Najpopularniejszy w Polsce portal o finansach i biznesie
Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 1851323 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 1851323 T3


EP 1851323 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 23.02.2006 06708461.6 (19) PL (11) PL/EP (13) (51) 1851323 T3 Int.Cl. C12P 21/02 (2006.01) C12P 21/06 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 28.09.2016 Europejski Biuletyn Patentowy 2016/39 EP 1851323 B1 A23J 1/20 (2006.01) Tytuł wynalazku: Enzymatyczny sposób otrzymywania l-P-P z kappa kazeiny (30) (43) Pierwszeństwo: 24.02.2005 EP 05101417 01.11.2005 EP 05110236 Zgłoszenie ogłoszono: 07.11.2007 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/45 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 28.02.2017 Wiadomości Urzędu Patentowego 2017/02 (73) Uprawniony z patentu: DSM IP Assets B.V., Heerlen, NL PL/EP 1851323 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: Andre Leonardus DE ROOS, Delft, NL PIETER MARINUS VAN DEN BROECKE, Didam, NL LUPPO EDENS, Rotterdam, NL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Mirosława Ważyńska JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center 00-833 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). 28010/16/ZWA/MW EP 1 851 323 Enzymatyczny sposób otrzymywania I-P-P z kappa kazeiny Opis Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy enzymatycznego otrzymywania IPP z glikomakro-peptydu z kappa kazeiny. Tło wynalazku [0002] Nadciśnienie jest dość powszechnym stanem chorobowym u ludzi i stanowi powszechny czynnik ryzyka dla chorób sercowo-naczyniowych, uszkodzeń nerek i udarów. Dostępność wielkiej gamy produktów farmaceutycznych takich, jak blokery wapnia, beta blokery, diuretyki, alfa blokery, antagoniści centralnych alfa, antagoniści angiotensyny II i inhibitory ACE ilustruje, że podłoża fizjologicznych mechanizmów nadciśnienia są wielostronne. [0003] Spośród fizjologicznych mechanizmów nadciśnienia, szczególną naukową uwagę uzyskał mechanizm reniny-angiotensyny. W tym mechanizmie, angiotensyna jest wydzielana przez wątrobę i jest rozkładana przez peptydazę reniny z wytwarzaniem biologicznie nieaktywnej dekapeptyl angiotensyny I. Gdy angiotensyna I przepływa przez kapilary płucne, inna peptydaza zwana angiotensyną, przekształcając enzym (zwany dalej ACE) działa na angiotensynę I usuwając dwie ostatnie reszty angiotensyny I (His-Leu), tworząc oktapeptyd angiotensyny II. Oktapeptyd angiotensyny II wykazuje silne działanie zwężające naczynia i w związku z tym podnosi ciśnienie krwi. Hamowanie ACE, prowadząc do niższych poziomów angiotensyny II, chroni przed zwężaniem naczyń i tym samym przed wysokim ciśnieniem krwi. [0004] Oprócz rozkładania angiotensyny I, ACE może również hydrolizować bradykininę, nonapeptyd również uczestniczący w regulacji ciśnienia krwi. W tym ostatnim mechanizmie hamowanie ACE prowadzi do zwiększonych poziomów bradykininy, które promują rozszerzanie naczyń, jak również obniżanie ciśnienia krwi. Hamowanie ACE prowadzi więc do efektów obniżania ciśnienia krwi poprzez przynajmniej dwa oddzielne mechanizmy. [0005] Wiadomo również, że oktapeptyd angiotensyna II stymuluje uwalnianie aldosteronu przez korę nadnerczy. Docelowym organem dla aldosteronu jest nerka, gdzie aldosteron promuje zwiększoną reabsorbcję sodu z kanalików nerkowych. Również trzeci mechanizm hamowania ACE obniża ciśnienie krwi, ale w tym przypadku przez zmniejszanie reabsorbcji sodu. [0006] Z powodu wielu skutków fizjologicznych, hamowanie proteolitycznego działania ACE jest skutecznym rozwiązaniem obniżania ciśnienia krwi. Ta obserwacja poskutkowała wieloma skutecznymi farmaceutycznymi produktami obniżającymi ciśnienie krwi takimi, jak Captopril i Enalapril (Ondetti, M.A. et al., 1977, Science, Washington DC, 196, 441-444). [0007] Ponieważ nadciśnienie jest dość powszechnym stanem chorobowym, korzystne byłoby przeciwdziałanie tym niepożądanym skutkom nowoczesnego stylu życia łagodnie działającymi składnikami naturalnymi. Zwłaszcza łagodnie działającymi składnikami -2- naturalnymi, które mogą być włączane do produktów żywnościowych lub napojów, ponieważ takie produkty są spożywane regularnie. Alternatywnie takie łagodnie działające naturalne składniki mogłyby być włączane do suplementów diety. W ostatnich dekadach stwierdzono, że szczególne peptydy obecne w fermentowanym mleku mają zdolność hamowania ACE i mogą wywoływać obniżanie ciśnienia krwi u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym. Obecnie liczne próby in vitro i kilka prób na zwierzętach wykazały efekty hamujące ACE różnych peptydów uzyskiwanych z różnych źródeł białka. Chociaż oznaczenia hamowania ACE in vitro wykazały wiele różnych sekwencji peptydowych, to należy podkreślić, że peptydy hamujące ACE muszą krążyć we krwi dla wywarcia skutku in vivo. Wynika z tego, że peptydy skutecznie hamujące ACE powinny być odporne na degradację przez trawienie proteolityczne w układzie pokarmowym i powinny pozostawać nienaruszone podczas kolejnego przechodzenia przez ścianę jelita. [0008] Badanie struktury-funkcji różnych peptydów hamujących ACE zasugerowały, że często zawierają one ProPro, Ala-Pro lub Ala-Hyp w swojej sekwencji C-końca (Maruyama, S.and Suzuki, H., 1982; Agric Biol Chem., 46(5): 1393-1394). To stwierdzenie jest częściowo wyjaśnione przez fakt, że ACE jest dipeptydazą peptydylową (EC3.4.15.1 ), niezdolną do rozkładania wiązań peptydowych obejmujących prolinę. A więc z trójpeptydów mających strukturę Xaa-Pro-Pro, dipeptyd Pro-Pro nie może być usuwany, ponieważ wiązanie Xaa-Pro nie może być rozrywane. W związku z tym, wyobrażalne jest, że jeśli występują we względnie wysokich stężeniach, trójpeptydy mające strukturę Xaa-Pro-Pro będą hamować działanie ACE. Ponieważ nie tylko ACE, ale prawie wszystkie enzymy proteolityczne mają trudności z rozrywaniem wiązań Xaa-Pro lub Pro-Pro, przekonanie, że obecność (wielu) reszt prolinowych w karboksyterminalnym końcu peptydów skutkuje względnie odpornymi na proteazę molekułami jest prawie samo w sobie oczywiste. Podobnie peptydy zawierające hydroksyprolinę (Hyp) zamiast proliny są względnie odporne na proteazę. Można z tego wnioskować, że peptydy zawierające jedną lub wiele reszt (hydroksy)proliny w swoim końcu karboksyterminalnym prawdopodobnie unikają proteolitycznej degradacji w przewodzie pokarmowym. Te wnioski pomogą nam zrozumieć znaczący efekt obniżania ciśnienia krwi in vivo szczególnych peptydów hamujących ACE: nie tylko spełniają one wymagania strukturalne dla hamowania ACE, ale wytrzymują one również degradację przez proteolityczne trawienie w układzie pokarmowym i pozostają nienaruszone podczas kolejnego przechodzenia przez ściany jelita. [0009] Silne działania hamujące ACE zostały zgłoszone dla trójpeptydów Leu-Pro-Pro (JP02036127), Val-Pro-Pro (EP 0 583 074) i IIe-Pro-Pro (J. Dairy Sci., 78:777-783 1995)). Początkowo wszystkie peptydy hamujące ACE zostały scharakteryzowane na podstawie ich wpływu in vitro na działanie ACE i trójpeptydy IIe-Pro-Pro (zwane dalej IPP) Val-Pro-Pro (zwane dalej VPP) i Leu-Pro-Pro (zwane dalej LPP) zostały wyróżnione z powodu ich silnego efektu hamowania ACE wynikającego ze względnie niskich wartości IC50. Później przewidywane efekty przeciw-nadciśnieniowe trójpeptydów VPP, jak również IPP, mogły być potwierdzone u szczurów z samoistnym nadciśnieniem krwi (Nakamura et al., J. Dairy Sci., 78:1253-1257 (1995)). W tych doświadczeniach inhibitory trójpeptydowe były uzyskiwane z bakterii kwasu mlekowego fermentowanego mleka krowiego. Podczas -3- fermentacji mleka pożądane peptydy są produkowane przez proteinazy wytwarzane przez rozmnażające się bakterie kwasu mlekowego. Wadą tego podejścia fermentacyjnego jest fakt, że bakterie kwasu mlekowego są organizmami żywymi, u których rodzaj i ilość wydzielanych enzymów są trudne do kontrolowania. Produkcja peptydów hamujących ACE jest w związku z tym słabo powtarzalna i jest również mało prawdopodobne, że produkowany jest optymalny zestaw enzymów dla zapewnienia maksymalnej wydajności wymaganych peptydów. Również wymagane czasy fermentacji są względnie długie, co w kombinacji z małymi wydajnościami oznacza niekorzystną strukturę kosztową dla peptydów bioaktywnych. Ponadto, fermentowany produkt mniej nadaje się do bezpośredniego wprowadzania do stałych pokarmów i stwarza silne ograniczenia organoleptyczne. Zły smak takich produktów z fermentowanego mleka i wiele trudności przetwórczych napotykanych podczas odzyskiwania peptydów hamujących ACE z takich fermentowanych bulionów opisano w US 6,428,812. Pomimo tych wad, produkty z fermentowanego mleka zostały wprowadzone do praktycznego zastosowania jako doustnie podawany środek obniżający ciśnienie krwi. Peptydy hamujące ACE zostały skoncentrowane z produktów z fermentowanego mleka przez elektrodializę, dializę membraną kapilarną lub sposobami chromatograficznymi dla umożliwienia wprowadzenia ich do obrotu w postaci skoncentrowanych suplementów diety takich, jak tabletki lub pastylki. [0010] Wyżej wymienione wady wytwarzania z zastosowaniem fermentacji zostały ujęte w zgłoszeniach patentowych WO 01/68115 i EP 1 231 279. W tym ostatnim zgłoszeniu opisany jest czysto enzymatyczny sposób odzyskiwania trójpeptydów Val-Pro-Pro i IIe-Pro-Pro z kazeiny mleka. Zgłoszenie zastrzega sposób otrzymywania tych trójpeptydów przez trawienie materiału zawierającego kazeinę mleka z proteinazą i peptydazą poprzez peptyd pośredni. Każda z tych inkubacji enzymu może trwać aż 12 godzin i może odbywać się w warunkach, które sprzyjają narastaniu skażeń mikrobiologicznych. Przed inkubacją z peptydazą, pośredni peptyd jest korzystnie oczyszczony, a wysokie stężenia końcowe peptydów hamujących ACE mogą być uzyskane tylko po dodatkowym etapie oczyszczania chromatograficznego peptydu pośredniego. [0011] WO 2004/098309 A1 ujawnia produkt z hydrolizowanej kazeiny zawierający trójpeptydy IPP i/lub VPP. [0012] Janhiainen, Valio Foods & Functionals, Vol. 1, 2003, 1-22 ujawnia, że bioaktywne peptydy w [preparacie] Evolus obniżają ciśnienie krwi u pacjentów z nadciśnieniem. [0013] Manso et al., J. of Food Protection, Vol. 66, 2003, 1686 - 1692 ujawniają angiotensynę I przetwarzającą hamujące działanie enzymów makropeptydów i hydrolizatów trypsyny z kappa kazeiny krowiej, owczej i koziej. Silva et al., International Dairy Review, Vol. 15, 2005, 1-15 podają przegląd przeciw-nadciśnieniowych sekwencji peptydów w kazeinach. Podsumowanie wynalazku [0014] W literaturze naukowej wiele różnych peptydów i hydrolizatów skojarzono z efektami obniżania ciśnienia krwi. Ponadto, znanych jest wiele mechanizmów fizjologicznych, odpowiedzialnych za regulację ciśnienia krwi. Według wynalazku, zaangażowane peptydy i -4- mechanizmy fizjologiczne są minimalizowane przez wybieranie odpowiedniego podłoża białkowego, które po hydrolizie przekształci się we frakcję peptydu mającą IPP jako główny składnik obniżający ciśnienie krwi. Stwierdziliśmy, że dla takiej frakcji peptydu kappa kazeina i bardziej korzystnie glikomakropeptyd (GMP) z kappa kazeiny tworzą korzystny punkt startowy. W obniżaniu ciśnienia krwi, tak wytwarzana mieszanina peptydów lub frakcji, zwłaszcza IPP, odgrywają ważną rolę. Przeciwnie do sposobów z dziedziny techniki, które wytwarzają mieszaniny IPP, VPP i wiele innych potencjalnie bioaktywnych peptydów, obecny sposób jest przeznaczony do produkcji IPP, uniemożliwiając tym samym produkcję VPP. Według wynalazku, GMP jest podłożem białkowym. GMP może być uzyskiwany z kappa kazeiny, jak opisano poniżej. Mleko krowie jest korzystnym źródłem kappa kazeiny. Może być również używane mleko innych ssaków, na przykład mleko kóz, jeśli część GMP molekuły kappa kazeiny zawiera sekwencję -IPP. Ponieważ nie wszystkie kappa kazeiny mogą być rozkładane przez chymozynę krowią, uzyskiwanie części GMP może wymagać zastosowania bardziej odpowiedniego enzymu rozkładającego. [0015] Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu enzymatycznego, który selektywnie wytwarza IPP z GMP, w którym GMP jest najpierw inkubowany z aminopeptydazą i następnie, korzystnie w warunkach, w których aminopeptydaza nie jest już aktywna, z proteazą specyficzną dla proliny. [0016] Wynalazek również podaje sposób sporządzania produktu żywnościowego, napoju lub suplementu diety obejmujący wytwarzanie kompozycji według wynalazku lub wytwarzanej sposobem według wynalazku i wprowadzanie kompozycji do produktu żywnościowego, napoju lub suplementu diety. [0017] Korzystnie, ten produkt żywnościowy, napój lub suplement diety jest wybierany z grupy margaryn, smarowideł, masła, produktów mlecznych lub napojów zawierających serwatkę, korzystnie jogurtu lub produktów na bazie mleka, takich, jak jogurt lub mleko. Szczegółowy opis wynalazku [0018] Wynalazek dotyczy sposobu, w którym peptyd IPP jest wytwarzany z wysokimi wydajnościami z frakcji GMP kappa kazeiny. Zastosowana jest endoproteaza specyficzna dla proliny, w połączeniu z odpowiednią aminopeptydazą. Frakcja zawierająca GMP jest najpierw inkubowana w korzystnych prawie neutralnych warunkach, na przykład pH 5 do 8 z aminopeptydazą. To podejście umożliwia zastosowanie podłoży zawierających sekwencję -XI-P-P-, w której X może przedstawiać resztę aminokwasową. Korzystnie, po dezaktywacji aminopeptydazy lub w warunkach pH, w których aminopeptydaza nie jest aktywna, odcięta na N-końcu molekuła GMP jest inkubowana z proteazą specyficzną dla proliny. Korzystnie, proteaza, która rozkłada koniec karboksylowy proliny, taką, jak endoproteaza specyficzna dla proliny, jak również działanie aminopeptydazy są wolne od wszelkich działań skażających endoproteazę. Endoproteazą specyficzną dla proliny, która jest wolna od działań skażających endoproteazę, jest preparat enzymatyczny mający korzystnie stosunek Prol Spec act/Endo (działanie specyficzne/endoproteaza) wynoszący powyżej 1, a bardziej korzystnie stosunek wynoszący powyżej 100. -5- [0019] Działanie aminopeptydazy, które jest wolne od skażającej działalności endoproteazy jest działaniem preparatu enzymatycznego mającego korzystnie stosunek AP/Endo (aminopeptydaza/endoproteaza) przynajmniej 0,1, bardziej korzystnie przynajmniej 0,5 i najkorzystniej przynajmniej 1. [0020] Endoproteazą specyficzną dla proliny, która jest wolna od skażającego działania karboksyl peptydazy jest preparat enzymatyczny mający korzystny stosunek Pro Spec act/CPD wynoszący przynajmniej 1, bardziej korzystnie wynoszący przynajmniej 10. [0021] Działaniem aminopeptydazy, która jest wolna od skażającego działania karboksyl peptydazy jest działanie preparatu enzymatycznego mającego korzystnie stosunek AP/CPD wynoszący przynajmniej 0,1, bardziej korzystnie wynoszący przynajmniej 0,3. Wyżej wymienione stosunki są określone tak, jak opisano w Przykładzie 5. [0022] Korzystnie, przynajmniej 20%, bardziej korzystnie przynajmniej 40% lub jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 60% i najbardziej korzystnie przynajmniej 70% sekwencji I-P-P występującej w sekwencji białka jest przetwarzane na peptyd IPP. Proteaza specyficzna dla proliny jest korzystnie zdolna do hydrolizowania dużych molekuł białka, takich, jak samo podłoże białkowe. Sposób według wynalazku ma ogólnie czas inkubacji poniżej 24 godzin, korzystnie, gdy czas inkubacji wynosi poniżej 10 godzin i bardziej korzystnie, gdy wynosi poniżej 4 godzin. Temperatura inkubacji jest zwykle wyższa niż 30°C, korzystnie, gdy jest wyższa niż 40°C i bardziej korzystnie, gdy jest wyższa niż 50°C. [0023] W dziedzinie techniki, trójpeptydy IPP, VPP i LPP opisano jako skuteczne inhibitory ACE. Jak można ocenić ze znanych sekwencji aminokwasów, białko serwatki mleka krowiego nie zawiera sekwencji aminokwasów odpowiadających dowolnym z trzech trójpeptydów hamujących ACE. W związku z tym, peptydy IPP, VPP i LPP nie mogą być izolowane z białka serwatki. Jednak te peptydy występują we frakcji kazeiny mleka krowiego. Na przykład, beta-kazeina zawiera sekwencje -I-P-P(74-76), -V-P-P(84-86), jak również -LP-P(151-153). Ponadto, kappa kazeina zawiera również -I-P-P, ale nie pozostałe dwie sekwencje. Sekwencja IPP obecna w kappa kazeinie znajduje się na pozycji 109-110, tzn. w miejscu rozkładu kilku aminokwasów karboksyterminalnych unikalnej chymozyny Phe (105)Met (106) w kappa kazeinie. A więc, sekwencja -I-P-P kappa kazeiny znajduje się w części GMP tej molekuły. Wynalazcy stwierdzili, że w enzymatycznie skrzepłym mleku całe IPP pochodzące z kappa kazeiny można znaleźć w serwatce serowej, a w kwasowo skrzepłym mleku w części wytrąconej kazeiny. [0024] Pomimo faktu, że pod względem ciężaru kappa kazeina nie jest ważną frakcją kazeiny, wynalazcy zauważyli, że z punktu widzenia cząsteczkowego jej obecność jest bardzo znacząca. Na przykład, beta-kazeina występuje w stężeniu prawie 400 milimoli na metr sześcienny mleka, a kappa kazeina w stężeniu 180 milimoli na metr sześcienny mleka. Również w serwatce sera GMP stanowi ważną frakcję. Podczas, gdy stężenie połączonego serum białka wynosi 320 milimoli na metr sześcienny, GMP występuje w stężeniu 400 milimoli na metr sześcienny serwatki sera. -6- [0025] Nieoczekiwanie, GMP może być łatwo uzyskiwany. GMP może być selektywnie uwalniany z wytrącanych kwasowo kazein przez obróbkę enzymatyczną z chymozyną w wybranych warunkach pH. Chociaż izolowanie GMP z serwatki sera jest trudniejsze, znane są sposoby przemysłowe, w których uzyskiwane są frakcje serwatki wzbogaconej w GMP. Te dostępne w handlu wzbogacone w GMP frakcje uzyskiwane w tych znanych sposobach są aktualnie wykorzystywane w różnych zastosowaniach nutraceutycznych. [0026] W zgłoszeniu opisujemy zastosowanie GMP jako materiału startowego do uzyskiwania obniżającego ciśnienie krwi IPP w stanie wysoce oczyszczonym. [0027] Frakcja białka mleka zwykle zawiera frakcję micelarną kazeiny i rozpuszczoną frakcję białka serwatki. Spośród białek serwatki ilościowo najważniejsze są beta-laktoglobulina i alfa-laktalbumina. Spośród białek kazeiny ilościowo przeważające są hydrofobowe alfa- i beta-kazeiny. Micele kazeiny są utrzymywane w roztworze przez kappa kazeinę. Hydrofilowa część kappa kazeiny, tak zwany glikomakropeptyd (GMP), wystaje z powierzchni micelarnej, stabilizując hydrofobowe kazeiny w roztworze wodnym. [0028] Zgodnie z wieloma dobrze ustalonymi sposobami przemysłowymi, frakcja kazeiny może być izolowana z mleka, np. do wytwarzania sera. W jednym ze sposobów, mleko jest zakwaszane dla selektywnego wytrącania z mleka frakcji kazeiny. Kwasowo wytrącany materiał zawiera wszystkie kazeiny, tzn. alfa, beta, kappa i gamma-kazeiny. Niewytrącona frakcja zakwaszonego mleka jest nazywana ?serum serwatki?. W innym sposobie mleko jest inkubowane z enzymem krzepnięcia mleka, na przykład chymozyną cielęcą (?podpuszczką?). Chymozyna jest proteazą, która bardzo wybiórczo rozszczepia wiązanie peptydowe Phe (105)-Met (106) kappa kazeiny. W tej reakcji hydrofilowa część GMP kappa kazeiny jest rozszczepiana, co powoduje natychmiastową agregację i wytrącanie micelarnej frakcji kazeiny. W tym przypadku, wytrącona frakcja kazeiny jest nazywana ?twarogiem?. Gdy część GMP kappa kazeiny jest odcinana, w tym enzymatycznym podejściu hydrofilowy fragment GMP pozostaje w roztworze razem z różnymi rodzajami serum białka tworzącymi tak zwany ?ser? lub ?słodką? serwatkę. [0029] Różne publikacje zastrzegają fizjologiczne korzyści spożywania frakcji mleka wzbogaconych w GMP. Ponadto, istnieje wiele publikacji opisujących wydajne kosztowo możliwości izolowania wzbogaconych w GMP frakcji serwatki sera. Na przykład, przez zastosowanie ultrafiltracji opisanej w EP 1037537 i zastosowanie żywicy anionowej w US 6787158. [0030] Hydrolizat GMP może być używany jako środek obniżający ciśnienie krwi. Stwierdziliśmy, że względnie wysoki poziom IPP i innych peptydów mających karboksyterminalną prolinę w GMP może być wiązany z efektem obniżania ciśnienia krwi. [0031] Przez hydrolizat rozumiemy produkt, który jest tworzony przez hydrolizę podłoża białkowego (hydrolizat białka lub białko hydrolizowane), rozpuszczalny hydrolizat jest frakcją rozpuszczalną (w wodzie) hydrolizatu białka, która jest również opisana tutaj jako rozpuszczalny peptyd zawierający kompozycję lub zawierające kompozycję rozpuszczalne peptydy lub mieszanina hydrolizatu białka i rozpuszczalnego hydrolizatu. -7- [0032] ?Peptyd? lub ?oligopeptyd? jest tutaj definiowany jako łańcuch przynajmniej dwóch aminokwasów, które są połączone wiązaniami peptydowymi. Terminy ?peptydy? i ?oligopeptydy? są uważane za synonimy (jak jest uznawane powszechnie) i każdy z tych terminów może być używany zamiennie, zależnie od wymagań kontekstu. ?Polipeptyd? lub ?białko? są definiowane tutaj jako łańcuch zawierający więcej, niż 30 reszt aminokwasowych. Wszystkie wzory lub sekwencje (oligo)peptydów i polipeptydów są tutaj pisane w kierunku od lewej do prawej od końca aminowego do końca karboksylowego, zgodnie z powszechną praktyką. Używany tutaj jednoliterowy kod aminokwasów jest powszechnie znany w dziedzinie techniki i można go znaleźć w Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). [0033] Opioidowe peptydy są peptydami, które mogą wiązać receptory opiatowe. [0034] Międzynarodowo uznane schematy klasyfikacji i nomenklatury wszystkich enzymów z IUMB obejmują proteazy. Zaktualizowany tekst IUMB dla numerów EC proteazy można znaleźć w internecie pod adresem: http://www.chem.gmw/ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/11/.W tym systemie enzymy są definiowane przez fakt, że katalizują one pojedynczą reakcję. Istotny wpływ ma fakt, że kilka różnych białek jest opisanych jako ten sam enzym, a białko, które katalizuje więcej, niż jedną reakcję, jest traktowane jako więcej, niż jeden enzym. System kategoryzuje proteazy jako endo- i egzoproteazy. Endoproteazy są enzymami, które hydrolizują wewnętrzne wiązania peptydu, egzoproteazy hydrolizują wiązania peptydu przylegające do ?-amino grupy (?aminopeptydazy?), lub wiązanie peptydu pomiędzy końcową grupą karboksylową i przedostatnim aminokwasem (?karboksypeptydazy"). Endoproteazy są dzielone na podklasy na podstawie mechanizmu katalitycznego. Są to podklasy endoproteaz seryny (EC 3.4.21), endoproteaz cysteiny (EC 3.4.22), endoproteaz asparginowych (EC 3.4.23), metalo-endoproteaz (EC 3.4.24) i endoproteaz treoniny (EC 3.4.25). [0035] Aminopeptydazy znajdują się w klasie 3.4.11. Podklasyfikacja jest dokonywana na podstawie względnej wydajności, z którą usuwanych jest 20 różnych aminokwasów. Mogą być rozróżniane aminopeptydazy o wąskiej lub szerokiej specyfice. Aminopeptydazy mogą sekwencyjnie usuwać pojedyncze amino-zakończone aminokwasy z podłoży białka i peptydu. Aminopeptydazy o wąskiej specyfice wykazują silne preferencje dla typu reszty aminokwasowej w pozycji P1, która jest uwalniana z podłoża peptydu. Aminopeptydazy o szerokiej specyfice są zdolne do uwalniania szeregu różnych aminokwasów w pozycjach na N-końcu lub P1 (zgodnie z nomenklaturą Schechtera: Schechter, I. i Berger, A. 1967. Biochem Biophys Res Commun 27:157-162). Karboksypeptydazy mogą sekwencyjnie usuwać pojedyncze aminokwasy z końcem karboksylowym z podłoży białka i peptydu. Porównywalnie do sytuacji z endoproteazami, karboksypeptydazy są dzielone na podklasy na podstawie mechanizmu katalitycznego Karboksypeptydazy typu seryny są w klasie EC 3.4.16, metalo-karboksypeptydazy w klasie EC 3.4.17 a karboksypeptydazy typu cysteiny w klasie EC 3.4.18. Wartością listy EC dla reszt proteaz jest podawanie standardowej -8- terminologii dla różnych rodzajów działania proteazy, a zwłaszcza przydzielanie unikalnego numeru i zalecanej nazwy dla każdej proteazy. [0036] Częścią GMP molekuły kappa kazeiny jest polipeptyd o długości 64 reszt aminokwasowych. Jeśli całe IPP jest ilościowo odzyskane, czysty preparat GMP może osiągać stężenie IPP prawie 5% (wagowo) bez znacznych skażeń powodowanych albo przez VPP albo przez LPP. W zgłoszeniu opisujemy kilka proteolitycznych sposobów izolowania trójpeptydu IPP z polipeptydu GMP opcjonalnie w pojedynczym etapie inkubacji i z wysokimi wydajnościami. W związku z tym, zgodnie ze sposobem według wynalazku, możliwe jest uzyskiwanie kompozycji zawierającej IPP, gdzie stężenie IPP jest dostatecznie wysokie do stosowania bezpośrednio lub pośrednio po zwykłym etapie oczyszczania, bez potrzeby złożonego i kosztownego sposobu oczyszczania takiego, jak chromatograficzne izolacja lub oczyszczanie. [0037] Zgodnie ze sposobem proteolitycznym, izolowana molekuła GMP jest najpierw inkubowana z aminopeptydazą dla usunięcia N-końcowych aminokwasów GMP (Met i Ala) poprzedzających sekwencję IPP w GMP. Tylko po tej inkubacji dodawana jest proteaza specyficzna dla proliny do mieszaniny reakcji dla uwolnienia peptydu IPP. Korzystnie, podczas lub po inkubacji z proteazą specyficzną dla proliny aminopeptydaza nie jest już aktywna. Stwierdziliśmy, że to podejście prowadzi do wyższych wydajności IPP i poza tym nie prowadzi do wytwarzania posmaku i ma słaby wpływ na ilość wolnych aminokwasów występujących w produkcie końcowym. Ponadto, IPP występuje w dużej ilości w porównaniu z innymi peptydami, zwłaszcza w porównaniu z trójpeptydami. Sporządzony IPP może być dalej oddzielany od większych peptydów. Ponieważ aminopeptydazy mogą sekwencyjnie usuwać aminokwasy z N-końcowej strony peptydów, wymagane jest działanie aminopeptydolitycznego enzymu, który może wydajnie uwalniać reszty metioninowe (?M?) i alaninowe (?A?) poprzedzając sekwencję IPP. Stwierdzono, że wiązania peptydowe I-P i P-P obecne w trojpeptydach IPP wytrzymują rozkład enymatyczny i po inkubacji zdrowej molekuły GMP takie aminopeptydolityczne działanie odetnie N-końcowe molekuły GMP, aby rozpoczynać od sekwencji IPP. [0038] Handlowym preparatem enzymatycznym wykazującym pożądane działanie aminopeptydazy jest Corolase LAP (AB Enzymes). Corolase LAP przedstawia względnie czyste, klonowane i nadekspresjonowane aminopeptydazy leucyny z Aspergillus. Ponieważ ten preparat nie wykazuje działań niespecyficznych endoproteolitycznych i karboksypeptydolitycznych, unika się niepożądanego rozkładu molekuły podłoża GMP. Inną klonowaną i nadekspresjonowaną aminopeptydazą ze względnie szeroką specyfiką jest aminopeptydaza uzyskiwana z A. niger (SEQ ID 171 z WO 02/068623). [0039] Ostatecznie zauważyliśmy, że GMP jest również korzystnie stosowany w sposobach, w których IPP jest wytwarzane z wykorzystaniem procesu fermentacji. Jak zilustrowano w Przykładach, inkubacja GMP ze specyficznymi pałeczkami lactobacilli daje IPP bez wytwarzania posmaków, które są charakterystyczne dla całej fermentacji mleka. [0040] Wszystkie wyżej wymienione aspekty są szczególnie ważne, ponieważ umożliwiają wytwarzanie wysoce znormalizowanego produktu bez niepożądanych bioaktywności lub -9- profili smakowych lub zapachowych. Taki wysoce znormalizowany produkt może być wprowadzany bez kolejnych etapów oczyszczania do różnych zastosowań żywieniowych lub do skoncentrowanych produktów dietetycznych, takich, jak tabletki lub pastylki. Wysoce znormalizowane produkty zawierające nawet wyższe stężenia IPP, np. do wytwarzania mniejszych tabletek lub pastylek, mogą być uzyskiwane przez selektywne usuwanie peptydów innych, niż IPP. Takie usuwanie peptydów bez znaczących działań obniżania ciśnienia krwi może być realizowane np. przez wytrącanie tych nieaktywnych peptydów i następnie przez etap (ultra)filtracji lub dekantacji. W jeszcze innym podejściu, stężenie bioaktywnych składników może być dalej zwiększane przez kolejne oczyszczanie, w którym stosowany jest peptyd IPP o bardzo hydrofobowym charakterze. Sposoby oczyszczania obejmują nanofiltrację, ekstrakcję na przykład butanolem z następnym odparowywaniem /wytrącaniem lub kontaktowanie z zakwaszonym hydrolizatem, uzyskanym ze spoiwami, takimi, jak węgiel aktywny lub żywice chromatograficzne, na przykład z rodziny Amberlite XAD (Rohm). Mogą być również stosowane żywice butylo-sefarozowe, dostarczane na przykład przez Pharmacia. Desorpcja peptydów obniżających ciśnienie krwi z takich materiałów może być realizowana przy użyciu rozpuszczalników organicznych, takich, jak mieszaniny metanolu/etanolu lub propanol. Ponadto, do uzyskiwania wysoko oczyszczonych peptydów bioaktywnych może być zastosowana superkrytyczna ekstrakcja za pomocą CO2 lub N2O. [0041] W EP 1 231 279 opisany jest sposób czysto enzymatyczny odzyskiwania trójpeptydów VPP i IPP z kazeiny mleka. Zgłoszenie zastrzega sposób wytwarzania trójpeptydów przez trawienie materiału zawierającego kazeinę mleka proteinazą i peptydazą poprzez tak zwany ?peptyd pośredni? wybierany z grupy składającej się z zawierającej peptyd sekwencji -V-P-P, ale nie zawierającej żadnych Pro, innych, niż te występujące w tej sekwencji, jak również zawierającej peptyd sekwencji -I-P-P, ale nie zawierającej innych Pro, niż te zawarte w tej sekwencji. Jak opisano w Przykładach EP 1 231 279, sposób obejmuje sposób dwuetapowy. Najpierw wytwarzane są peptydy pośrednie obejmujące albo VPP, albo IPP. Jest to wykonywane przez inkubowanie kazeiny z odpowiednią proteinazą, zgodnie z jednym z Przykładów, w 37 stopniach C przez okres 12 godzin. Następnie używana proteinaza jest dezaktywowana przez ogrzewanie tego pierwszego hydrolizatu do 100 stopni C przez 3 minuty i po ponownym ochłodzeniu, dodawany jest inny preparat enzymatyczny (faktycznie, preparat o działaniu egzoproteolitycznym). Po dalszych 12 godzinach inkubacji w 37 stopniach C z tym innym preparatem enzymatycznym może być zademonstrowana obecność trójpeptydów VPP i IPP. Dla uzyskania wyższych wydajności tych hamujących ACE peptydów, EP 1 231 279 zaleca dalej oczyszczać i zagęszczać pośredni peptyd przed poddaniem działaniu egzoproteolitycznemu. EP 1 231 279 zaleca również, aby po uzyskaniu pośredniego peptydu a przed skontaktowaniem pośredniego peptydu z peptydazą, mogły być przeprowadzone procedury różnych operacji, takich, jak usuwanie nieprzereagowanego białka przez np. odwirowywanie z prędkością 5000 do 20000 obr/min przez 3 do 10 minut. Więc złożona mieszanina pożądanych trójpeptydów jest uzyskiwana przemysłowo w raczej niewygodnym dwuetapowym sposobie enzymatycznym. Ponieważ każda z enzymatycznych inkubacji może trwać aż 12 godzin przy pH 4,5 do 7,0 i w temperaturze 25 do 50 stopni C, oczywiste jest, że ta procedura jest również nieakceptowana z mikrobiologicznego punktu -10- widzenia. Te długie czasy inkubacji w połączeniu z niską temperaturą inkubacji 25 do 50°C mogą łatwo wywołać infekcje roztworu zawierającego białko. [0042] Po porównaniu ze sposobami opisanymi w EP 1 231 279, staje się wyraźna elegancja etapów podanych w tym sposobie. Przede wszystkim, zgłoszenie opisuje wykorzystywanie tylko fragmentu GMP kappa kazeiny. W wyniku tego, uwalniane będzie tylko IPP, a nie będzie wytwarzanych wiele innych, potencjalnie bardzo gorzkich peptydów znanych z tego, że są zawarte w kazeinie. Po wtóre, inkubacja według wynalazku, w której fragment GMP kazeiny jest najpierw inkubowany z czystą aminopeptydazą, po czym następuje inkubacja z proteazą specyficzną dla proliny jest zasadniczo różna od rozwiązania opisanego w EP 1 231 279, a jeszcze uwalnia IPP z bardzo wysoką wydajnością i z minimalnymi poziomami skażających peptydów i wolnych aminokwasów. Korzystna inkubacja rozpoczyna się z aminopeptydazą (?peptydazą? zgodnie z EP 1 231 279), zamiast proteinazą i nie wytwarza ?peptydu pośredniego?. W kolejnym etapie zastosowana jest endoproteaza zamiast proteinazy i znów nie jest wytwarzany żaden ?peptyd pośredni?. [0043] Pomimo wszystkich wad wymienionych dla produktów poprzedniej dziedziny techniki, produkty z fermentowanego mleka zostały wprowadzone do praktycznego zastosowania jako podawany doustnie środek obniżający ciśnienie krwi. Hamujące ACE peptydy również są zagęszczane z produktów z fermentowanego mleka przez elektrodializę, dializę kapilarną lub sposoby chromatograficzne dla umożliwienia wprowadzenia ich do obrotu w formie skoncentrowanych suplementów diety, takich, jak tabletki lub pastylki. Używany tutaj termin ?nutraceutyczny? oznacza przydatność zarówno do zastosowań żywieniowych, jak i farmaceutycznych. A więc, nutraceutyczne kompozycje mogą znaleźć zastosowanie jako suplement do żywności i napojów i jako formulacje farmaceutyczne lub leki do podawania dojelitowego lub pozajelitowego, które mogą być formulacjami stałymi, takimi, jak kapsułki lub tabletki lub formulacjami płynnymi, takimi, jak roztwory i zawiesiny. Jak okaże się oczywiste z poniższego, termin ?kompozycja nutraceutyczna? obejmuje również żywność i napoje obejmujące kompozycję zawierającą obecny peptyd i opcjonalnie węglowodan, jak również kompozycje suplementów, na przykład suplementy diety, obejmujące uprzednio wspomniane składniki aktywne. [0044] Stosowany tutaj termin ?suplement diety? oznacza produkt spożywany doustnie, który zawiera ?składnik pokarmowy? przeznaczony do uzupełniania diety. ?Składniki pokarmowe? w tych produktach mogą obejmować: witaminy, minerały, zioła lub inne rośliny, aminokwasy i takie substancje, jak enzymy, tkanki organiczne, gruczoły i metabolity. Suplementy diety mogą również być ekstraktami lub koncentratami i mogą występować w wielu postaciach, takich, jak tabletki, kapsułki, kapsułki miękkie, kapsułki żelatynowe, płyny lub proszki. Mogą one występować również w innych formach, takich, jak tabliczka, ale jeśli tak, informacja na etykiecie suplementu diety nie będzie zwykle przedstawiać produktu jako tradycyjna żywność lub jako jedyny element posiłku lub diety. [0045] Do kompozycji nutraceutycznych może być dodawany suplement multi-witaminowy i mineralny dla uzyskania odpowiedniej ilości ważnych składników odżywczych brakujących w niektórych dietach. Suplement multiwitaminowy i mineralny może być również przydatny -11- w zapobieganiu chorobom i ochronie przed stratami i niedoborami żywieniowymi spowodowanymi stylem życia i powszechnymi nieodpowiednimi wzorcami żywieniowymi czasami obserwowanymi u osób chorych na cukrzycę. Ponadto, stres oksydacyjny jest wiązany z rozwojem oporności na insulinę. Reaktywne formy tlenu mogą pogarszać stymulowany insuliną wychwyt glukozy przez zakłócanie kaskady sygnalizacyjnej receptora insuliny. Kontrola stresu oksydacyjnego antyoksydantami, takimi, jak ?-tokoferol (witaminą E), kwasem askorbinowym (witaminą C) może mieć znaczenie w leczeniu cukrzycy. W związku z tym, dla utrzymania dobrze zbilansowanego odżywiania, do wyżej wymienionych substancji aktywnych może być dodawany do spożycia suplement multiwitaminowy. [0046] Ponadto, kompozycja peptydu zawierająca kompozycję z minerałami, takimi jak magnez (Mg2+), wapń (Ca2+) i/lub potas (K+) może być używana do poprawy zdrowia. [0047] Kompozycja nutraceutyczna może zawierać peptyd zawierający kompozycję. W kompozycji występuje IPP w ilości zapewniającej dzienną dawkę od około 0,001 g na kg ciężaru ciała do około 1 g na kg ciężaru ciała pacjenta, któremu ma być podawana. Żywność lub napój odpowiednio zawiera około 0,05 g IPP na porcję do około 50 g IPP na porcję. Żywność lub napój zawiera odpowiednio około 0,1 g hydrolizatów białka na porcję do około 100 g hydrolizatów białka na porcję. Jeśli kompozycja nutraceutyczna jest formulacją farmaceutyczną, taka formulacja może zawierać kompozycje zawierające peptyd w ilości od około 0,01 g do około 5 g na jednostkę dawkowania, np. na kapsułkę lub tabletkę lub od około 0,7 g na dawkę dzienną do około 210 g na dawkę dzienną fomulacji płynnej. [0048] Żywność lub napój odpowiednio zawiera około 0,5 g węglowodanów na porcję do około 200 g węglowodanów na porcję. Zakres dozowania (dla osoby o ciężarze 70 kg) [0049] IPP: 0,005 - 70 g/dzień (każdy) Hydrolizaty białka: 0,07 - 210 g/dzień Niehydrolizowane białka: 0,07 - 210 g/dzień Węglowodany: 0,1 - 490 g/dzień [0050] ?Środki korzystne dla zdrowia? są materiałami, które zapewniają korzyści zdrowotne, to znaczy, które mają pozytywny wpływ w aspekcie zdrowia lub które pomagają utrzymać aspekt dobrego zdrowia, gdy są spożywane, te aspekty dobrego zdrowia to zapobieganie otyłości, kontrola wagi ciała i zachowanie zdrowia sercowo-naczyniowego. ?Korzystne dla zdrowia? oznacza mające pozytywny wpływ w aspekcie zdrowia lub pomagające zachować aspekt dobrego zdrowia. [0051] ?Funkcjonalne produkty żywnościowe? są definiowane jako produkty żywnościowe (dla uniknięcia wątpliwości, obejmujące również napoje), odpowiednie do spożycia przez ludzi, w których zastosowana jest kompozycja zawierająca peptyd jako składnik w skutecznej ilości, tak, że uzyskiwana jest zauważalna korzyść dla konsumenta produktu żywnościowego. -12- [0052] Termin ?obejmujący?, gdy używany tutaj, oznacza, że nie jest ograniczony do jakichkolwiek kolejno wymienionych elementów, ale raczej obejmuje niewyszczególnione elementy o dużym lub mniejszym znaczeniu funkcjonalnym. Innymi słowy, etapy, elementy lub opcje nie muszą być wyczerpujące. Zawsze, gdy używane są słowa ?zawierający? lub ?mający?, te terminy mają znaczenie równoważne do ?obejmujący?, jak zdefiniowano wyżej. [0053] Skutecznie obniżający ciśnienie krwi peptyd IPP ma dwie reszty prolinowe na końcu karboksylowym peptydu. Ponieważ wiązania peptydowe zawierające reszty prolylowe są znane jako odporne na rozszczepianie proteolityczne, obecność dwóch reszt prolinowych w peptydach obniżających ciśnienie krwi będzie nadawać takim peptydom zwiększoną odporność na degradację proteolityczną. Ten aspekt zwiększa prawdopodobieństwo, że dany trójpeptyd uniknie całkowitej hydrolizy ze złożonymi preparatami enzymatycznymi. Podobnie IPP prawdopodobnie przetrwa trawienie w układzie pokarmowym, tak, że te peptydy maja większą szansę dotarcia do układu krwionośnego w stanie nienaruszonym. Dla uzyskania peptydów z przynajmniej jedną, ale korzystnie z wieloma resztami prolinowymi na swoim końcu karboksylowym, stosowanie proteazy, która może rozszczepiać stronę karboksylową reszt prolinowych oferuje interesującą opcję. Tak zwane oligopeptydazy prolylu (EC 3.4.21.26) mają unikalną możliwość preferencyjnego rozkładania peptydów po stronie karboksylowej reszty prolinowej, oraz, z mniejszą wydajnością, po stronie karboksylowej alaniny. We wszystkich adekwatnie scharakteryzowanych proteazach specyficznych dla proliny izolowanych ze ssaków, jak również ze źródeł mikrobiologicznych, została zidentyfikowana unikalna domena peptydazy, która wyklucza duże peptydy z aktywnej strony enzymów. Faktycznie, te enzymy nie są zdolne do degradowania polipeptydów zawierających więcej, niż około 30 reszt aminokwasowych, tak, że te enzymy są teraz nazywane ?oligopeptydazami prolylu? (Fulop et al : Cell, Vol. 94, 161-170, 24 lipiec1998). W konsekwencji, te oligopeptydazy prolylu wymagają szerokiej hydrolizy wstępnej z innymi endoproteazami, zanim zaczną wywierać swoje działanie hydrolityczne. Jednak, jak opisano w WO 02/45523, nawet kombinacja oligopeptydazy prolylu z taką inną endoproteazą daje hydrolizaty znamienne znacznie poprawioną proporcją peptydów z resztą karboksyterminalną proliny. Z tego powodu, takie hydrolizaty stanowią doskonały punkt startowy dla izolowania peptydów z efektami hamowania in vitro ACE, jak również dla poprawionej odporności na degradację proteolityczną w przewodzie pokarmowym. Pomimo tych potencjalnych korzyści, nie jesteśmy świadomi zgłoszenia podającego stosowanie proteaz specyficznych dla prolizy dla odtwarzania peptydów obniżających ciśnienie, nie mówiąc już o selektywnej produkcji IPP. [0054] WO 02/45524 opisuje proteazę specyficzną dla proliny uzyskiwaną z Aspergillus niger. Enzym uzyskiwany z A. niger rozkłada preferencyjnie koniec karboksylowy proliny, ale może również rozszczepiać koniec karboksylowy hydroksyproliny, oraz, z mniejszą wydajnoscią, koniec karboksylowy alaniny. WO 02/45524 również ujawnia, że nie istnieje czysta homologia pomiędzy tym enzymem uzyskiwanym z A. niger i znanymi oligopeptydazami prolylu z innych źródeł mikrobiologicznych lub od ssaków. Przeciwnie do znanych oligopeptydaz prolylu, enzym A.niger ma optymalne pH kwasu. Chociaż znane oligopeptydazy prolylu, jak również enzym uzyskiwany z A. niger są tak zwanymi proteazami -13- seryny, pokazujemy w Przykładzie 1, że enzym z A. niger należy do całkowicie innej podrodziny. Wydzielony enzym A. niger wydaje się być raczej członkiem rodziny S28 peptydaz seryny, niż rodziny S9, w której została zgrupowana większość cytozolowych oligopeptydaz prolylu (Rawlings,N.D. i Barrett, A.J.; Biochim. Biophys. Acta 1298 (1996) 13). [0055] W Przykładzie 2 pokazujemy optymalne pH i temperatury endoproteaz specyficznych dla proliny uzyskiwanych z A. niger w porównaniu z oligopeptydazami specyficznymi dla proliny uzyskiwanymi z mikroorganizmu Flavobacterium meningosepticum. Wodne rozwory zawierające białko są bardzo podatne na infekcje bakteryjne, zwłaszcza, gdy są utrzymywane przez wiele godzin w wartościach pH powyżej 5,0 i w temperaturach 50 stopni C lub poniżej. Zwłaszcza toksyny mikrobiologiczne, które mogą być wytwarzane podczas takich przedłużonych etapów inkubacji i prawdopodobnie są zdolne przetrwać kolejne etapy ogrzewania i tworzą potencjalne zagrożenie dla sposobów żywnościowych. Przeciwnie do warunków opisanych w EP 1 231 279, sposób według wynalazku korzystnie stosuje temperaturę inkubacji powyżej 50 stopni C. W połączeniu z jednoetapowym sposobem enzymatycznym, w którym inkubacja enzymu jest przeprowadzana w okresie krótszym, niż 24 godziny, korzystnie poniżej 8 godzin, bardziej korzystnie poniżej 4 godzin, sposób według wynalazku oferuje zaletę poprawionej stabilności mikrobiologicznej. [0056] W Przykładzie 3 demonstrujemy, że preparat enzymatyczny uzyskiwany z A. niger, gdy jest używany w sposobie według wynalazku, wykazuje bardzo wąską specyfikę podłoża, co oznacza, że nie występują żadne znaczące działalności endoproteolityczne inne, niż skierowane na wiązania peptydowe obejmujące reszty prolinowe lub alaninowe. W Przykładzie 4 zgłoszenia pokazujemy, że enzym Aspergillus nie jest oligopeptydazą, ale prawdziwą endopeptydazą zdolną do hydrolizowania nienaruszonych białek, dużych peptydów, jak również mniejszych molekuł peptydów bez konieczności korzystania z pomocy endoproteazy. To nowe i nieoczekiwane stwierdzenie pozwala nam ominąć stosowanie pomocniczej endoproteazy, tak, że mogą być wytwarzane hydrolizaty o niespotykanie wysokiej zawartości peptydów z karboksyloterminalną resztą prolinową. Ponadto, pominięcie pomocniczej endoproteazy jest korzystne dla wytwarzania bardzo ograniczonej liczby peptydów podczas hydrolizowania albo z polipeptydami, albo z oligopeptydami. W wyniku tego, uzyskiwane są względnie proste mieszaniny peptydów, które są znamienne faktem, że większość obecnych peptydów ma karboksyterminalną resztę prolinową. [0057] W Przykładzie 5 charakteryzujemy stosowane preparaty enzymatyczne pod względem występowania działań endoproteolitycznych, aminopeptydolitycznych i karboksypeptydolitycznych. Podczas, gdy endoproteaza specyficzna dla proliny ma pomijalne działania uboczne, preparaty Sumizyme FP i Flavourzyme stanowią bogate źródło wielu różnych rodzajów enzymów. [0058] W Przykładzie 6 opisujemy alternatywne rozwiązanie izolowania GMP tzn. izolowanie z dostępnego w handlu kazeinatu. Stosując endoproteazę specyficzną dla proliny odtworzyliśmy również IPP z tak izolowanego GMP. Fakt, że enzym uzyskany z A. niger nie wykazuje znaczącego działania amino-peptydazy (patrz Przykład 5) mocno sugeruje, że -14- tworzony IPP jest uwalniany z sekwencji -A107-I108-P109-P110 obecnej w kappa kazeinie. Prawdopodobnie karboksyterminalne wiązanie peptydu IPP jest rozszczepiane przez główne działanie endoproteazy prolylu uzyskiwanej z A. niger, podczas, gdy rozszczepianie poprzedzającego wiązania AIa-IIe jest uzyskiwane przez działanie uboczne specyficzne dla Ala. Zaletą tego rozwiązania jest to, że po selektywnym usunięciu GMP, pozostała frakcja kazeinatu może być używana do alternatywnych zastosowań. [0059] W Przykładzie 7 pokazujemy, że zarówno endoproteaza specyficzna dla proliny, jak również złożony preparat Sumizyme FP, mogą być używane do uwalniania IPP z uzyskiwanego z handlu GMP. Korzystnie, ta kompozycja zawiera pomiędzy 0,1 a 100 mg/g IPP (w suchej masie i w białku), bardziej korzystnie pomiędzy 1 a 50 mg/g IPP (w suchej masie i w białku) i najkorzystniej pomiędzy 2 a 35 mg/g IPP (w suchej masie i białku). Stwierdziliśmy również, że hydroliza GMP daje kompozycję zawierającą trójpeptyd IPP i czteropeptyd TSTP w prawie identycznych ilościach w przypadku zastosowania endoproteazy specyficznej dla prolizy. W związku z tym, również ujawniono tutaj kompozycję zawierającą IPP i TSTP, w której stosunek molowy IPP:TSTP wynosi pomiędzy 1,5 a 0,5, korzystnie pomiędzy 1,3 a 0,7 i bardziej korzystnie pomiędzy 1,2 a 0,8. Korzystnie, ta kompozycja zawiera pomiędzy 0,1 do 100 mg/g IPP (w suchej masie i w białku), bardziej korzystnie pomiędzy 1 a 50 mg/g IPP (w suchej masie i w białku) i najkorzystniej pomiędzy 2 a 35 mg/g IPP (w suchej masie i w białku). [0060] W Przykładzie 8 wykazujemy organoleptyczne zalety stosowania hydrolizatu GMP. [0061] W Przykładzie 9 ilustrujemy, że stosowanie GMP umożliwia również sporządzanie produktów zawierających IPP przy podejściu fermentacyjnym. [0062] W związku z tym, wynalazek przynosi wiele zalet w porównaniu z poprzednim stanem techniki. Najważniejszy sposób zgodny z wynalazkiem wytwarza mniejszą różnorodność rozpuszczalnych w wodzie peptydów i spośród rozpuszczalnych w wodzie peptydów IPP występuje w dużych ilościach. Jest to szczególnie ważne w przypadku, gdy potrzebne jest wysokie stężenie IPP w produkcie o łagodnym smaku. Zgodnie z obecnym sposobem, korzystnie przynajmniej 20%, bardziej korzystnie przynajmniej 30%, najkorzystniej przynajmniej 40% sekwencji -A-I-P-P obecnej w białku jest przetwarzane w IPP. [0063] Po hydrolizie roztwór może być ogrzewany. Opcjonalnie, może być wykonywane modyfikowanie pH roztworu lub roztwór może być mieszany z rozpuszczalnikami. [0064] Zgodnie z jednym aspektem wynalazku, rozpuszczalne peptydy, zawierające IPP, które są wytwarzane podczas hydrolizy źródła białka, są oddzielane i opcjonalnie suszone. Na przykład, po dekantacji, filtracji lub odwirowywaniu z niską prędkością dla usunięcia powstającego osadu, przesącza zawierające biologicznie czynne rozpuszczalne peptydy mogą być odzyskiwane na przykład przez odwrotną osmozę lub odparowywanie, opcjonalnie w połączeniu z dodatkowym etapem filtracji, opcjonalnie z następnym etapem suszenia rozpyłowego dla osiągnięcia ekonomicznej możliwości uzyskiwania pasty żywnościowej lub proszku o wysokiej aktywności biologicznej i dobrej rozpuszczalności w wodzie. Po strawieniu odpowiedniego podłoża białka, takiego, jak GMP, przez endoproteazę specyficzną -15- dla proliny, uzyskiwany jest biały i bezwonny proszek o wysokim stężeniu IPP i nieoczekiwanie niskim Stopniu Hydrolizy. [0065] W zastosowaniach nutraceutycznych i zastosowaniach do żywności i napojów, korzystnie stosowane są hydrolizaty zgodne z wynalazkiem. Hydrolizat białka, rozpuszczalny hydrolizat, jak również ich mieszanina, mogą być stosowane w zastosowaniach nutraceutycznych, zastosowaniach w żywności lub napojach. Korzystnie, rozpuszczalny hydrolizat jest stosowany w zastosowaniach nutraceutycznych, zastosowaniach w żywności lub napojach, z powodu występowania wysokiej zawartości aktywnych peptydów. [0066] Gdy odpowiednio rozcieńczony do prawidłowego stężenia trójpeptydu, uzyskiwany jest wszechstronny materiał startowy o doskonałej smakowitości, nadający się do zasilania wszelkiego rodzaju żywności i napojów o właściwościach obniżających ciśnienie krwi. [0067] Mieszanina peptydów uzyskana albo przed, albo po dodatkowym etapie oczyszczania, takim, jak na przykład chromatografia, mogą być stosowane do włączania do produktów żywnościowych, które są szeroko i regularnie konsumowane. Przykładami takich produktów są margaryny, smarowidła, różne produkty mleczne, takie, jak masło lub jogurty lub napoje zawierające mleko lub serwatkę, wyroby piekarnicze, takie, jak ciastka i ciasteczka, płynne wyroby żywnościowe, takie, jak zupy, jak również cukierki i substancje słodzące i bryłki cukru. W wyniku bardzo łagodnie smakujących hydrolizatów zawierających IPP, możliwe jest wprowadzanie hydrolizatu do wszelkiego rodzaju napojów obejmujących butelkowaną wodę stołową, napoje bezalkoholowe, napoje sportowe, soki owocowe, lemoniadę i błyskawiczne herbaty i kawy. [0068] Napój sportowy jest napojem, który ma na celu nawadnianie zawodników, jak również uzupełnianie elektrolitów, cukru i innych składników odżywczych. Napoje sportowe są zwykle izotoniczne, co oznacza, że zawierają one takie same proporcje składników odżywczych, jakie występują w ludzkim ciele. (Źródło: http://en.wikipedia.org/wiki/Sports_drink) [0069] Napoje energetyzujące są napojami, które zawierają (dozwolone prawnie) stymulanty, witaminy (zwłaszcza witaminy B) i minerały przeznaczone do dawania użytkownikowi przypływu energii. Typowe składniki obejmują kofeinę, guaranę (kofeinę z rośliny Guarana), taurynę, różne postacie zeń-szenia, maltodekstrynę, inozytol, karnitynę, kreatynę, glukuronolakton i ginkgo biloba. Niektóre mogą zawierać wysokie poziomy cukru, lub glukozy. Wiele takich napojów jest aromatyzowanych i/lub barwionych. (Źródło: http://en.wikipedia.org/wiki/Energy_drink) [0070] Napój bezalkoholowy (soft drink) jest napojem, który nie zawiera alkoholu, w przeciwieństwie do napojów alkoholowych (hard drinks), które [go] zawierają. Ogólnie, termin jest używany tylko do zimnych napojów. Gorąca czekolada, herbata i kawa nie są uważane za soft drinki. Ten termin początkowo dotyczył wyłącznie napojów gazowanych i jest nadal powszechnie tak używany. (Źródło: http://en.wikipedia.org/wiki/Soft_drink) -16- [0071] Chociaż takie kompozycje są zwykle podawane ludziom, mogą one być również podawane zwierzętom, korzystnie ssakom, dla złagodzenia nadciśnienia. Ponadto, wysokie stężenie peptydu obniżającego ciśnienie krwi w tak uzyskanych produktach czyni te produkty bardzo przydatnymi do włączania do suplementów diety w postaci pigułek, tabletek lub wysoko zagęszczanych roztworów lub past lub proszków. Szczególnie interesujące jest powolne uwalnianie suplementów diety, które zapewnia ciągłe uwalnianie peptydów. Peptydy mogą być sporządzane jako suchy proszek, na przykład w postaci pigułki, tabletki, granulki, saszetki lub kapsułki. Alternatywnie, mieszanina peptydów może być sporządzana jako płyn, na przykład, w syropie lub kapsułce. Kompozycje stosowane w różnych formulacjach i zawierające enzymy mogą również zawierać przynajmniej jeden składnik grupy stanowiący fizjologicznie dopuszczalny nośnik, środek pomocniczy, rozczynnik, stabilizator, bufor i rozcieńczalnik, które to terminy są używane w ich normalnym znaczeniu do oznaczania substancji, które pomagają w pakowaniu, dostawie, absorpcji, stabilizacji, lub w przypadku środka pomocniczego, zwiększaniu efektu fizjologicznego. Odpowiednie informacje podstawowe o różnych składnikach, które mogą być stosowane w połączeniu z mieszaniną peptydów w formie sproszkowanej, można znaleźć w "Pharmaceutical Dosage Forms", second edition, Volumes 1,2 and 3, ISBN 0-8247-8044-2 Marcel Dekker, Inc. (?Formy dawkowania farmaceutycznego?, drugie wydanie, Tomy 1,2 i 3, ISBN 0-8247-8044-2 Marcel Dekker, Inc.) lub w Remington?s Pharmaceutical Sciences, 20th edition Williams & Wilkins, PA, USA (Nauki farmaceutyczne Remingtona, wydanie 20-te Williams & Wilkins, PA, USA). Dla podawania doustnego, korzystnie stosowane są tabletki i kapsułki, które zawierają odpowiedni środek wiążący, np. żelatynę lub poliwinylopyrolidon (polyvinyl pyrrolidone), odpowiedni wypełniacz, np. laktozę lub skrobię, odpowiedni środek smarujący, np. stearynian magnezu i opcjonalnie inne dodatki. [0072] Względnie nową doustną formą podawania jest stosowanie różnych rodzajów kapsułek żelatynowych lub tabletek na bazie żelatyny. [0073] Podany jest hydrolizat, który jest wolny od fenyloalaniny, tryptofanu i tyrozyny. Używając GMP jako białka startowego, uzyskiwany jest hydrolizat, który nie zawiera fenyloalaniny, tryptofanu i tyrozyny. Powoduje to, że ten hydrolizat jest bezpieczny dla osób chorych na fenylenoketonurię (PKU). [0074] Ze względu na znaczenie naturalnego peptydu w zwalczaniu nadciśnienia, obecne i nowe wydajne kosztowo rozwiązanie oferuje atrakcyjny punkt startowy dla łagodnie hipotensyjnych produktów żywnościowych lub nawet weterynaryjnych. Ponieważ obecne rozwiązanie zawiera nieoczekiwanie prosty etap oczyszczania, możliwości skoncentrowanych suplementów diety dla obniżania ciśnienia krwi są również zwiększone. [0075] Sposób według wynalazku może być zrealizowany przy użyciu dowolnej oligo- lub endoproteazy specyficznej dla proliny. Przez oligopeptydazy specyficzne dla proliny zgodne z wynalazkiem lub stosowane według wynalazku rozumiane są enzymy należące do EC 3.4.21.26. Przez endoproteazę specyficzną dla proliny stosowaną według wynalazku rozumie się endoproteazę specyficzną dla proliny należącą do rodziny S28 proteaz seryny (Handbook of Proteolytic Enzymes; Barrett A. J.; Rawlings N.D.; Woessner J.F., Eds.; Academic Press, -17- London, UK, 1998, 369415) (Podręcznik enzymów proteolitycznych; Barrett A. J.; Rawlings N.D.; Woessner J.F., Eds.; Academic Press, London, UK, 1998, 369415) lub bardziej korzystnie, polipeptyd, jak podano w zastrzeżeniach 1 - 5, 11 i 13 WO 02/45524. W związku z tym, ta endoproteaza specyficzna dla proliny jest polipeptydem, który ma specyficzne dla proliny działanie endoproteolityczne, wybranym z grupy składającej się z: (a) polipeptydu, który ma sekwencję aminokwasów, która ma przynajmniej 40% sekwencji aminokwasów identycznej z aminokwasami 1 do 526 z SEQ ID NO:2 lub jej fragmentem; (b) polipeptydu, który jest kodowany przez polinukleotydy, który hybrydyzuje w łagodnych warunkach z (i) sekwencją kwasu nukleinowego z SEQ ID NO:1 lub jej fragmentem, który jest przynajmniej w 80% lub 90% identyczny z ponad 60, korzystnie z ponad 100 nukleotydami, bardziej korzystnie przynajmniej w 90% identyczny z ponad 200 nukleotydami, lub (ii) sekwencją kwasu nukleinowego komplementarną z sekwencją kwasu nukleinowego z SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:2, jak pokazano w WO 02/45524. Korzystnie, polipeptyd jest formą izolowaną. [0076] Preferowany polipeptyd stosowany według wynalazku ma sekwencję aminokwasów, która ma przynajmniej 50%, korzystnie przynajmniej 60%, korzystnie przynajmniej 65%, korzystnie przynajmniej 70%, bardziej korzystnie przynajmniej 80%, jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 90%, najkorzystniej przynajmniej 95%, i nawet jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej około 97% identyczności z aminokwasami 1 do 526 z SEQ ID NO: 2 lub obejmujący sekwencję aminokwasów z SEQ ID NO:2. [0077] Korzystnie, polipeptyd jest kodowany przez polinukleotydy, które hybrydyzują w łagodnych warunkach, bardziej korzystnie w średnio ostrych warunkach i najkorzystniej w bardzo ostrych warunkach, z (i) sekwencją kwasu nukleinowego z SEQ ID NO:1 lub jej fragmentem lub (ii) sekwencją kwasu nukleinowego komplementarną z sekwencją kwasu nukleinowego z SEQ ID NO: 1. [0078] Termin ?zdolne do hybrydyzowania? oznacza, że docelowy polinukleotyd według wynalazku może hybrydyzować do kwasu nukleinowego wykorzystywanego jako sonda (na przykład, sekwencja nukleotydów podana w SEQ. ID NO: 1 lub jej fragment lub komplement z SEQ ID NO: 1) na poziomie znacznie powyżej tła. Ujawnione są polinukleotydy, które kodują endoproteazę specyficzną dla proliny, jak również sekwencje nukleotydów, które są do nich komplementarne. Sekwencją nukleotydów może być RNA lub DNA, włącznie z genomowym DNA, syntetycznym DNA lub cDNA. Korzystnie, gdy sekwencją nukleotydów jest DNA, a najkorzystniej, genomowa sekwencja DNA. Typowo, polinukleotyd obejmuje ciągłą sekwencję nukleotydów, która jest zdolna do hybrydyzowania w selektywnych warunkach do sekwencji kodującej lub komplementu do sekwencji kodującej w SEQ ID NO: 1. Takie nukleotydy mogą być syntetyzowane zgodnie ze sposobami dobrze znanymi w dziedzinie. [0079] Polinukleotyd przydatny do używania w sposobie może hybrydyzować do sekwencji kodującej lub komplementu sekwencji kodującej w SEQ ID NO:1 na poziomie znacznie powyżej tła. Hybrydyzacja tła może wystąpić na przykład z powodu innych cDNA obecnych -18- w bibliotece cDNA. Poziom sygnału wytwarzanego przez interakcję pomiędzy polinukleotydem i sekwencją kodującą lub komplementem sekwencji kodującej z SEQ ID NO: 1 jest zwykle przynajmniej 10 razy, korzystnie przynajmniej 20 razy, bardziej korzystnie przynajmniej 50 razy i jeszcze bardziej korzystnie przynajmniej 100 razy intensywniejszy, niż interakcje pomiędzy innymi polinukleotydami i sekwencją kodującą z SEQ ID NO: 1. Intensywność interakcji może być mierzona na przykład przez radioznakowane sondy, na przykład przy użyciu 32P. Selektywna hybrydyzacja może być zwykle osiągana przy zastosowaniu warunków o niskiej ostrości (0,3M chlorku sodu i 0,03M cytrynianu sodu w temperaturze około 40°C), średniej ostrości (na przykład 0,3M chlorku sodu i 0,03M cytrynianu sodu w temperaturze około 50°C) lub wysokiej ostrości (na przykład 0,3M chlorku sodu i 0,03M cytrynianu sodu w temperaturze około 60°C). [0080] Pakiet UWGCG oferuje program BESTFIT, który może być używany do obliczania identyczności (na przykład, stosowany z jego domyślnymi nastawami). [0081] Algorytmy PILEUP i BLAST N mogą być również używane do obliczania identyczności sekwencji lub pokrywania się sekwencji (takich, jak identyfikowanie równoważnych lub odpowiadających sekwencji, na przykład z ich domyślnymi nastawami). [0082] Oprogramowanie dla przeprowadzania analiz BLAST jest publicznie dostępne w National Center for Biotechnology Information (narodowym Centrum Ilnformacji Biotechnologii) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ten algorytm obejmuje najpierw identyfikowanie par sekwencji o wysokiej punktacji (HSP) przez identyfikowanie krótkich słów o długości W w sekwencji zapytującej, która albo pasuje, albo spełnia pewien pozytywnie wartościowany wynik progowy T, gdy jest przyrównywany do słowa o tej samej długości w sekwencji z bazy danych. T jest określane jako wynik progowy sąsiedniego słowa. Te początkowe trafienia sąsiedniego słowa działają jak nasiona do inicjowania poszukiwań zawierających je HSP. Trafione słowa są rozciągane w obydwu kierunkach wzdłuż każdej sekwencji tak daleko, jak daleko może być zwiększany skumulowany wynik przyrównywania. Rozszerzenia trafień słów w każdym kierunku są wstrzymywane, gdy: wynik skumulowany przyrównywania spada o wartość X od maksymalnej osiągniętej wartości; kumulatywny wynik przyrównania dąży do zera lub poniżej, z powodu nagromadzenia jednego lub więcej ujemnych wyników przyrównań reszty; lub gdy osiągnięty jest koniec którejkolwiek sekwencji. Parametry W, T i X algorytmu BLAST określają czułość i prędkość przyrównywania. Program BLAST jako wartości domyślne używa długość słowa (W) 11, macierz wyników przyrównywania BLOSUM62 (B) 50, oczekiwanie (E) 10, M=5, N=4, i porównanie obu szczepów. [0083] Algorytm BLAST przeprowadza analizę statystyczną podobieństwa pomiędzy dwoma sekwencjami. Jedną miarą podobieństwa podawaną przez algorytm BLAST jest prawdopodobieństwo najmniejszej sumy (P(N)), która podaje wskazanie prawdopodobieństwa, z jakim mogłoby nastąpić dopasowanie pomiędzy dwoma nukleotydami lub sekwencjami aminokwasów. Na przykład, sekwencja jest uważana za podobną do innej sekwencji, jeśli prawdopodobieństwo najmniejszej sumy w porównaniu pierwszej sekwencji z drugą sekwencją wynosi mniej, niż około 1, korzystnie wynosi mniej, -19- niż około 0,1, bardziej korzystnie wynosi mniej, niż około 0,01 i najkorzystniej mniej, niż około 0,001. [0084] Szczepy z rodzaju Aspergillus mają status spożywczy, a enzymy uzyskiwane z tych mikroorganizmów są znane jako pochodzące z niepodejrzanego źródła spożywczego. Zgodnie z innym korzystnym przykładowym wykonaniem, enzym do stosowania w zastrzeżonym sposobie jest wydzielany raczej przez komórkę wytwarzającą go, niż niewydzielany tak zwany enzym cytozolowy. Dzięki temu rozwiązaniu, enzymy mogą być odzyskiwane z pożywki komórek w stanie zasadniczo czystym bez kosztownych etapów oczyszczania. Korzystnie, gdy enzym ma wysokie powinowactwo do swojego podłoża w panujących warunkach pH i temperaturowych. Opis Figur [0085] Figura 1: Profile aktywności oligopeptydazy specyficznej dla proliny z F. meningosepticum i endoproteazy specyficznej dla proliny z A. niger mierzone na podkładzie fluorescencyjnym ZGly-Pro-AMC w różnych warunkach pH. Fluorescencja była mierzona po 30 minutach w 37°C. Figura 2: Profil specyfiki endoproteazy prolylu uzyskanej z A. niger Figura 3: SDS-PAGE (STRONA SDS) nienaruszonej ovoalbuminy (białka jaja kurzego) i syntetycznego peptydu 27 po inkubacji z chromatograficznie oczyszczoną endoproteazą specyficzną dla proliny uzyskaną z A. niger. Materiały i sposoby [0086] Jadalny spray kazeinianu sodu i potasu (88%) uzyskano z DMV International, Holandia. GMP otrzymano z Aria, Dania (Lacprodan CGMP-10, lot # P340205). Syntetyczne chromogeniczne peptydy otrzymano albo z Pepscan Systems B.V. Holandia, lub z Bachem, Szwajcaria. Flavourzyme 1000L Batch HPN00218 otrzymano z Novozymes (Dania), Sumizyme FP z Shin Nihon (Japonia) i Corolase LAP Ch.: 4123 z AB Enzymes (UK). Endoproteaza specyficzna dla proliny z A. niger. [0087] Nadprodukcja endoproteazy specyficznej dla proliny z Aspergillus niger została zrealizowana, jak opisano w WO 02/45524. Działanie enzymu było testowane na syntetycznym peptydzie Z-Gly-Pro-pNA w temperaturze 37 stopni C w buforze cytrynianu/fosforanu dwusodowego pH 4,6. Produkt reakcji był monitorowany spektrofotometrycznie w 405 nM. Jednostka jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która uwalnia 1 ?mol of p-nitroanilidu na minutę w warunkach testowych i przy stężeniu podłoża 0,37mM Z-Gly-Pro-pNA. Chromatograficzne oczyszczanie endoprotazy uzyskanej z A. niger [0088] Pożywka kultury uzyskana z nadprodukcji szczepu A. niger była używana do chromatograficznego oczyszczania proteazy dla usuwania wszelkich skażających działań endo- i egzoproteolitycznych. Dotychczas pożywka fermentacji była najpierw odwirowywana -20- dla usunięcia większości masy grzybowej, a odciek był następnie przepuszczany przez kilka filtrów o zmniejszających się wielkościach porów dla usunięcia wszystkich fragmentów komórek. Ostatecznie, uzyskany ultrafiltrat był rozcieńczany dziesięć razy w 20 milimoli/litr octanu sodu pH 5,1 i wprowadzany do kolumny Q-Sepharose FF. Białka wymywano z gradientem od 0 do 0,4 moli/litr NaCl w 20 milimoli/litr octanu sodu pH 5,1. Frakcje szczytowe wykazujące działanie w stosunku do rozszczepiania Z-Gly-Pro-pNA były zbierane i łączone, zgodnie z protokołem opisanym w World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209 - 212 (1995) (Światowym czasopiśmie mikrobiologii i biotechnologii 11, 209 212 (1995)), ale w nieco zmienionych warunkach testowych. Biorąc pod uwagę optimum pH endoproteazy specyficznej dla proliny uzyskanej z A. niger, analiza enzymu była przeprowadzana w buforze pH 4,6 cytrynianu/dwufosfatu w 37°C. Przez łączenie aktywnych frakcji z następnym zagęszczaniem ostatecznie uzyskano preparat, który wykazywał tylko pojedyncze pasmo na SDS-PAGE i jeden szczyt na HP-SEC. Dalsza analiza przez chromatografię interakcji hydrofobowej potwierdziła czystość uzyskanego preparatu enzymatycznego. Azot Kjeldahl [0089] Suma azotu Kjeldahl była mierzona przez Analizę Przepływu Wtryskowego (Flow Injection Analysis). Używając Tecator FIASTAR 5000 Flow Injection System wyposażony w TKN Method Cassette 5000-040, komputer Pentium 4 z oprogramowaniem SOFIA i Tecator 5027 Autosampler, określano ilościowo amoniak uwalniany z roztworów zawierających białko przy 590 nm. Ilość próbki odpowiadająca dynamicznemu zakresowi sposobu (0,5 - 20 mg N/I) jest umieszczana w rurze trawienia razem z 95-97% kwasem siarkowym i produkt Kjeltab został poddany programowi trawienia przez 30 minut w 200 stopniach C i następnie przez 90 minut w 360 stopniach C. Po wtryśnięciu azotu do systemu FIASTAR 5000 mierzony jest szczyt azotu, z którego może być wnioskowana ilość mierzonego białka. Analiza aminokwasów [0090] Precyzyjnie zważona próbka materiału proteinowego została rozpuszczona w rozcieńczonym kwasie, a wytrącenia były usuwane przez odwirowywanie w wirówce Eppendorf. Analiza aminokwasów została przeprowadzona na czystym odcieku zgodnie ze sposobem PicoTag, jak podano w podręczniku operatorów Aminoacid Analysis System of Waters (Milford MA, USA). Dotychczas odpowiednia próbka była uzyskiwana z płynu, następnie suszona i poddawana hydrolizie pary uciekającej z kwasu i wydzielana przy użyciu fenylizotiocjanatu. Różne uzyskiwane występujące aminokwasy były oceniane ilościowo za pomocą sposobów HPLC i dodawane do obliczania sumarycznego poziomu wolnych aminokwasów, włącznie z uzyskiwanym IIe, w ważonej próbce. Aminokwasy Cys i Trp nie są uwzględnione w danych uzyskanych z tej analizy. Analiza LC/MS/MS [0091] HPLC wykorzystujący spektrometr masowy z pułapką jonową (Thermoquest?, Breda, Holandia) sprzężony z pompą P4000 (Thermoquest?, Breda, Holandia) został wykorzystany do analizy ilościowej danych peptydów, spośród tych trójpeptydów IPP, LPP i VPP, w -21- enzymatycznych hydrolizatach białka wytwarzanych przez wynalazczą mieszaninę enzymów. Tworzone peptydy były rozdzielane przy użyciu kolumny Inertsil 3 ODS 3, 3 mm, 150*2.1 mm (Varian Belgium, Belgia) w połączeniu z gradientem 0,1 % kwasu mrówkowego w wodzie Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA; Roztwór A) i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu (Roztwór B) dla wymywania. Gradient zaczynał się od 100% Roztworu A, utrzymywany przez 5 minut, wzrastał liniowo do 5 % B w ciągu 10 minut, następnie wzrastał liniowo do 45% roztworu B w ciągu 30 minut i natychmiast przechodził do warunków początkowych utrzymywanych przez 15 minut dla ustabilizowania. Wtryskiwana objętość wynosiła 50 mikrolitrów, wielkość przepływu wynosiła 200 mikrolitrów na minutę, a temperaturę kolumny utrzymywano przy 55°C. Stężenie białka we wtryskiwanej próbce wynosiło około 50 mikrogramów/mililitr. [0092] Szczegółowa informacja o poszczególnych peptydach została uzyskana przy użyciu dedykowanego MS/MS dla danych peptydów, przy zastosowaniu optymalnej energii kolizji około 30 %. Kwantyfikacja (ocena ilościowa) była przeprowadzana w trybie LC/MS/MS przy użyciu trybu elektro-natrysku dodatniej jonizacji znakowanej C13 + N15 z normą IPP, przy użyciu linii kalibrowania również ze znakowaną normą międzynarodową dla skorygowania efektu macierzowego. Identyfikacja jest przeprowadzana na podstawie czasu retencji , jonu prekursorowego i stosunku charakterystycznych fragmentacji. [0093] Trójpeptyd LPP (M=325.2) był zastosowany do dostrojenia optymalnej czułości w trybie MS i dla optymalnej fragmentacji w trybie MS/MS, przeprowadzania stałej infuzji 5 mg/ml, powodując powstanie protonowanej molekuły w trybie MS i optymalnej energii kolizji około 30 % w trybie MS/MS, wytwarzając serię pasma jonów B- i Y-. [0094] Przed LC/MS/MS, enzymatyczne hydrolizaty białka były odwirowywane w temperaturze otoczenia i 13000 obr/min przez 10 minut, filtrowane przez filtr 0,22 ?m a odciek był rozcieńczany w stosunku 1:100 wodą MilliQ. [0095] Stopień Hydrolizy (Degree of Hydrolysis - DH) uzyskiwany podczas inkubacji z różnymi mieszaninami proteolitycznymi był monitorowany za pomocą szybkiego testu OPA (JFS, Vol 66, NO 5, 2001). Przykład 1 Enzym uzyskiwany z A. niger przedstawia nową klasę enzymów specyficznych dla proliny. [0096] Z całej sekwencji kodowania endoproteazy specyficznej dla proliny uzyskanej z A. niger, jak podano w WO 02/45524, mogła być określona sekwencja białka aminokwasów 526. Nowość enzymu została potwierdzona przez przeszukiwania przez BLAST baz danych, takich, jak SwissProt, PIR i trEMBL. Ku naszemu zaskoczeniu, nie mogła być wykryta żadna czysta homologia pomiędzy enzymem A. niger i znanymi ligopeptydazami prolylu. Bliższa inspekcja sekwencji aminokwasu stwierdziła jednak niską, ale znaczącą homologię do karboksypeptydaz Pro-X (EC3.4.16.2), aminopeptydaz dipeptydylu I (EC3.4.14.2), i proteazy -22- seryny specyficznej dla grasicy. Wszystkie te enzymy zostały przypisane do rodziny S28 peptydaz seryny (Handbook of Proteolytic Enzymes; Barrett A. J.; Rawlings N.D.; Woessner J.F., Eds.; Academic Press, London, UK, 1998, 369-415) (Podręcznik Enzymów Proteolitycznych; Barrett A. J.; Rawlings N.D.; Woessner J.F., Eds.; Academic Press, Londyn, UK, 1998, 369-415). Również konfiguracja GxSYxG wokół aktywnego miejsca seryny jest zachowana pomiędzy enzymami i endoproteazą uzyskaną z A. niger. Ponadto, członkowie rodziny S28 mający kwasowe optimum pH, mają specyfikę rozszczepiania po stronie karboksyterminalnej reszty prolinowej i są syntetyzowane z sygnałową sekwencją i pro peptydu takiego, jak endoproteaza specyficzna dla proliny uzyskana z A. niger. Również wielkość enzymu A. niger jest podobna do członków rodziny S28. W związku z tym, endoproteaza specyficzna dla proliny z A. niger okazuje się być raczej członkiem rodziny S28 proteaz seryny, niż rodziny S9, do której została pogrupowana większość oligopeptydaz cytozolowych oligopeptydaz prolylu włącznie z enzymem uzyskanym z Flavobacterium meningosepticum. Na podstawie cech strukturalnych i fizjologicznych doszliśmy do wniosku, że enzym z A. niger należy raczej do rodziny S28 niż do rodziny S9 proteaz seryny. Dodatkową cechą, która dyskryminuje enzym uzyskiwany przez A. niger z oligopeptydaz prolylu należących do rodziny S9 jest fakt, że, przeciwnie do cytozolowych proteaz prolylu należących do tej ostatniej rodziny, nowo zidentyfikowany enzym A. niger jest wydzielany do ośrodka wzrostu. Jest to pierwszy raport o wyizolowaniu i charakteryzacji członka rodziny S28 z niższego eukariotu. Przykład 2 Widma aktywności pH endoproteazy specyficznej dla proliny z A. niger i oligopeptydazy specyficznej dla proliny z F. meningosepticum. [0097] Dla zademonstrowania różnicy w optymalnym pH, które występuje pomiędzy endoproteazą specyficzną dla proliny uzyskaną z Aspergillus i oligopeptydazą specyficzną dla proliny z Flavobacterium meningosepticum, zmierzyliśmy ich aktywności w różnych warunkach pH. Endoproteaza pochodząca z Aspergillus została uzyskana, jak opisano w rozdziale Materiały i Sposoby. Oligopeptydaza pochodząca z Flavobacterium została zakupiona w ICN Biomedicals (35 jednostek/mg; nr kat. 32082; Ohio,USA). [0098] Dla ustalenia widma działalności pH tych dwóch enzymów, zostały sporządzone bufory o różnych wartościach pH. Bufory z zakresem od pH 2, 0 do 7,0 zostały sporządzone przy użyciu 0,1 mol/l cytrynianu, bufory z zakresem od pH 6,0 do 9,0 zostały sporządzone przy użyciu 0,1 mol/l tris (tris (hydroksymetyl) aminometanu) a bufory z zakresem od pH 8,0 do 12,0 zostały wykonane przy użyciu 0,2 mol/l glicyny. Wymagane wartości pH były regulowane przy użyciu albo HCl, albo NaOH. Jako podłoże dla obu enzymów został zastosowany chromogeniczny syntetyczny peptyd Z-Gly-Pro-AMC (Bachem, Szwajcaria). Do każdej studzienki (płytki Costar no. 3631) wprowadzono 85 uL buforu, 10 uL roztworu enzymu i 5 uL podłoża (4mM Z-Gly-Pro-AMC w 60% metanolu). Końcowe stężenie enzymu z A. niger wynosiło 32 ug/ml (3,2 mili jednostki/ml), końcowe stężenie enzymu z F. meningosepticum wynosiło 0,21 ug/ml (7,4 milli jednostki/ml). Po wymieszaniu umożliwiono postępowanie reakcji przez 30 minut w 37,0°C, po czym została zmierzona fluorescencja w -23- czytniku płytek CytoFluor multi-well z PerSeptive Biosciences. Uzyskane względne dane są pokazane na Figurze 1. Została również ustalona optymalna temperatura endoproteazy prolylu. Dotychczas preparat enzymatyczny był inkubowany w roztworze 0,1 mol/l octanu Na zawierającym 0,02 mol/l CaCl2 przy pH 5,0 przez 2 godzin w różnych temperaturach z użyciem Kazeinae Resorufine (Roche wersja 3) jako podłoża i działalność enzymu była oceniana ilościowo przez pomiar w 574 nm. Zgodnie z uzyskanymi wynikami, endoproteaza specyficzna dla proliny z A. niger ma optymalną temperaturę około 50 stopni C. Przykład 3 Specyfika endoproteazy specyficznej dla proliny pochodzącej z A. niger. [0099] Testowane były próbki surowego, jak również chromatograficznie oczyszczonego enzymu próbki uzyskane ze szczepu A. niger zawarte w wielu kopiach w kasetach ekspresyjnych (WO 02/45524) pod względem zbierania podłoży chromogenicznego peptydu dla ustalenia specyfiki kodowanej endoproteazy. Działanie endoproteolityczne enzymu było testowane na podłożu AAXpNA. Podłoża ?pNA? (p-Nitroanilid) powodują zmiany koloru, gdy wiązanie peptydu X-pNA jest rozszczepiane; ?X? przedstawia różne naturalne reszty aminokwasowe. Roztwory zapasowe podłoży AAX-pNA (150 mmol/l) były rozcieńczane 100X w 0,1M buforu octanowego o pH 4,0 zawierającego 20 CaCl2. 10-minutowe pomiary kinetyczne w 40 stopniach C w czytniku TECAN Genios MTP Reader (Salzburg, Wiedeń) w 405 nm zarejestrowały wzrosty gęstości optycznej, które poprzez przetwarzanie danych w Excelu utworzyły obraz pokazany na Figurze 2. Wyniki pokazują wyraźnie, że endoproteaza pochodząca z A. niger jest bardzo specyficzna dla wiązań peptydu prolylu z działaniem ubocznym w kierunku wiązań alanylowych. Surowe i chromatograficznie oczyszczone preparaty wykazały podobne profile działalności. Skażenie endoproteazy pochodzącej z A. niger aminopeptydazami, karboksypeptydazami lub endoproteazami niespecyficznymi dla proliny mogłoby być pokazane jako znaczące (patrz Przykład 5) Przykład 4 Endoproteaza specyficzna dla proliny pochodząca z A. niger może hydrolizować duże białka, jak również małe peptydy i jest więc prawdziwą endoproteazą. [0100] Ze względu na szczególne cechy strukturalne, oligopeptydaza prolylu należąca do rodziny S9 nie może trawić peptydów większych, niż 30 aminokwasów. To ograniczenie jest oczywistą wadą enzymu, który jest przeznaczony do hydrolizowania różnych białek możliwie szybko i wydajnie. Aby zobaczyć, czy pochodząca z A. niger endoproteaza specyficzna dla proliny wykazuje te same ograniczenia pod względem wielkości molekuły podłoża, inkubowaliśmy chromatograficznie oczyszczoną endopeptydazę prolylu pochodzącą z A. niger z małą ilością syntetycznego peptydu i z dużą molekułą białka jaja kurzego (ovoalbuminy) i analizowaliśmy produkty hydrolizy przy pomocy SDS-PAGE. [0101] Zastosowanym peptydem syntetycznym był peptyd 27 o sekwencji NH2FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR-COOH i został podarowany przez firmę Pepscan (Lelystad, Holandia). Jak pokazano, przez jego sekwencję aminokwasów, ten peptyd zawiera 2 reszty prolinowe, jedną w środku i jedną w pobliżu końca karboksyterminalnego peptydu. -24- [0102] Nienaruszona molekuła białka jaja kurzego (Pierce Imject, fiolki zawierające 20 mg zamrożonego suszonego materiału) zawiera 385 aminokwasów o ciężarze cząsteczkowym 42 750 Da. Ta molekuła zawiera 14 reszt prolinowych, z których jedna znajduje się w samym końcu C-końcowym i nie może być rozszczepiana przez endoproteazę specyficzną dla proliny. Albumina jaja kurzego i oligopeptyd były inkubowane oddzielnie w 50°C z oczyszczoną endoproteazą specyficzną dla proliny pochodzącą z A. niger. W kilku zakresach czasowych były pobierane próbki, które były następnie analizowane za pomocą SDS-PAGE. [0103] Chromatograficznie oczyszczona endoproteaza specyficzna dla proliny pochodząca z A. niger o aktywności 4,5 jednostek/ml została rozcieńczona 100 razy buforem octanowym 0,1 M o pH 4 zawierającym 20 mM CaCl2. Albumina jaja kurzego była rozpuszczona w buforze octanowym o pH 4 do stężenia 1 mg/ml (22?M). Peptyd 27 został rozcieńczony tym samym buforem do uzyskania stężenia 0,48 mg/ml (152?M). Stężenie molarne (molarity) roztworu albuminy jaja kurzego i peptydu 27 zostało wybrane tak, że oba roztwory miały takie same stężenie molarne rozszczepialnych reszt prolinowych. Albumina jaja kurzego zawiera 13 potencjalnie rozszczepialnych miejsc proliny, podczas gdy peptyd 27 ma tylko dwa. Z obu roztworów podłoży, 0,5 ml inkubowano z 10 ?l (0,45milliU) roztworu enzymu w termo-mikserze Eppendorf w 50°C. W kilku zakresach czasowych, z mieszaniny inkubowanej były pobierane próbki 10 ?l i były utrzymywane w 20°C aż do badania przez SDS-PAGE. Wszystkie materiały używane do SDS-PAGE i barwienia były zakupione w Invitrogen. Próbki były przygotowane za pomocą buforu SDS zgodne z instrukcjami producenta i oddzielone na żelach 12% Bis-Tris przy użyciu systemu bufora MES-SDS zgodnie z instrukcjami producenta. Barwienie było przeprowadzane za pomocą Simply Blue Safe Stain (Collodial Coomassie G250). [0104] Jak można stwierdzić z Figury 3, albumina jaja kurzego jest rozszczepiana przez enzym pochodzący z Aspergillus na dyskretne pasmo około 35 do 36kD podczas pierwszych 4,75 godzin inkubacji (ścieżka 3). Dłuższe okresy inkubacji powodowały dalsze rozrywanie na mniejsze produkty o różnych ciężarach cząsteczkowych (ścieżka 7). [0105] Peptyd 27 jest również rozrywany, jak oceniono po słabszych prążkach w ścieżkach 4, 6 i 8 w porównaniu ze ścieżką 2. Bardzo małe przesunięcie ciężaru cząsteczkowego produktu (porównanie ścieżek 9 i 8) jest najprawdopodobniej spowodowane rozszczepianiem reszty argininowej w końcu karboksylowym peptydu. Różnica wynosi około 200D (mierzona za pomocą oprogramowania Alphalmager 3.3d w systemie Alphalmager 2000) i arginina miała MW 174. To małe przesunięcie ciężaru cząsteczkowego jest prawdopodobnie pierwszym etapem rozrywania peptydu. [0106] Dalszy rozpad produktu można uznać jedynie jako zmniejszenie intensywności pasma w żelu SDS. Produkty dalszego rozpadu nie są widoczne, ponieważ przy składnikach barwiących żel o ciężarze cząsteczkowym - MW około 1000 nie jest to możliwe przy użyciu barwnika Coomassie Brillant Blue. Z tego doświadczenia można wyciągnąć wniosek, że, przeciwnie do znanych oligopeptydaz prolylu należących do rodziny S9, endoproteaza specyficzna dla proliny pochodząca z A. niger nie ma szczególnej preferencji do rozszczepiania małowymiarowych peptydów w porównaniu z większymi białkami. A więc -25- enzym pochodzący z A. niger przedstawia prawdziwą endoproteazę i preferowany enzym do hydrolizowania różnych rodzajów białek. Przykład 5 Ocena ilościowa pożądanych i zanieczyszczających działań enzymów w wytwarzaniu peptydów obniżających ciśnienie krwi. [0107] Względnie czysty IPP może być uzyskiwany w prostym jednoetapowym sposobie odzyskiwania IPP z GMP. Frakcja zawierająca IPP może być uzyskiwana z GMP za pomocą różnych preparatów enzymatycznych. Na przykład, przez inkubowanie GMP albo z czystą endoproteazą specyficzną dla proliny, albo z czystą endoproteazą specyficzną dla proliny plus czystą aminopeptydazą lub z czystą oligopeptydazą specyficzną dla proliny w połączeniu ze śladową ilością innej czystej endopeptydazy, takiej, jak subtilizyna lub metaloproteaza (do rozszczepiania GMP na mniejsze fragmenty tworzące ulepszone podłoża dla oligopeptydazy) lub czysta aminopeptydaza w połączeniu z aminopeptydazą trójpeptydylu specyficzną dla proliny (jak występuje w handlowym preparacie "Umamizyme" z Amano, Japonia), lub złożone preparaty enzymatyczne wykazujące różne rodzaje działań proteolitycznych. W tym Przykładzie były testowane trzy handlowe preparaty enzymatyczne pod względem ich różnych działań proteolitycznych tzn.: Flavourzyme 1000L Batch HPN00218 (Novozymes), Sumizyme FP (Shin Nihon, Japonia) i Corolase LAP Ch.: 4123 (AB Enzymes, UK). Zarówno Flavourzyme, jak i Sumizyme FP są znane jako złożone preparaty enzymatyczne, które wykazują kilka enzymatycznych działań aminopeptydolitycznych, poza niespecyficznymi działaniami endoproteolitycznymi i karboksypeptydolitycznymi. Corolase LAP przedstawia względnie czystą, klonowaną i nadekspresyjną działalność aminopeptydazy leucyny pochodzącej z Aspergillus. [0108] Zasadniczo czysta oznacza, że działania skażających endoproteaz, jak również skażających karboksypeptydaz lub aminopeptydaz w stosowanych warunkach inkubacji są minimalne lub korzystnie niewystępujące. Została opracowana poniższa procedura testowania do ilościowej oceny takich skażających działań endo-, amino- i karboksypeptydaz. [0109] Podstawa dla procedury testowania jest tworzona przez zbieranie różnych selektywnych peptydów chromogenicznych. Ponieważ tylko specyficzne dla proliny oligo- i endoproteazy mogą uwalniać pNA z peptydu Z-AAAP-pNA, ten szczególny peptyd został użyty do oceny ilościowej pożądanej działalności endoproteolitycznej specyficznej dla proliny. Ponieważ wiele endoproteaz może uwalniać pNA z peptydów Z-AAAF-pNA i ZAAAR-pNA, te dwa peptydy były zastosowane do oceny ilościowej skażającej, niespecyficznej dla proliny działalności endoproteolitycznej. Ponieważ konwersja peptydów QNIPP i VVVPP występujących w molekule beta-kazeiny odpowiednio do IPP i VPP wymaga aminopeptydaz, które mogą skutecznie usuwać reszty Gln i Val, peptydy Q-pNA i V-pNA zostały zastosowane do kwantyzacji (oceny ilościowej) wymaganych działań aminopeptydazy. Ponieważ wiele karboksypeptydaz może uwalniać reszty Phe i Arg z peptydów, peptydy zawierające te reszty zostały wybrane do kwantyzacji (oceny ilościowej) skażających działań karboksypeptydazy. Jednak nie było odpowiednich grup chromogenicznych do pomiaru działań karboksypeptydazy, tak, że musiał być opracowany -26- alternatywny sposób wykorzystujący syntetyczne peptydy Z-AF i Z-AR. Ten alternatywny sposób jest podany poniżej. We wszystkich używanych syntetycznych peptydach ?Z? przedstawia benzyloksykarbonyl, a ?pNA? chromofor para-nitroanilidu. Wszystkie chromogeniczne peptydy zostały uzyskane z Pepscan (Lelystad, Holandia). Peptydy Z-AF i Z-AR zostały zakupione w Bachem (Szwajcaria). Wszystkie inkubacje były przeprowadzane w 40°C. Rozcieńczone preparaty enzymatyczne były przeliczane do stężenia produktu handlowego. Pomiar działalności aminopeptydazy [0110] Roztwory zapasowe 150mmol/l V-pNA i Q-pNA w 100% DMSO zostały rozcieńczone 80 razy w buforze 0,1 M BisTris o pH 6 do uzyskania roztworu podłoża 3,75 mmol/l V-pNA+ Q-pNA zawierającego V-pNA i Q-pNA w proporcji 1:1. 200 ?l porcja tego roztworu podłoża aminopeptydazy była pipetowana do oddzielnych studzienek płytek mikromiareczkowania (MTP), MTP jest wstępnie inkubowana w 40°C w Tecan Genios MTP (Salzburg, Wiedeń) działającym z oprogramowaniem Magellan4. Reakcja została zapoczątkowana przez dodanie 50 ?l roztworu odpowiedniego enzymu, tak, że inkubacja nastąpiła w podłożu o stężeniu 3mM. Typowo zastosowano rozcieńczenie 1:50 płynnej próbki enzymu Flavourzyme, Corolase LAP i specyficznej dla proliny endoproteazy. Został zastosowany 1% roztwór suchego produktu Sumizyme FP. [0111] Żółty kolor zmierzony w 405nm przez Tecan Genios MTP powstał w wyniku rozszczepienia wiązania aminokwas-pNA z następnym i przynajmniej 20 cyklami kinetycznymi (około 10 minut). Wytworzone przez oprogramowanie dane pokazały wynik OD405/min. Pomiar działalności endoproteazy specyficznej dla proliny. [0112] Ten pomiar został przeprowadzony zasadniczo tak samo, jak próba aminopeptydazy, ale w tym przypadku jako jedyne podłoże zostało zastosowane Z-AAAPpNA o końcowym stężeniu 3mmol/l. To podłoże zostało rozpuszczone przez ogrzewanie zawiesiny w buforze o pH 6 do 50 - 55° C, dając przezroczysty roztwór w temperaturze pokojowej. Pomiary były przeprowadzane w 40°C. [0113] Typowo stosowano rozcieńczenie 1:50 płynnej próbki enzymu Flavourzyme i Corolase LAP. Sumizyme FP został zastosowany w 1% roztworze. Specyficzna dla proliny endoproteaza była typowo używana w rozcieńczeniu 1:5000. [0114] Oprogramowanie wytworzyło dane OD405/min. Pomiar skażającej działalności endoproteazy niespecyficznej dla proliny. [0115] Również ten pomiar został przeprowadzony zasadniczo tak samo, jak opisano dla badania aminopeptydazy, ale w tym zestawie testu jako podłoże zastosowano Z-AAAF-pNA i Z-AAAR-pNA w proporcji 1:1 o końcowym stężeniu 3mmol/l. Podłoże Z-AAAF-pNA okazało się słabo rozpuszczalne w zastosowanych warunkach testu pH 6,0, ale inkubacja testowa z subtilizyną spowodowała gwałtowne rozpuszczenie podłoża z jednoczesnym uwalnianiem pNA. Pomiary były przeprowadzane w 40°C. Jednak, dla skompensowania tej -27- słabej rozpuszczalności, czytnik MTP został zaprogramowany do wstrząsania pomiędzy cyklami kinetycznymi. [0116] I znów oprogramowanie wygenerowało dane jako OD405/min. Pomiar skażającej działalności karboksypeptydazy [0117] Ponieważ nie są dostępne żadne czułe chromogeniczne peptydy do pomiaru działalności karboksypeptydazy, do kwantyzacji (oceny ilościowej) Karboksypeptydazy C został zastosowany sposób oparty na protokole Boehringer. [0118] Dwa roztwory zapasowe 150 mmol/l Z-A-F i Z-A-R w etanolu zostały rozcieńczone 80 razy w buforze 0,1 mol/l BisTris o pH 6 do uzyskania roztworu podłoża 3,75 mmol/l Z-AF + Z-A-R zawierającego Z-A-F i Z-A-R w proporcji 1:1. Następnie 200 ?l roztworu podłoża pipetowano do fiolki eppendorf i wstępnie inkubowano w 40° C. Reakcja została zapoczątkowana przez dodanie 50 ?l odpowiednio rozcieńczonego enzymu. Typowo zastosowano rozcieńczenie 1:50 Flavourzyme i Corolase LAP i endoproteazy specyficznej dla proliny. Dla Sumizyne FP został zastosowany 1% roztwór. Po 5 minutach reakcja została zatrzymana przez dodanie 250 ?l odczynnika ninhydryny. Odczynnik ninhydryna został sporządzony z 400mg ninhydryny (Merck) i 60 mg hydrindantyny rozcieńczonej 15 ml DMSO, do którego dodano 5 ml 4,0 mol/l bufora octanu litu o pH 5,2. 4,0 mol/l bufora octanu litu sporządzono przez rozpuszczenie LiOH (Sigma), po czym pH roztworu wyregulowano do pH 5,2 używając lodowatego kwasu octowego (Merck). [0119] Po zatrzymaniu reakcji, każda próbka była ogrzewana przez 15 minut w 95°C dla ułatwienia wytwarzania koloru i następnie rozcieńczona 10 razy czystym etanolem. Wytworzony kolor był mierzony w 578 nm w spektrofotometrze Uvikon. Próbki ślepe były wykonane tak samo, jak próbki aktywności, ale odwrócono dodawanie odczynnika ninhydryny i enzymu. Dla kwantyzacji (oceny ilościowej) ilości wolnych aminokwasów wytwarzanych przez działalność karboksypeptydazy, do wytworzenia krzywej kalibrowania został zastosowany aminokwas L-fhenylalaniny. Roztwory w buforze o pH 6 zawierającym 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5 i 3,0 mmol/l L-fhenylalaniny (Sigma) były traktowane tak samo, jak próbki, tzn. w fiolce 250?l. Wartości uzyskano z OD578, krzywa została zbudowana w Excelu. Za pomocą tej krzywej były obliczane stężenia wolnych aminokwasów obecnych w próbkach zawierających podłoża Z-A-F i Z-A-R. Z uzyskanych wartości została obliczona działalność karboksypeptydazy w mikomolach na ilość testowanego enzymu. Obliczanie wskaźników aktywności [0120] Dla ustalenia przydatności różnych preparatów enzymatycznych do sposobu według wynalazku został obliczony iloraz odpowiednich działań enzymatycznych. W testach opartych na czytniku MTP, aktywności enzymów są charakteryzowane przez uwolnienia pNA w czasie, tzn. jako ?OD405 / min. Ilorazy aktywności enzymatycznej uzyskiwane przez czytnik MTP były obliczane przez proste podzielenie wartości ?OD / min uzyskanych dla tych samych ilości enzymu. -28- [0121] Jednak w przypadku badania karboksypeptydazy, wytwarzane jest OD, które nie może być porównywane bezpośrednio z ?OD/min wytwarzanym przez badanie oparte na MTPpNA. Tutaj zmierzone OD było najpierw konwertowane do ?moli uwalnianego aminokwasu na minutę (?mol/min). Następnie ?OD/min uwalnianego pNA było konwertowane na ?mol/min. Dotychczas krzywa kalibrowania była wytwarzana w czytniku MTP, w którym mierzone były rozcieńczenia czystego pNA (Sigma) 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312 i 0,015 mmol/l i 250?l na studzienkę. W Excelu z uzyskanych danych została zbudowana krzywa kalibrowania. Z tej krzywej kalibrowania ?OD/min zostało przekonwertowane do ?mol/min, tak, że pomiary oparte na pNA mogły być porównywane z pomiarami opartymi na ninhydrynie. [0122] Na podstawie danych wytworzonych w wyżej wymienionych testach zostały scharakteryzowane różne używane preparaty enzymatyczne. Dane działań specyficznej dla proliny oligo- lub endoproteolitycznej występujące w każdym preparacie enzymatycznym, są pokazane w Tabeli 1 w kolumnie ?Działalność specyficzna dla proliny?. Dane o wymaganych działalnościach aminopeptydazy (Działalność specyf. dla AP/Prol) i skażającej karboksypeptydazy (Działalność specyficzna dla CPD/Prol) i endoproteolityczne działania (Działalnośc specyficzna dla Endo/Prol) są pokazane w stosunku do występujących działań specyficznych dla proliny. Wymagana działalność aminopeptydazy względem działalności skażającej karboksypeptydazy występującej w każdym preparacie pokazana jest jako (AP/CPD). [0123] Jest oczywiste, że żaden z testowanych handlowych preparatów enzymatycznych nie wykazuje znaczącej specyficznej dla proliny oligo- lub endoproteolitycznej działalności. Ponadto, wszystkie testowane handlowe preparaty enzymatyczne zawierają karboksypeptydazę i działania endoproteolityczne. Kombinacja enzymów C1 składa się z mieszaniny 4 jednostek endoproteazy specyficznej dla proliny plus 130 mikrolitrów handlowego Corolase LAP stosowanej na gram obecnego podłoża proteinowego. Wytwarza to z wysoką wydajnością peptydy hamujące ACE IPP, VPP i LPP wyróżniające się z powodu ich bardzo niskich poziomów skażającej karboksypeptydazy i działań endoproteolitycznych. Tabela 1: Działalność specyficzna proliny * Działalność dla specyficzna CPD/ Prol Działalność Działalność dla specyficzna dla specyficzna AP/ Prol Endo/ Prol AP/ CPD dla Sumizyme 0,004 21,7 1,2 1,7 0,06 Flavourzyme 0,0007 253,5 25,6 35,5 0,10 Corolase LAP 0,0 Specyf. dla 100 proliny A.niger 0,74 0,005 0,00001 0,000004 0,00 -29- C1 75 0,001 0,00031 0,000391 0,25 * Sumizyme było mierzone w 1% roztworze, Flavourzyme i Corolase w rozcieńczeniu 1:50. Działalność specyficzna dla proliny uzyskanej z A. niger była mierzona w rozcieńczeniu 1:5000 i C1 w rozcieńczeniu 1:3773. Dane były następnie przeliczane na działalność występującą w dostarczonym produkcie. [0124] Na podstawie ich wysokiej zawartości działań amino- i karboksypeptydazy, można spodziewać się, że inkubacje GMP ze złożonymi mieszaninami enzymów Sumizyme FP i Flavourzyme będą wytwarzały wysokie poziomy wolnych aminokwasów. Można się spodziewać, że te wolne aminokwasy będą nadawać pożywce posmaki w wyniku zwiększonych reakcji Maillarda. Ponadto, występowanie działań endoproteolitycznych niespecyficznych dla proliny lub niespecyficznych dla alaniny w tych preparatach enzymatycznych będzie prowadzić do rozpuszczalności dodatkowych i być może bioaktywnych peptydów w produkcie końcowym, tym samym rozmywając czysty efekt obniżania ciśnienia krwi IPP. Dla zminimalizowania wszystkich tych niepożądanych reakcji ubocznych, preferowana jest kombinacja zasadniczo czystej proteazy specyficznej dla proliny z zasadniczo czystą aminopeptydazą. Jeszcze bardziej preferowane jest stosowanie tylko zasadniczo czystej endoproteazy specyficznej dla proliny. Przykład 6 Izolowanie GMP i IPP z kazeinatu [0125] Handlowo dostępny GMP jest uzyskiwany z serwatki sera. W tym sposobie mleko jest inkubowane z chymozyną dla uwolnienia rozpuszczalnej części GMP z kappa kazeiny. W wyniku tego, wytrącenia kazeinowe tworzą twaróg, gdzie część GMP przechodzi do serwatki sera, z której może być izolowana wieloma różnymi sposobami. W tym Przykładzie opisujemy alternatywną formę izolowania GMP, tzn. izolowanie z dostępnego w handlu kazeinatu. Zaletą tego rozwiązania jest to, że po selektywnym usunięciu GMP, pozostała frakcja kazeinatu może być wykorzystana do zastosowań alternatywnych. Zgodnie z obecnym sposobem (odtłuszczone) mleko jest zakwaszane według sposobu znanego w dziedzinie dla selektywnego wytrącania frakcji kazeiny. Wytrącona frakcja zawiera wszystkie kazeiny, tzn. alfa, beta, kappa (włącznie z częścią GMP) i gamma-kazeiny. Ten tworzący się twaróg kazeiny jest oddzielany od frakcji ?słodkiej serwatki? i płukany dla usunięcia pozostałych składników serwatki i jonów wytwarzanych w sposobie zakwaszania. Po odwodnieniu twaróg kazeiny jest ponownie rozpuszczany przez neutralizację, na przykład za pomocą KOH, dla uzyskania odpowiedniego ?kazeinatu?. [0126] 10% (wagowo) roztwór kazeinatu potasu (około pH 6,4) był inkubowany w 31 stopniach C przez 1 godzinę z chymozyną (podpuszczką) cielęcą dla uwolnienia części GMP z kappa kazeiny. W tym przypadku na gram kazeinatu zastosowano 2.2 IMCU Maxiren (DSM Food Specialities, Delft, Holandia). Powstały roztwór był poddawany jednemu lub wielu etapom filtracji dla oddzielenia rozpuszczonej części GMP o niskim ciężarze cząsteczkowym od frakcji o dużym ciężarze cząsteczkowym, zawierającej zarówno kazeiny, -30- jak i chymozynę. Przesącz zawierający GMP został zakwaszony do pH 4,5 i dodano endoproteazę specyficzną dla proliny pochodzącą z A. niger o stężeniu 4 jednostek na gram obecnego białka. Temperatura została podwyższona do 55 stopni C dla zmaksymalizowania działalności enzymu i inkubacja była prowadzona przez 3 godziny. Powstały roztwór został następnie zagęszczony przez odparowanie i ogrzewany przez 5 minut do 95 stopni C dla unieczynnienia endoproteazy specyficznej dla proliny. Ostatecznie ogrzewany koncentrat był ultrafiltrowany dla możliwie największego usunięcia wytrąconych białek i suszony rozpyłowo. Zgodnie z analizą LC/MS/MS rozpyłowo suszonego materiału, stężenie IPP zostało ocenione ilościowo jako 0,6 miligramów IPP na gram materiału startowego kazeinatu. Przykład 7 Uwalnianie IPP z GMP w pojedynczym etapie inkubacji [0127] Przeprowadzono szereg inkubacji dla zademonstrowania, że endoproteaza specyficzna dla proliny pochodząca z A. niger i Sumizyme FP nadaje się do uwalniania obniżającego ciśnienie krwi trójpeptydu IPP z GMP. W tym doświadczeniu został zastosowany dostępny w handlu preparat GMP (Lacprodan CGMP-10, lot # P340205 z Arla, Dania). Zgodnie z jego specyfikacją, uzyskany proszek zawiera około 85% białka o zawartości GMP około 80% (obecnego białka), tzn. 1 gram proszku Lacprodan CGMP-10 zawiera około 0,85x 0,8= 0,7 gramów czystego GMP. [0128] GMP został rozpuszczony w wodzie demineralizowanej (50 gramów GMP w 450 ml). Wartość pH tego roztworu wynosi 6,7. 135 ml tego roztworu doprowadzono do pH 4 za pomocą 4N HCl i dodano dodatkową wodę do uzyskania objętości 150 ml i stężenia GMP 10% substancji stałej. Z roztworu o pH 6,7, 45 ml doprowadzono do pH 6 za pomocą 4 N HCl i 90 ml do pH 8 za pomocą 4N KOH. Do obu roztworów dodano dodatkową wodę do uzyskania również stężenia 10% GMP masy stałej. Wybrana została wartość pH 4,0 inkubacji z endoproteazą specyficzną dla proliny, ponieważ pH 4 przedstawia optimum dla tego enzymu. Ponieważ Sumizyme FP składa się z mieszaniny różnych endoproteaz, aminopeptydaz i karboksypeptydaz, wszystkie z ich własnymi optymalnymi pH, ta inkubacja była przeprowadzana w różnych warunkach pH. [0129] W tych trzech roztworach wyregulowanych do różnych wartości pH, były przeprowadzane inkubacje z różnymi enzymami, jak pokazano w Tabeli. Endoproteaza specyficzna dla proliny została użyta w stężeniu 0,4 U/ml (? 4,2 U/gram białka), a Sumizyme FP w stężeniu końcowym 1 mg/ml (?10,4 mg/gram białka). Wszystkie inkubacje były wykonywane w 50 ml stożkowych rurach Greinera w kąpieli wodnej nastawionej na 40°C przez 6 godzin przy łagodnym wstrząsaniu. Po inkubacjach próbki były utrzymywane zamrożone w -20°C aż do analizy LC/MS/MS. Dane uzyskane w tej ostatniej analizie są pokazane w Tabeli i były mierzone za pomocą roztworów referencyjnych IPP, VPP i LPP. -31- Tabela 2 Schemat inkubacji roztworów GMP z MaxiPro i Sumizyme FP Nr inkubacji ml 10% ml roztworu 10 roztworu GMP jednostek/ml enzymu spec. dla proliny ml roztworu 25 mg/ml Sumizyme FP pH mieszaniny inkubacji 1 48 - 6,7 2 48 2 4 3 48 - 2 4 4 48 - 2 6 5 48 - 2 8 Tabela 3 Wydajność peptydów po inkubacji enzymatycznej różnych roztworów GMP Nr inkubacji IPP VPP LPP mikrogr/ml mikrogr/gr mikrogr/ml mikrogr/gr 1 nd nd nd 2 1657 2367 nd 3 41 59 3 4 6 4 389 556 36 51 nd 5 570 814 44 63 nd nd mikrogr/ml mikrogr/gr nd nd nd 9 Mikrogr/ml= mikrogram odpowiedniego trójpeptydu na ml roztworu 10% GMP Mikrogr/gr= mikrogram odpowiedniego trójpeptydu na gram białka GMP nd = niewykrywalne [0130] Z uzyskanych wyników jest jasne, że inkubacja z czystą endoproteazą specyficzną dla proliny daje produkt zawierający IPP, produkt pozbawiony peptydów VPP i LPP. Ilość IPP uwalnianego w tej niezoptymalizowanej inkubacji stanowi około 50% ilości IPP obecnej w GMP. [0131] Co najważniejsze, inkubacje ze złożonym enzymem Sumizyme FP również prowadzą do wytwarzania IPP z GMP. Zgodnie z naszymi danymi, najwydajniej w warunkach pH 8. Fakt, że z Sumizyme FP wydajności IPP są niższe, niż w inkubacji z endoproteazą specyficzną dla proliny, odzwierciedla głównie sytuację zbyt małego dozowania enzymu Sumizyme FP w tym doświadczeniu. Dość niespodziewanie Sumizyme FP nie tylko wytwarzał IPP, ale również VPP i LPP z materiału Lacprodan. Ponieważ trójpeptydy VPP i LPP występują tylko w sekwencji aminokwasów beta-kazeiny, ich obecność wyraźnie ilustruje fakt, że uzyskany materiał GMP jest skażony beta-kazeiną. Przykład 8 -32- [0132] Dla zademonstrowania korzyści organoleptycznych hydrolizatu zawierającego IPP uzyskanego z GMP, został przeprowadzony eksperyment głosowania. W tym eksperymencie trzy różne podłoża, tzn. GMP, kazeinian potasowy i mleko odtłuszczone były inkubowane z endoproteazą specyficzną dla proliny pochodzącą z A. niger. Przy użyciu tego czystego enzymu może być wycinane tylko IPP obecne w molekule kappa kazeiny (WO 2006/005757). Wszystkie trzy inkubacje zawierały to samo stężenie białka 3,5% (wagowo) i zawierały taką samą ilość enzymu, tzn. 4 jednostki/ gram białka. Dla uniknięcia wytrącania kazeiny, pH roztworów zostało wyregulowane do 6,2. Umożliwiono inkubację przez 3 godziny i następnie zakończono ją krótką obróbką cieplną. [0133] We wszystkich trzech hydrolizatach obecny był znaczny osad. Po odwirowaniu dla usunięcia osadów, czyste (zawierające IPP) odcieki były smakowane przez przeszkolony panel składający się z 5 osób. Członkowie panelu zostali przeszkoleni z roztworami siarczanu chininy o następujących stężeniach:15 mg/L siarczanu chininy > Intensywność goryczy = 1, 20 mg/L siarczanu chininy > Intensywność goryczy = 2,30 mg/L siarczanu chininy > Intensywność goryczy = 3 i 50 mg/L siarczanu chininy > Intensywność goryczy = 4. Panel oceniał gorycz każdego hydrolizatu w skali od 0 (nie gorzkie) do 4 (bardzo gorzkie). Próbka referencyjna 15 mg/L siarczanu chininy została podana członkom panelu przed sesją smakową i przydzielono jej wartość intensywności goryczy 1. Hydrolizat kazeiny został oceniony jako bardzo gorzki tzn. 4 przez wszystkich członków panelu testującego. Hydrolizat mleka odtłuszczonego uzyskał również wynik goryczy 3 od wszystkich członków panelu. Po smakowaniu hydrolizatu GMP, panel jednogłośnie przyznał wynik 1. Uwzględniając, że hydrolizat GMP również może uzyskać najwyższe stężenie IPP, wyraźnie zademonstrowano nieoczekiwane korzyści sposobu zgodnego z wynalazkiem. Przykład 9 Uwalnianie IPP z GMP przez fermentację [0134] Zły smak produktów z fermentowanego mleka i wiele trudności natrafianych w przetwarzaniu podczas odtwarzania peptydów hamujących ACE z fermentowanych pożywek opisano w US 6,428,812. W tym Przykładzie wykazujemy, że molekuła GMP jest również odpowiednim podłożem do wytwarzania IPP przez fermentację. [0135] W tym badaniu zastosowano dwa szczepy Lactobacillus, Lactobacillus acidophilus LAFTI? L10 i Lactobacillus casei LAFTI? L26 (DSM Food Specialties, Australia). Oba szczepy były hodowane w beztlenowych słojach w atmosferze CO2 + N2 (AnaeroGen?, Oxoid) w 37°C w pożywce MRS (Oxoid) przez 24 godziny. Powstałe hodowle wstępne zostały następnie zaszczepione pożywką fermentacyjną ?a? lub pożywką fermentacyjną ?ay?. Pożywka fermentacyjna ?a? zawierała: Tween 80 (1 ml/l), K2HPO4 (2 g/l), NaAc (3 g/l), cytrynian (NH4)3 (2 g/l), MgSO4.7 H2O (0.2 g/l), MnSO4.4 H2O (0.05 g/l), glukozę (20 g/l), GMP (Lacprodan, Arla; 22 g/l). Pożywka fermentacyjna ?ay? również zawierała wyciąg z drożdży (4.0 g/l). Nowo zaszczepione pożywki fermentacyjne ?a? i ?ay? były inkubowane przez następne 24 godziny w warunkach określonych wyżej. Następnie, te pożywki fermentacyjne były odwirowywane i odcieki były analizowane przez LC/MS na obecność trójpeptydów IPP, LPP i VPP. Jak zilustrowano w Tabeli 4, tylko w inkubacjach ze szczepem -33- L10 mogła być wykrywana obecność IPP na poziomie 0,3 mg/l. LPP i VPP nie występowały. Smak próbek 1 i 5 nie wykazywał znaczących posmaków. Tabela 4: Uwalnianie IPP z GMP przez fermentację Rura Pożywka fermentacyjna Szczep Wytwarzanie IPP 1 a L10 Tak 2 ay L10 Tak 3 a L26 Niewykrywane 4 ay L26 Niewykrywane 5 a Bez szczepienia dla kontroli Niewykrywane -34- Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania IPP (Ile-Pro-Pro) z GMP (glikomakropeptydu z kappa kazeiny) obejmujący najpierw inkubowanie GMP z aminopeptydazą a następnie inkubowanie z proteazą specyficzną dla proliny. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, przy czym proteazą specyficzną dla proliny jest endoproteaza specyficzna dla proliny. 3. Sposób według zastrzeżenia 1 albo 2, przy czym aminopeptydaza nie jest aktywna, gdy dodawana jest proteaza specyficzna dla proliny. 4. Sposób według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, przy czym rozpuszczalne peptydy, zawierające IPP, które są tworzone podczas hydrolizowania źródła białka, są oddzielane i opcjonalnie suszone. 5. Sposób sporządzania produktu żywnościowego, napoju lub suplementu diety obejmujący (a) wytwarzanie kompozycji, która zawiera IPP, sposobem według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 4, oraz (b) wprowadzanie kompozycji zawierającej IPP do produktu żywnościowego, napoju lub suplementu diety. 6. Sposób według zastrzeżenia 5, również obejmujący etap (c) oddzielania rozpuszczalnych peptydów od hydrolizowanego białka. 7. Sposób według zastrzeżenia 6, przy czym etap (c) występuje po etapie (a) a przed etapem (b). 8. Sposób według zastrzeżenia 5, przy czym produkt żywnościowy, napój lub suplement diety jest wybierany z grupy margaryn, smarowideł, masła, produktów mlecznych lub napojów zawierających serwatkę, jogurtu lub mleka. -35- -36- -37-





































Grupy dyskusyjne