Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 2163162 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 2163162 T3


EP 2163162 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 02.04.2004 09176668.3 (19) PL (11) PL/EP (13) (51) 2163162 T3 Int.Cl. A61K 31/35 (2006.01) A61K 31/7032 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 07.08.2019 Europejski Biuletyn Patentowy 2019/32 EP 2163162 B1 A61K 35/74 (2015.01) A23L 2/52 (2006.01) Tytuł wynalazku: Kompozycje zawierające szczepy Lactobacillus plantarum w połączeniu z taniną i nowe szczepy Lactobacillus plantarum (30) Pierwszeństwo: 16.04.2003 US 463058 P 04.04.2003 SE 0300994 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.03.2010 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/11 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 28.02.2020 Wiadomości Urzędu Patentowego 2020/02 (73) Uprawniony z patentu: PROBI AB, Lund, SE PL/EP 2163162 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: GÖRAN MOLIN, Lund, SE SIV AHRNÉ, Lund, SE BENGT JEPPSSON, Lund, SE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Naperty SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.K. skr. poczt. 6 00-956 Warszawa 10 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). SGS-18010/VAL EP 2 163 162 B1 Opis 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji o właściwościach przeciwzapalnych i regulującym wpływie na mikroflorę jelitową in vivo oraz o właściwościach konserwujących in vitro, która to kompozycja zawiera dowolny nowy, wytwarzający tanazę szczep Lactobacillus plantarum o wyraźnej zdolności do przylegania do błony śluzowej ludzkich jelit. Tło [0002] Taniny, określane jako rozpuszczalne w wodzie produkty fenolowe, które mogą wytrącać białka z roztworu wodnego, są naturalnie występującymi związkami. Istnieją dwie klasy tanin, taniny ulegające hydrolizie, pochodzące od kwasu galusowego i kwasu elagowego, oraz skondensowane taniny, czyli proantocyjanidyny, które są oligomerami i polimerami flawanoli. Taniny hamują wzrost wielu drobnoustrojów i są odporne na ataki mikrobiologiczne - (Chung, K.T., i in. (1998), Tannins and human health: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 38:421-464. Do degradacji tanin zazwyczaj najlepiej dostosowane są pleśnie i drożdże oraz niektóre bakterie tlenowe, ale zachodzi także degradacja beztlenowa, np. w przewodzie jelitowym (Bhat, T.K., i in. (1998), Microbial degradation of tannins - A current perspective. Biodegradation 9:343-357). [0003] Taniny są znane jako substancje przeciwodżywcze, tzn. zmniejszają skuteczność organizmu w przekształcaniu strawionych składników odżywczych na nowe substancje organizmu. Jednakże doniesiono również o korzystnych dla zdrowia działaniach tanin, np. działaniach przeciwnowotworowych, zdolności do obniżania ciśnienia krwi i do modulowania odpowiedzi immunologicznych. Te działania mogą być spowodowane przeciwutleniającymi właściwościami tanin (Chung i in. 1998). Skuteczną przeciwutleniającą taniną, o której właściwościach przeciwnowotworowych doniesiono, jest kwas elagowy. Innym typem taniny o wyjątkowo wysokiej zdolności przeciwutleniającej są proantocyjanidyny, występujące przykładowo w winogronach i oliwkach. Zatem taniny występujące w różnych stężeniach w żywności pochodzenia roślinnego mają głęboki wpływ na zdrowie człowieka. Nie zaleca się spożywania dużych ilości tanin, ponieważ mogą być one zaangażowane w wykształcanie nowotworu i działanie przeciwodżywcze, ale przyjmowanie małej ilości tanin właściwego typu może być korzystne dla zdrowia człowieka przez wpływ na enzymy metaboliczne, immunomodulację lub inne funkcje (Chung i in. 1998). [0004] Jednakże również produkty beztlenowego rozkładu wielu tanin, wytwarzane w przewodzie jelitowym, mogą wytwarzać związki o działaniach korzystnych dla zdrowia (Bhat i in. 1998). Takie związki powstałe w wyniku rozkładu stanowią przykładowo pochodne kwasu fenylopropionowego lub fenylooctowego (Bhat i in. 1998). Gdy są wchłaniane w przewodzie GI, związki te mają działanie przeciwzapalne. Związki te wraz z innymi produktami rozkładu tanin mają także szeroki zakres działania przeciwdrobnoustrojowego w przewodzie GI, hamującego niepożądane bakterie. Stan techniki [0005] Większość gatunków Lactobacillus jest niezdolnych do degradacji tanin, ale szczepy blisko spokrewnionych gatunków L. plantarum, L. pentosus i L. paraplantarum mogą wykazywać aktywność tanazy, Osawa, R., i in. (2000), Isolation of tannin-degrading lactobacilli from humans and fermented foods, Applied and Environmental Microbiology 66:3093-3097. [0006] Niektóre szczepy Lactobacillus plantarum wykazują specyficzną zdolność do przylegania do ludzkich komórek nabłonkowych w mechanizmie blokowanym przez obecność mannozy, Adlerberth, I., i in., (1996), A mannose-specific adherence mechanism in Lactobacillus plantarum conferring binding to the human colonic cell line HT-29. Applied and 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Environmental Microbiology 62:2244-2251. [0007] Nobaek S i in., International dairy journal, Elsevier applied Science, barking, GB, tom 8, 01.05.1998, strona 591, informuje, że lactobacillus plantarum 299v w połączeniu z owocami dzikiej róży może powodować zmniejszenie objawów zespołu nadwrażliwości jelita grubego (IBS). [0008] W W096/29083 poinformowano, że pro-viva (zupa z owoców dzikiej róży na bazie fermentowanego owsa z Lactobacillus plantarum 299v) można podawać dzieciom cierpiącym z powodu ostrego zapalenia żołądka i jelit [0009] Ostatecznie, Molin i in., The American Journal of clinical nutrition, tom 73, strony 380S-385S informuje, że kompozycja zawierająca Lactobacillus plantarum 299v i owoce dzikiej róży może obniżać poziom fibrynogenu w surowicy (fibrynogen jest białkiem ostrej fazy wytwarzanym w wątrobie podczas zapalenia). 35 Streszczenie wynalazku [0010] Obecnie stwierdzono, że szczepy Lactobacillus plantarum o zdolności do przylegania do błony śluzowej ludzkich jelit i o zdolności do wytwarzania tanazy, podczas rozkładu tanin wytwarzają związki, które przeciwdziałają szkodliwym bakteriom w przewodzie żołądkowo-jelitowym (GI) i mają działanie przeciwzapalne gdy są wchłaniane w przewodzie GI. Krótki opis rysunków [0011] Figura przedstawia rozdzielone fragmenty DNA uzyskane przez rozszczepienie chromosomalnego DNA szczepów Lactobacillus plantarum HEAL 9 (ścieżka 2), HEAL 19 (ścieżka 3), 299v (ścieżka 4) i HEAL 99 (ścieżka 5) z użyciem enzymu restrykcyjnego EcoRI. Marker wysokiej masy cząsteczkowej DNA (BRL) i marker masy cząsteczkowej DNA VI (Roche) zastosowano jako wzorzec (ścieżka 1). Opis wynalazku [0012] Niniejsze ujawnienie dotyczy kompozycji zawierającej jeden lub większą liczbę wytwarzających tanazę szczepów Lactobacillus plantarum lub blisko spokrewnionych z gatunkiem Lactobacillus o zdolności do przylegania do błony śluzowej ludzkich jelit w połączeniu z taniną. Kompozycja ta będzie wytwarzała in vivo związki o działaniu przeciwdrobnoustrojowym i przeciwzapalnym oraz będzie wytwarzała in vitro związki o działaniu konserwującym. [0013] Ujawnienie dotyczy również kompozycji zawierającej jeden lub większą liczbę wytwarzających tanazę szczepów Lactobacillus w połączeniu z taniną i nośnikiem. [0014] Przykłady nośników stanowią kleik z mąki owsianej, artykuły spożywcze otrzymane przez fermentację kwasu mlekowego i skrobia oporna. W celu poprawy proliferacji bakterii i zwiększenia wytwarzania przeciwzapalnych lub konserwujących pochodnych, do kompozycji można dodać włókna pokarmowe. Włókna pokarmowe, takie jak fruktooligosacharydy, galakto-oligosacharydy, laktuloza, maltodekstryny, ?-glukany i guma guar, można również stosować jako nośnik. [0015] Ujawnienie dotyczy zwłaszcza kompozycji spożywczej zawierającej wytwarzający tanazę szczep Lactobacillus wraz z bardziej lub mniej czystymi frakcjami tanin, przykładowo kwasu elagowego, flawonoidów, takich jak proantocyjanidyny i antocyjanidyny, lub lignanów, lub ze składnikami spożywczymi bogatymi w taniny, tak jak przykładowo owies, jęczmień, czerwone sorgo, mączka wytworzona z wewnętrznej części kory drzewa sosnowego i sok lub ekstrakty z winogron, cytrusów, borówki brusznicy, borówki amerykańskiej, czarnej porzeczki, żurawiny, truskawek, malin i owoców dzikiej róży. [0016] Ujawnienie dotyczy także kompozycji farmaceutycznej zawierającej wytwarzający tanazę szczep Lactobacillus wraz z bardziej lub mniej czystymi frakcjami przykładowo kwasu elagowego, flawonoidów, takich jak proantocyjanidyny i antocyjanidyny, lub lignanów, albo dowolnymi innymi dopuszczalnymi farmaceutycznie źródłami tanin. [0017] W celu uzyskania efektu profilaktycznego lub terapeutycznego kompozycji według 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 wynalazku, zawartość tanin powinna korzystnie wynosić około 500-1000 mg na dzień. Przykładowo w przypadku proszku z owoców dzikiej róży będzie to w przybliżeniu odpowiadać 100 g lub w postaci zupy z owoców dzikiej róży - 4 litrom. [0018] Taniny są rozpuszczalnymi w wodzie produktami fenolowymi o różnych masach cząsteczkowych, które mogą wytrącać białka z roztworu wodnego. Istnieją dwie klasy tanin, taniny ulegające hydrolizie, pochodzące od kwasu galusowego i kwasu elagowego, i skondensowane taniny, czyli proantocyjanidyny, które są oligomerami i polimerami flawanoli. [0019] Tak zwane skondensowane lub nieulegające hydrolizie taniny są bardziej odporne na degradację mikrobiologiczną niż taniny ulegające hydrolizie. Taniny występują powszechnie w owocach i nasionach, takich jak winogrona, jabłka, banany, jeżyny, żurawiny, maliny, truskawki, oliwki, fasole, ziarna sorgo, jęczmień i manneczka łękowata, krzew kokainowy, herbata i kawa. [0020] Kompozycja według wynalazku może stanowić kompozycję spożywczą, w której nośnik stanowi produkt spożywczy. W kompozycji farmaceutycznej, nośnik powinien stanowić terapeutycznie dopuszczalny nośnik. Kompozycja może być podawana przeciętnemu konsumentowi do poprawy parametrów sprawności fizycznej w celu zapobiegania przyszłym chorobom, takim jak zakażenia pochodzące z przewodu GI, cukrzyca, choroby zapalne jelit (IBD), zespół nadwrażliwości jelita grubego (IBS), nowotwór lub choroby układu sercowo-naczyniowego, lub w celu złagodzenia wymienionych chorób. [0021] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może być sformułowana przykładowo w zawiesiny, tabletki, kapsułki i proszki, które można podawać doustnie. Preparaty te można podawać również w postaci enemy. [0022] Niniejsze ujawnienie dotyczy zwłaszcza wytwarzającego tanazę szczepu Lactobacillus plantarum lub blisko spokrewnionego z gatunkiem Lactobacillus, o zdolności do przylegania do błony śluzowej ludzkich jelit, charakteryzującego się aktywnością tanazy, określoną sposobem opisanym przez Osawa i Walsh, w Applied and Environmental Microbiology, tom 59, nr 4, kwiecień 1993, str. 1251-1252, ze zrzeczeniem się szczepów Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595 i Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843. [0023] Korzystne wytwarzające tanazę szczepy należą do gatunku Lactobacillus plantarum i mają zdolność do przeżycia w przewodzie żołądkowo-jelitowym (GI). Przeżycie w tym kontekście oznacza, że szczepy będą miały zdolność do metabolizowania i namnażania się (życia) w przewodzie GI przez pewien czas. [0024] Zgodnie z korzystnym aspektem ujawnienie dotyczy następujących nowych szczepów, które zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 28 listopada 2002 r. i otrzymały numer depozytu, a mianowicie Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313 i Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, jak również ich wariantów o zasadniczo takim samym wzorcu REA. [0025] Nowe szczepy wyizolowano z błony śluzowej okrężnicy zdrowych dorosłych osób i poddano selekcji przez hodowanie na agarze Rogosa. Szczepy następnie scharakteryzowano metodą REA. [0026] Zgodnie z innym aspektem ujawnienie dotyczy również zastosowania wytwarzającego tanazę szczepu Lactobacillus plantarum, w połączeniu z taniną do wytwarzania leku do leczenia profilaktycznego lub terapeutycznego chorób układu sercowo-naczyniowego, chorób zapalnych jelit (IBD), zespołu nadwrażliwości jelita grubego (IBS), zakażeń żołądkowo-jelitowych, cukrzycy, nowotworu, choroby Alzheimera lub chorób o pochodzeniu autoimmunizacyjnym. Przykładami wytwarzających tanazę szczepów są nowe szczepy HEAL 9, HEAL 19 i HEAL 99, ale również znane wcześniej szczepy Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595 i Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843. [0027] Ilość wytwarzających tanazę bakterii do stosowania w kompozycjach według wynalazku powinna korzystnie wynosić nie mniej niż 109 jednostek tworzących kolonie 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 (cfu)/dawkę i dzień. [0028] Zgodnie z innym aspektem ujawnienie dotyczy zastosowania wytwarzającego tanazę szczepu Lactobacillus wraz z taninami do konserwacji żywności. Przykładami wytwarzających tanazę szczepów są nowe szczepy HEAL 9, HEAL 19 i HEAL 99, ale również znane wcześniej szczepy Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595 i Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843. Szczepy te będą następnie wytwarzały środki konserwujące bezpośrednio w produkcie spożywczym w wyniku degradacji tanin. Taniny można dostarczyć przez dodanie do produktu czystych frakcji tanin albo przez dodanie do produktu naturalnych, słabiej określonych dodatków bogatych w taniny, takich jak przykładowo owoce dzikiej róży, czerwone sorgo lub mączka wytworzona z wewnętrznej części kory sosny. [0029] Mieszaniny tanin, w których stosuje się szczepy Lactobacillus i taniny, można podawać w celach terapeutycznych lub jako działanie dla podtrzymania sprawności fizycznej w celu zmniejszenia czynników ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego, zespołu metabolicznego, cukrzycy, chorób zapalnych jelit (IBD), zespołu nadwrażliwości jelita grubego (IBS), zakażeń żołądkowo-jelitowych lub chorób o pochodzeniu autoimmunizacyjnym. [0030] Szczepy L. plantarum HEAL 9, HEAL 19 i HEAL 99 mają wyższą zdolność do przylegania do komórek błony śluzowej ludzkiej okrężnicy niż szczep Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843. Część doświadczalna Izolacja szczepów [0031] 42 różnych, nowo wyizolowanych szczepów Lactobacillus zbadano i porównano z dobrze znanym probiotycznym szczepem odniesienia Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, pod względem ich zdolności do wytwarzania tanazy, tzn. rozkładu tanin. Szczepy wymieniono w poniższej Tabeli 1. Metody przeszukiwania [0032] Zastosowaną metodę wykrywania aktywności tanazy opisali wcześniej Osawa i Walsh (1993). Zasada wykrywania polega na pomiarze produktu rozpadu taniny, galusanu metylu, zgodnie z następującą procedurą: Badaną bakterię hoduje się w warunkach beztlenowych na agarze MRS (Merck, Darmstadt, Niemcy) przez 2 dni w 37°C, a następnie komórki zbiera się i przeprowadza w zawiesinę w 5 ml 0,9% (wag./obj.) NaCl. Zawiesinę komórek odwirowuje się, a komórki ponownie przeprowadza się w zawiesinę w 10 ml 0,9% NaCl i mierzy się absorbancję przy 620 nm (0,9% roztwór NaCl jako wzorzec). Zawiesinę komórek rozcieńcza się do uzyskania absorbancji między 0,1 i 0,6 (spektrofotometr, Pharmacia LKB, Novaspec II). Po odwirowaniu, komórki ponownie przeprowadza się w zawiesinę w 1 ml buforu na bazie galusanu metylu (3,7 g/l galusanu metylu [Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI, USA], 4,5 g/l NaH2PO4, pH = 5,0 [po jałowej filtracji]) i probówkę inkubuje się w 37°C przez 24 h. Dodaje się jeden ml buforu na bazie NaHCO3 (42 g NaHCO3 na litr, pH = 8,6) i roztwór inkubuje się przez 1 h w temperaturze pokojowej, przed pomiarem absorbancji przy 440 nm (bufor na bazie NaHCO3 jako wzorzec). Barwę zawiesiny mierzy się przez ocenę wizualną. [0033] Dla przyjęcia pozytywnego wyniku dla aktywności tanazy barwa powinna być brązowa lub zielona. Ilościową wartość aktywności tanazy otrzymano jako stosunek między absorbancją zawiesiny komórek (A620; ilość komórek) na początku inkubacji z galusanem metylu do absorbancji po 24 h inkubacji z galusanem metylu (A440; zabarwienie wolnego kwasu galusowego po ekspozycji na tlen w warunkach zasadowych). Wyniki [0034] Wynik przeszukiwania szczepów Lactobacillus mających aktywność tanazy przedstawiono w Tabeli 1. Większość badanych szczepów nie miała żadnej aktywności tanazy. Jednak 11 szczepów dało wynik pozytywny i przedstawiono je w Tabeli 1. 5 Organizm Tabela 1. Aktywność tanazy u różnych szczepów Lactobacillus. Aktywność tanazy* (wynik Ilościowa aktywność Szczep pozytywny lub negatywny) tanazy** (A440/A620) Lactobacillus Plantarum 299v + 6,2 DSM 9843 Lactobacillus plantarum LP2 + 4,9 Lactobacillus plantarum LP5 + 3,3 Lactobacillus plantarum 4LF:1 + 6,1 Lactobacillus plantarum 17LF:1 + 5,4 Lactobacillus HEAL 9 + 6,4 + 7,4 + 6,8 Plantarum Lactobacillus Plantarum Lactobacillus Plantarum DSM 15312 HEAL 19 DSM 15313 HEAL 99 DSM 15316 * Wynik pozytywny dla aktywności tanazy jest widoczny jako zielone do brązowego zabarwienie wolnego kwasu galusowego w zawiesinie komórek po wydłużonej ekspozycji na tlen w warunkach zasadowych. ** Aktywność tanazy wyrażona jako stosunek między absorbancją zawiesiny komórek przy 620 nm (A620) na początku 24 h inkubacji z galusanem metylu do absorbancji przy 440 nm (A440) po inkubacji z galusanem metylu (A440). 5 10 15 20 [0035] Trzy spośród szczepów L. plantarum z wynikiem pozytywnym dla tanazy miały wyższą aktywność tanazy niż dobrze znany probiotyczny szczep Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, a mianowicie L. plantarum HEAL 9, L. plantarum HEAl 19 i L. plantarum HEAL 99. Wyizolowano je z błony śluzowej jelit zdrowego człowieka. Identyfikacja genotypowa metodą REA [0036] Szczepy zbadano pod względem wzorca rozszczepiania chromosomalnego DNA w analizie z użyciem restrykcyjnej endonukleazy - REA - metodą zgodnie z St?hl M, Molin G, Persson A, Ahrné S i St?hl S, International Journal of Systematic Bacteriology, 40:189193, 1990, i dalej opracowaną przez Johansson, M-L, i in., International Journal of Systematic Bacteriology 45:670-675, 1995. Schematycznie REA można opisać następująco: Chromosomalny DNA wypreparowano ze szczepów wprowadzonych do badania i rozszczepiono z użyciem restrykcyjnych endonukleaz. 0,75 ?g każdego DNA trawiono oddzielnie w 37°C przez 4 h z użyciem 10 jednostek EcoRI i Hind III; przy czym każdą endonukleazę stosowano oddzielnie. Rozszczepione fragmenty DNA rozdziela się ze względu na wielkość metodą elektroforezy żelowej przy użyciu zanurzonych płyt żelu agarozowego w pozycji poziomej. Żele składały się z 150 ml 0,9 % agarozy (klasa ultraczysta do DNA; niska elektroendoosmoza; BioRad Laboratories, Richmond, USA) i odlano je w postaci płyt żelu (150 na 235 mm). 0,2 ?g markera dużej masy cząsteczkowej DNA (Bethesda Research Laboratories, MD, USA) wraz z 0,5 ?g markera masy cząsteczkowej DNA VI 6 5 10 15 20 25 30 (Roche, Niemcy) stosowano jako wzorce. Minimalne zniekształcenie prążków i maksymalną ostrość uzyskano przez nanoszenie próbki DNA w buforze do nanoszenia Ficoll (2 g Ficoll, 8 ml wody, 0,25% bromofenol). [0037] Analizę żelową prowadzono przy stałym napięciu 40 V przez 18 h w około 6-8°C. Bufor (89 mM Tris, 23 mM H3PO4, 2 mM sól sodowa EDTA, pH 8,3) zawracano podczas okresu analizy. Następnie żele barwiono przez 20 minut bromkiem etydyny (2 ?g/ml) i odbarwiano w wodzie destylowanej, uwidoczniono przy 302 nm z użyciem transiluminatora UV (UVP Inc., San Gabriel, USA) i sfotografowano. Tym sposobem przeprowadzania elektroforezy żelowej uzyskiwano dobry rozkład i względnie dobre rozdzielenie prążków o masie cząsteczkowej poniżej 1,2 x 106. [0038] Wyniki analizy przedstawiono na Figurze. Przyleganie do komórek HT-29 [0039] Wszystkie 32 szczepy L. plantarum wyizolowane z ludzkiej błony śluzowej badano pod względem przylegania do komórek nabłonka jelitowego z ludzkiej linii komórkowej raka okrężnicy HT-29 o wiązaniu specyficznym względem mannozy (metoda opisana przez Wold, A, i in., Infection and Immunity, październik 1988, str. 2531-2537). Komórki z ludzkiej linii komórkowej gruczolakoraka HT-29 hodowano w pożywce Eagle?a uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM L-glutaminą i 50 ig/ml gentamycyny (Sigma Chemical Co., Saint Louis, Mo, USA). Kilka dni po osiągnięciu przez komórki stanu konfluencji odczepiono je z użyciem buforu zawierającego EDTA (0,54 mM), przemyto i przeprowadzono w zawiesinę w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) w ilości 5 x 106/ml. Bakterie zebrano, przemyto i przeprowadzono w zawiesinę w HBSS w ilości 5 x 109/ml (2 x gęstość optyczna 1,5 przy 597 nm). Komórki, bakterie i HBSS zmieszano w stosunku 1:1:3 i inkubowano w trakcie obracania przy ruchu pionowym przez 30 minut w 4?C. Komórki przemyto jednokrotnie lodowatym PBS i utrwalono obojętną buforowaną formaliną (Histofix, Histolab, Götebrog, Szwecja). Liczbę bakterii przyczepionych do każdej z co najmniej 40 komórek określono z zastosowaniem interferencyjnej mikroskopii kontrastowej (500 x powiększenie, Nicon Optophot, z urządzeniem do kontrastowania interferencyjnego, Bergström Instruments, Göteborg, Szwecja) i obliczono średnią liczbę bakterii na komórkę. [0040] Dla wszystkich szczepów z wyjątkiem trzech szczepów HEAL uzyskano wartości między 0,3-14 (przyleganie w roztworze soli; odpowiadające im wartości w obecności metylomannozydu wynosiły odpowiednio 0,5 i 2,4). Dla większości szczepów uzyskano wartość poniżej 10. Wyniki podano w Tabeli 2 poniżej. Organizm Szczep Tabela 2 Przyleganie do komórek HT-29 (liczba bakterii na komórkę) W roztworze soli W obecności metylomannozydu 35 Lactobacillus 299v 11,7 3,4 plantarum DSM 9843 Lactobacillus plantarum HEAL 9 20 2,1 Lactobacillus plantarum HEAL 99 20 2,0 Lactobacillus plantarum HEAL 19 23 5,0 Lactobacillus plantarum ATCC 14917T 5,2 2,2 Lactobacillus plantarum 78B 0,5 0,3 Badanie na mysim modelu doświadczalnym Metoda 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [0041] Piętnaście myszy Balb/C podzielono na pięć grup (3 myszy na grupę) i karmiono różnymi połączeniami normalnego pożywienia, proszku z owoców dzikiej róży (bogatego w taniny) i pozytywnego względem tanazy szczepu Lactobacillus plantarum 299v. Składniki zmieszano z pewną ilością wody z uzyskaniem papkowatej konsystencji. W Grupach 1 i 2 podawano normalne mysie pożywienie, w Grupie 3 podawano normalne pożywienie uzupełnione proszkiem z owoców dzikiej róży (1,6 g na dzień), w Grupie 4 podawano normalne pożywienie uzupełnione L. plantarum 299v (1010 bakterii na dawkę), a w Grupie 5 podawano normalne pożywienie uzupełnione zarówno proszkiem z owoców dzikiej róży, jak i L. plantarum 299v. Myszy karmiono raz dziennie przez 6-8 dni, po czym wywoływano uszkodzenie niedokrwienno/reperfuzyjne. Uszkodzenie wywoływano zgodnie z poniższym protokołem preparowania: Dla znieczulania myszom podano podskórnie 0,15 ml roztworu ketaminy/ksylazyny (odpowiednio 7,85 mg/ml i 2,57 mg/ml). Wykonano nacięcie na linii środkowej brzucha i zamknięto górną tętnicę krezkową przy użyciu atraumatycznej pętli naczyniowej i hemostatu. Do jamy otrzewnej wstrzyknięto 1,0 ml PBS do resuscytacji płynowej. Tętnicę zamknięto na 30 min, po czym usunięto pętlę naczyniową i hemostat, i obserwowano natychmiastową reperfuzję tkanki. Brzuch następnie zamknięto ciągłym szwem przy użyciu Vicryl 3-0. Zwierzęta pozostawiono do wybudzenia się ze znieczulenia i usunięto z podkładki grzejnej i z powrotem umieszczono w klatce. Po 4 h i 15 min, zwierzętom podano ponownie znieczulenie i pobrano próbki tkanki i stolca w następującej kolejności oraz umieszczono je we wstępnie zważonych probówkach: tkanka wątroby, tkanka krezki jelita krętego i stolec z kątnicy do pobrania próbek bakteriologicznych oraz tkanka kątnicy i jelita krętego do testów kolorymetrycznych pod względem peroksydacji lipidów, oraz tkanka kątnicy i jelita krętego do oceny histologicznej. Próbki do oceny bakteriologicznej zważono i umieszczono w ośrodku do zamrażania i niezwłocznie zamrożono w -70°C. Próbki do testów kolorymetrycznych (LPO586) przepłukano PBS, zważono, zhomogenizowano, podzielono na porcje, a następnie niezwłocznie zamrożono w -70°C. Metody analityczne [0042] Ocenę bakteriologiczną przeprowadzono przez zliczanie żywych komórek z zastosowaniem beztlenowej inkubacji (BBL Gas Pak Plus, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) na agarze Rogosa (Merck, Darmstadt, Niemcy) w 37°C przez 3 dni, na agarze VRBD (Merck, Darmstadt, Niemcy) w 37°C przez 24 h i na agarze z wywarem z mózgowia i serca (BHI; Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Anglia) w 37°C przez 3 dni. Zliczanie żywych komórek na BHI również wykonano w warunkach beztlenowych. [0043] Test kolorymetryczny pod względem peroksydacji lipidów wykonano za pomocą spektrofotometru i zestawu do analizy Bioxytech? LPO-586? (OxisResearch?, Oxis Health Products, Inc., Portland). Analizę przeprowadzono zgodnie z opisem producenta. [0044] Peroksydacja lipidów jest dobrze znanym mechanizmem uszkadzania komórek i jest stosowana jako wskaźnik stresu oksydacyjnego w komórkach i tkankach. Nadtlenki lipidów są nietrwałe i ulegają rozkładowi z wytworzeniem złożonego szeregu związków obejmujących reaktywne związki karbonylowe. Nadtlenki wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w wyniku rozkładu wytwarzają dialdehyd malonowy (MDA) i 4-hydroksyalkenale (HAE). Pomiar MDA można stosować jako wskaźnik peroksydacji lipidów. LPO586? jest testem kolorymetrycznym przeznaczonym do oznaczania ilościowego MDA i opiera się na reakcji reagenta chromogennego, N-metylo-2-fenyloindolu, z MDA w 45°C. Jedna cząsteczka MDA reaguje z dwiema cząsteczkami N-metylo-2-fenyloindolu z wytworzeniem trwałego chromoforu o maksimum absorbancji przy 586 nm. Wyniki [0045] Peroksydację lipidów, mierzoną jako ilość dialdehydu malonowego (MDA) na g tkanki okrężnicy, zmierzono u myszy traktowanych w różny sposób, a wyniki przedstawiono w Tabeli 3. Niedokrwienie/reperfuzja zwiększały ilość MDA. Wstępne podawanie 8 myszom proszku z owoców dzikiej róży (Grupa 3) lub L. plantarum 299v (Grupa 4) w pożywieniu zmniejszało ilość MDA w porównaniu z kontrolą pozytywną (Grupa 2). Jednak wpływ połączonego wstępnego podawania proszku z owoców dzikiej róży i L. plantarum 299v powodował znacznie wyraźniejsze zmniejszenie ilości MDA (Grupa 5). 5 10 15 Tabela 3. Peroksydacja lipidów po uszkodzeniu niedokrwienno/reperfuzyjnym u myszy. Grupa myszy Dialdehyd malonowy (MDA) na g tkanki okrężnicy [mediana] G1. Kontrola A; bez uszkodzenia (bez niedokrwienia/reperfuzji); normalne pożywienie 4,3 G2. Kontrola B; normalne pożywienie 6,3 G3. Normalne pożywienie + proszek z owoców dzikiej róży (RHP) 5,1 G4. Normalne pożywienie + L. plantarum 299v 5,8 G5. Normalne pożywienie + RHP + L. plantarum 299v 3,6 [0046] Wyniki zliczania żywych komórek przedstawiono w Tabeli 4. Uszkodzenie niedokrwienno/reperfuzyjne zwiększało liczbę żywych komórek na agarach BHI i Rogosa o współczynnik 10 (porównaj Grupa 1 i Grupa 2). Sam proszek z owoców dzikiej róży (Grupa 3) powodował niższą liczbę żywych komórek niż alternatywne sposoby żywienia. W grupie, w której podawano zarówno L. plantarum 299v, jak i proszek z owoców dzikiej róży (Grupa 5), uzyskano taką samą liczbę żywych komórek co w grupach z uszkodzeniem niedokrwienno/reperfuzyjnym bez proszku z owoców dzikiej róży (Grupy 2 i 4) z wyjątkiem niższej liczby pałeczek jelitowych. Jednakże liczba żywych komórek na podłożu umożliwiającym wzrost pałeczek mlekowych była teraz (w Grupie 5) zdominowana przez L. plantarum 299v. Tabela 4. Flora bakteryjna w kątnicy po uszkodzeniu niedokrwienno/reperfuzyjnym u myszy. Mysz Mediana liczby żywych komórek (CFU na g treści kątnicy) Wszystkie beztlenowce Wszystkie tlenowce Pałeczki mlekowe Pałeczki jelitowe G1. Kontrola A; bez uszkodzenia (bez niedokrwienia/reperfuzji; normalne pożywienie 2x108 1x108 5x108 3x103 G2. Kontrola B; normalne pożywienie 3x109 1x109 1x109 4x103 9 Mysz 5 10 15 Mediana liczby żywych komórek (CFU na g treści kątnicy) Wszystkie beztlenowce Wszystkie tlenowce Pałeczki mlekowe Pałeczki jelitowe G3. Normalne pożywienie + proszek z owoców dzikiej róży (RHP) 1x108 4x108 1x108 <102 G4. Normalne pożywienie + L. plantarum 299v 3x109 4x109 2x109 3x103 G5. Normalne pożywienie + RHP + L. plantarum 299v 4x109 2x109 3x109 <102 Wniosek [0047] Taniny w owocach dzikiej róży zmniejszały całkowite obciążenie bakteriami w jelicie myszy z uszkodzeniem, ale gdy myszom podawano L. plantarum 299v jednocześnie z owocami dzikiej róży zmniejszenie było osłabiane i wywołany taniną spadek był uzupełniany przez L. plantarum 299v. Zatem taniny podtrzymywały równowagę flory jelitowej na korzyść probiotycznego szczepu. Peroksydacja lipidów była osłabiana przez podawanie proszku z owoców dzikiej róży, ale efekt ten był wzmacniany przez obecność L. plantarum 299v wraz z proszkiem z owoców dzikiej róży. [0048] Szczepy L. plantarum HEAL 9, HEAL 19 i HEAL 99 wykazują wyższą aktywność tanazy niż L. plantarum 299v i dodatkowo większą zdolność do przylegania do ludzkich komórek błony śluzowej okrężnicy niż L. plantarum 299v. [0049] Zgodnie z kolejnym aspektem niniejsze ujawnienie dotyczy zastosowania wytwarzającego tanazę szczepu Lactobacillus plantarum lub blisko spokrewnionych gatunków Lactobacillus o zdolności do przylegania do błony śluzowej jelita człowieka w połączeniu z taniną do wytwarzania nowej żywności. Zastrzeżenia patentowe 20 25 30 1. Kompozycja zawierająca wytwarzający tanazę szczep Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, o zdolności do przylegania do błony śluzowej jelita człowieka, w połączeniu z taniną, do stosowania w profilaktyce i/lub leczeniu uszkodzenia niedokrwienno/reperfuzyjnego. 2. Kompozycja do stosowania według zastrzeżenia 1, w której zawartość taniny wynosi około 500-1000 mg/dzień. 3. Kompozycja do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 albo 2, gdzie zastosowanie obejmuje podawanie wytwarzającego tanazę Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, w ilości nie mniejszej niż 109 cfu na dawkę na dzień. 4. Kompozycja do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-3, która to kompozycja zawiera nośnik. 5. Kompozycja do stosowania według zastrzeżenia 4, w której nośnik stanowi produkt spożywczy. 6. Kompozycja do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-5, która to kompozycja jest do podawania doustnego. 7. Kompozycja do stosowania według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-6, która to kompozycja jest formułowana jako zawiesina, tabletka, kapsułka lub proszek. 10










Grupy dyskusyjne