNF (niezwiniętego ponownie) była większa niż 10 ?g TNF (Fig. 4B) podczas gdy toksyczność oceniana na podstawie utraty wagi zwierząt była znacząco niższe (Fig. 4C). Po ponownym zwinięciu 0,3 ?g NGR-TNF było wystarczające aby zaindukować efekt przeciwnowotworowy silniejszy niż uzyskano z 10 ?g TNF (Fig. 4D, 4E). Wyniki te wskazują, że aktywność przeciwnowotworowa ludzkiego NGR-TNF jest większa niż ludzkiego TNF. Co więcej, zaobserwowaliśmy, że ponownie zwinięty ludzki i mysi NGR-TNF może zaindukowaó znaczące efekty przeciwnowotworowe na myszach niosących RMA-T nawet przy bardzo niskich dawkach (1-10 ng/mysz) bez wykazywania efektów toksycznych, podczas gdy TNF nie był zdolny do indukcji znaczących efektów w tych dawkach (nie przedstawiono). P r z y k ł a d VI Przygotowanie i charakterystyka mysiego NGR-IFN? Zrekombinowany mysi interferon (IFN) ? w formie fuzji z CNGRCG (NGR-IFN?) przygotowano za pomocą technologii zrekombinowanego DNA zasadniczo jak opisano dla NGR-TNF. Domenę CNGRC zfuzowano z C-końcem IFN?. Co więcej cysteinę w pozycji 134 zastąpiono seryną, wprowadzono metionine w pozycji -1 dla ekspresji w komórkach E. coli. Startery PCR stosowane do produkcji cDNA NGR-IFN? były 5'-A TAT CTA CAT ATG GAC GGC AGA GTC ATT GAA AGC C (sensowny) i 5'-TC GGA TCC TCA GCA ACG GCC GTT GCA GCC GGA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT GAG GC. cDNA sklonowano w pET-11b (Ndel/BamHI) i zastosowano do transformacji komórek E. coli BL21(DE3) (Novagen). Ekspresję białka indukowano izopropylo-?-D-tiogalaktozydem, według instrukcji producenta. Produkt oczyszczono z ekstraktów E. coli przez chromatografię immunopowinowactwa stosując mAb anty-mysie IFN? (AN18) immobilizowany na agarozie według standardowych technik. Redukujący i nieredukujący SDS-PAGE ostatecznego produktu wykazał pojedynczy prążek 16 kDa. Spektrometria mas ze strumieniem elektronów wykazała masę cząsteczkową 16223 + 3,6 kDa (oczekiwana, 1625,4 Da) odpowiadająca mysiemu Met-IFN?1-134 (C134S) CNGRC (NGR-IFN?). Zdolność NGR-IFN? i NGR-TNF do współzawodniczenia w wiązaniu przeciwciała anty-CD13 do naczyń związanych z guzami badano za pomocą podejścia immunohistochemicznego. Świeże próbki chirurgiczne ludzkich raków nerki uzyskano od Wydziału Histopatologii z San Raffaele H Scientific Institute. Skrawki (grubość 5-6 ?m) utrwalone Bouin (4-6 godz.) zatopionych w parafinie próbek przygotowano i adsorbowano na skrawkach powlekanych polilizyną. Antygeny CD13 wykrywano stosując metodę kompleksu awidyna-biotyna w sposób następujący: skrawki tkanek nawadniano ponownie stosując ksyleny i serię alkoholi o zmieniającym się stężeniu według standardowych procedur. Skrawki tkanek umieszczono w naczyniu zawierającym 1 mM EDTA i gotowano przez 7 min stosując kuchenkę mikrofalową (1000 W). Naczynie następnie ponownie napełniono 1 mM EDTA i ponownie gotowano przez 5 min. Skrawki tkanki pozostawiono do schłodzenia i inkubowano w PBS zawierającym 0,3% nadtlenek wodoru przez 15 min aby wygasić endogenną peroksydazę. Próbki następnie wypłukano PBS i inkubowano z 100-200 ?l PBS-BSA (1 godz. w temperaturze pokojowej) po czym mAb WM15 (anty-hCD13) samym lub mieszanym z różnymi czynnikami współzawodniczącymi (patrz Tabela 2) w PBS-BSA (przez noc w 4°C). Szkiełka następnie płukano 3 razy (po 3 min) PBS i inkubowano z PBS-BSA zawierającym 2% normalną surowicę konia (PBS-BSANHS) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) przez 5 min. Roztwór następnie zastąpiono 3 ?g/ml biotynylowanego Ig konia anty-mysie (H+L) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) w PBA-BSA-NHS i dalej inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Skrawki następnie ponownie płukano i inkubowano przez 30 min z Vecstatin Elite Reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA) rozcieńczonym 1:100 w PBS. Następnie rozpuszczono tabletkę 3,3'-diamino-benzydyno-tetrahydro- 12 PL 207 263 B1 chlorku (Merck, Darmstadt, Niemcy) w 10 ml dejonizowanej wody zawierającej 0,03% nadtlenek wodoru, przesączono przez membranę 0,2 ?m i nałożono na skrawki tkanek przez 5-10 min. Skrawki przepłukano jak powyżej i przeciwbarwiono hematoksyliną Harrisa. Naczynia związane z guzem identyfikowano przez barwienie seryjnych skrawków tkanki mAB anty-CD31 (mAb JC/70A, anty-ludzki CD31, IgG1, od DAKO, Kopenhaga, Dania). Wyniki podsumowano w Tabeli 2. Jak przedstawiono wiązanie WM15 do naczyń związanych z guzem było hamowane przez nadmiar NGR-TNF, NGR-IFN? i CNGRC, ale nie przez inne odczynniki kontrolne pozbawione motywu NGR. To sugeruje, ze miejsce wiązania NGR na CD13 sterycznie zachodzi na epitop WM15. Przeciwnie, NGR-TNF nie był zdolny do współzawodniczenia z wiązaniem 13C03 do komórek nabłonka. Wnioskujemy, że reszta NGR NGR-IFN? i NGR-TNF może oddziaływać z formą CD13 rozpoznawaną przez mAb WM15 na naczyniach związanych z guzem. Co więcej, wyniki te wskazują, że motyw CNGRC jest funkcjonalny gdy jest połączony z N-końcem lub C-końcem cytokiny. T a b e l a 2. Wiązanie WM15 do skrawków komórek raka nerki w obecności różnych związków współzawodniczących. Czynnik współzawodniczący Brak NGR-TNF (2 5 ?g/ml) NGR-IFN? (50 ?g/ml) CNGRC (100 ?g/ml) TNF (2 5 ?g/ml) Ludzka albumina surowicza (25 ?g/ml) Syntetyczna CgA (60-68) (100 ?g/ml) a Wiązanie do naczyń związanych z guzem + + + + Związek współzawodniczący w PBS zawierającym 2% BSA dodano w etapie blokowania i mieszano z pierwszorzędowym przeciwciałem; b mAb WM15 (anty-ludzki CD13, IgG1) był od Pharmingen (San Diego, CA); syntetyczny peptyd CgA(60-68) odpowiada chromograninie A, fragment 60-68. P r z y k ł a d VII Adresowane dostarczanie biotynylowanego NGR-TNF do guzów stosując przeciwciała anty-guz i awidynę (adresowanie wstępne) Następujący przykład ilustruje możliwość podwójnego adresowania TNF opartego na kombinacji przeciwciała adresującego guz i peptyd CNGRC. Przygotowano koniugat biotyną-NGR-TNF mieszając NGR-TNF z kwasem D-biotynylo-6-aminokapronowym i estrem N-hydroksybursztynoimidowym (Societa Prodotti Antibiotici S.p.A, Mediolan, Włochy) w buforze 1 M węglan sodu, pH 6,8 (3 godz. w temperaturze pokojowej) (21). Reakcja była blokowana 1 M Tris-HCl, pH 7,5. Koniugat scharakteryzowano za pomocą spektrometrii mas i stwierdzono, że zawiera 1 bioty4 nę/trimer (średnio). C57BL/6 (Charles River Laboratories, Calco, Włochy) następnie prowokowano 5 x 10 2 żywych komórek RMA-T, s.c. w lewy bok. Gdy powierzchnia guza osiągnęła 40 mm myszy traktowano przez kolejne zastrzyki biotynylowanego przeciwciała, awidyn i biotyno-TNF według protokołu ?3 dni? jak opisano uprzednio (26). Wstrzyknęliśmy: 40 ?g biotyno-mAb19E12 (i.p., etap I), 60 ?g awidyny i 60 ?g streptawidyny po 18 i 19 godz., odpowiednio (i.p., etap II), 3 ?g biotyno-NGR-TNF, po 24 godzinach (i.p., etap III). Każdy związek rozcieńczono sterylnym roztworem 0,9% chlorku sodu. W kontrolnych eksperymentach nie dawano awidyny i streptawidyny. Każdy eksperyment przeprowadzono z 5 myszy/grupę. Wzrost guza monitorowano codziennie przez pomiar wielkości guza cyrklem. Powierzchnia guza przed i 10 dni po terapii wynosiła odpowiednio 39 ? 4 mm2 i 8 ? 5 mm2 w grupie traktowanej mAB19E12-biotyna/awidyna/streptawidyna/biotyna-NGR-TNF (5 zwierząt, średniaj+SEM). W grupie kontrolnej (traktowanej tylko mAb 19E12-biotyna/biotyna-NGR-TND) powierzchnie guza przed i 10 dni po terapii były 40 ? 4 mm2 i 20 ? 6 mm2 odpowiednio, wskazując, że wstępne adresowanie przeciwciałem adresującym guz i awidyną zwiększyło aktywność NGR-TNF. Literatura 1. Carswell, E. A., et al., An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1975. 72:3666-70. 2. Helson, L., et al., Effect of tumor necrosis factor on cultured human melanoma cells. Nature 1975. 258:731-732. PL 207 263 B1 13 3. Tracey, K. J., and A. Cerami. Tumor necrosis factor, other cytokines and disease. Ann. Rev. Cell Biol, 1993. 9:317-43. 4. Hoogenboom, H. R., et al., Construction and expression of antibodytumor necrosis factor fusion proteins. Mol. Immunol. 1991. 28:1027-37. 5. Loetscher, H., et al., Human tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75kDa TNF receptors. J. Biol. Chem. 1993. 268:26350-7. 6. Yang, J., et al., A genetically engineered single-chain FV/TNF molecule possesses the antitumor immunoreactivity of FV as well as the cytotoxic activity of tumor necrosis factor. Mol. Immunol. 1995. 32:873-81. 7. Van Ostade, X., et al., Human TNF mutants with selective activity on the p55 receptor. Nature 1993. 361:266-9. 0 8. 8. Paganelli, G., et al., Three-step monoclonal antibody tumor targeting in carcinoembryonic antigenpositive patients. Cancer Res. 1991. 51:5960-6. 9. Paganelli, G., et al., Clinical application of the avidin-biotin system for tumor targeting. In D. Goldenberg (Ed. Cancer therapy with radiolabeled antibodies. CRC Press, Boca Raton, 1995. P. 239-253. 10. Modorati, G., et al., Immunoscintigraphy with three step monoclonal pretargeting technique in diagnosis of uveal melanoma: preliminary results. Br. J. Ophtalm. 1994. 78:19-23. 11. Colombo, P., et al., Immunoscintigraphy with anti-chromogranin A antibodies in patients with endocrine/neuroendocrine tumors. J. Endocr. Invest. 1993.16:841-3; 12. Debs, R. J., et al., Liposome-associated tumor necrosis factor retains bioactivity in the presence of neutralizing anti-tumor necrosis factor antibodies. J. Immunol. 1989. 143:1192-7. 13. Debs, R. J., et al., lmmunomodulatory and toxic effects of free and liposome-encapsulated tumor necrosis factor alpha in rats. Cancer Res. 1990. 50:375-80. 14. Moro, M., et al., Tumor cell targeting with antibody-avidin complexes and biotinylated tumor necrosis factor alpha. Cancer Res. 1997. 57:1922-8. 15. Schraffordt Koops, et al., Hyperthermic isolated limb perfusion with tumour necrosis factor and melphalan as treatment of locally advanced or recurrent soft tissue sarcomas of the extremities. Radiothepray & Oncology 1998. 48:1-4. 16. Lienard, D., et al., In transit metastases of malignant melanoma treated by high dose rTNF alpha in combination with interferon-gamma and melphalan in isolation perfusion. World Journal of Surgery 1992. 16:234-40. 17. Hill, S., et al., Low-dose tumour necrosis factor alpha and melphalan in hyperthermic isolated limb perfusion. Br. J. Sugr. 1993. 80:995-7. 18. Eggermont, A. M., et al., Isolated limb perfusion with tumor necrosis factor and melphalan for limb salvage in 186 patients with locally advanced soft tissue extremity sarcomas. The cumulative multicenter European experience. Ann. Surg. 1996. 224:756-65. 19. Mizuguchi, H., et al., Tumor necrosis factor alpha-mediated tumor regression by the in vivo transfer of genes into the artery that leads to tumor. Cancer Res. 1998. 58:5725-30. 20. Pennica, D., et al., Cloning and expression in Escherichia coli of the cDNA for murine tumor necrosis factor. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1985. 82:6060-4. 21. Corti, A., et al., Tumor targeting with biotinylated tumor necrosis factor alpha: Structure activity relationships and mechanism of action on avidin pretargeted tumor cells. Cancer Res. 1998. 58:3866-3872. 22. Corti, A., et al., Up-regulation of p75 Tumor Necrosis Factor alpha receptor in Mycobacterium avium-infected mice. Infect. Immun. 1999, 67:5762-5767. 23. Corti, A., et al., Tumor necrosis factor (TNF) alpha quantification by ELISA and bioassay: effects of TNF alpha-soluble TNF receptor (p55) complex dissociation during assay incubations. J. Immunol. Meth. 1994. 177:191-198. 24. Ljunggren, H. G., and K. Karre. Host resistance directed selectively against H-2-deficient lymphoma variants. Analysis of the mechanism. J. Exp. Med. 1985. 162:1745-59. 25. Celik, C, et al., Demonstration of immunogenicitywith the poorly immunogenic B16 melanoma. Cancer Res. 1983. 43:3507-10. 26. Gasparri, A., et al., Tumor pretargeting with avidin improves the therapeutic index of biotinylated tumor necrosis factor alpha in mouse models. Cancer Res. 1999. 59:2917-23. 14 PL 207 263 B1 27. Palladino, M. A., Jr., et al., Characterization of the antitumor activities of human tumor necrosis factor-alpha and the comparison with other cytokines: induction of tumor-specific immunity. J. Immunol. 1987. 138:4023-32. 28. Arap, W., et al., Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model. Science 1998. 279:377-80. 29. Fiers, W. Biologic therapy with TNF: preclinical studies. In V. De Vita, S. Hellman, and S. Rosenberg Eds. Biologic therapy of cancer: principles and practice. J.B. Lippincott Company, Philadelphia, 1995. P. 295-327. 30. Rathjen, D. A., et al., 1992. Selective enhancement of the tumour necrotic activity of TNF alpha with monoclonal antibody. Brit. J. Cancer 65:852. 31. Robert, B., et al., 1996. Cytokine targeting in tumors using a bispecific antibody directed against carcinoembryonic antigen and tumor necrosis factor alpha. Cancer Res. 56:4758. 32. Fraker, D.L., Alexander, H.R. &, Pass, H.I., 1995. Biologic therapy with TNF: systemic administration and isolation-perfusion. In Biologic therapy of cancer: principles and practice. De Vita, V., Hellman, S. & Rosenberg, S. (eds) pp. 329-345. J.B. Lippincott Company: Philadelphia. 33. Pennica, D., et al., 1984. Human tumor necrosis factor: precursor, structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature, 321, 724-729.. PL 207 263 B1 15 16 PL 207 263 B1 PL 207 263 B1 17 Zastrzeżenia patentowe 1. Produkt koniugacji pomiędzy cytokiną wybraną z TNF albo IFN?, a ligandem receptora CD13. 2. Produkt koniugacji według zastrz. 1, znamienny tym, że cytokina jest TNF? albo TNF?. 3. Produkt koniugacji według zastrz. 1-2, znamienny tym, że ligand receptora CD13 jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał albo ich aktywnych fragmentów, peptydów albo mimetyków peptydów. 4. Produkt koniugacji według zastrz. 3, znamienny tym, że ligand jest peptydem zawierającym motyw NGR. 5. Produkt koniugacji według zastrz. 4, znamienny tym, że peptyd jest wybrany z grupy składającej się z CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, cykloCVLNGRMEC, liniowego albo cyklicznego CNGRC. 6. Produkt koniugacji według dowolnego z powyższych zastrzeżeń, znamienny tym, że cytokina jest modyfikowana glikolem polietylenowym albo resztą acylową. 7. Produkt koniugacji według dowolnego z powyższych zastrzeżeń, znamienny tym, że cytokina jest ponadto skoniugowaną z przeciwciałem albo fragmentem przeciwciała, skierowanym przeciwko antygengowi guza, angiogennemu markerowi guza albo składnikowi macierzy zewnątrzkomórkowej, albo z biotyną. 8. Produkt koniugacji według zastrz. 7, znamienny tym, że cytokiną jest TNF skoniugowany zarówno do ligandu CD13, oraz alternatywnie do przeciwciała, jego fragmentu, albo biotyny, na różnych podjednostkach. 9. cDNA kodujący cytokinę wybraną z TNF i IFN, niosący przylegającą sekwencję 5' albo 3' kodującą ligand CD13. 10. cDNA według zastrz. 9, znamienny tym, że ligand CD13 jest peptydem określonym w zastrz. 5. 11. Wektor do terapii genowej zawierający cDNA określony w zastrz. 9-10. 12. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość produktu koniugacji określonego w zastrz. 1-8 razem z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami i zaróbkami. 13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że jest w postaci roztworu albo zawiesiny do wstrzykiwania albo płynu do wlewów. 14. Kompozycja według zastrz. 12-13, znamienna tym, że jest w postaci liposomów. 15. Zastosowanie produktu koniugacji opisanego w zastrz. 1-8 albo cDNA opisanego zastrz. 9-10 do wytwarzania leków albo środków diagnostycznych do leczenia raka. 16. Zastosowanie produktu koniugacji według w zastrz. 15 w kombinacji z innymi czynnikami przeciwnowotworowymi albo diagnostycznymi środkami do obrazowania guzów. 18 PL 207 263 B1 Rysunki PL 207 263 B1 19 20 PL 207 263 B1 PL 207 263 B1 21 22 PL 207 263 B1 PL 207 263 B1 23 24 PL 207 263 B1 PL 207 263 B1 25 26 PL 207 263 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.


ANKIETA

Jak oceniasz nowe technologie na mundialu?

Grupy dyskusyjne