Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 2266422 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 2266422 T3


EP 2266422 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) (51) 2266422 T3 Int.Cl. A23L 33/105 (2016.01) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 17.05.2005 10181110.7 A23L 33/21 (2016.01) A61K 31/01 (2006.01) A61K 31/702 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 21.08.2019 Europejski Biuletyn Patentowy 2019/34 EP 2266422 B1 A61K 31/715 (2006.01) A61K 31/733 (2006.01) A23L 33/00 (2016.01) A23L 29/244 (2016.01) A23L 29/30 (2016.01) A23L 33/10 (2016.01) A23L 33/22 (2016.01) A23L 33/125 (2016.01) (54) Tytuł wynalazku: Synergizm GOS i polifruktozy (30) Pierwszeństwo: 17.05.2004 EP 04076479 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 29.12.2010 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/52 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 28.02.2020 Wiadomości Urzędu Patentowego 2020/02 (73) Uprawniony z patentu: N.V. Nutricia, Zoetermeer, NL PL/EP 2266422 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: GELSKE SPEELMANS, Wageningen, NL MARIA JOHANNA ADRIANA PETRONELLA GOVERS, Bennekom, NL JAN KNOL, Wageningen, NL ERIC ALEXANDER FRANCISCUS VAN TOL, Arnhem, NL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Małgorzata Kaczmarczyk SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.K. Skr. poczt. 6 00-956 Warszawa 10 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). SGS-18483/VAL EP 2 266 422 B1 Opis Dziedzina wynalazku 5 [0001] Wynalazek dotyczy dziedziny ludzkiego zdrowia i odżywiania. Zapewnia on nowe mieszaniny synergistyczne prebiotycznych mieszanin galakto-oligosacharydów (GOS, na przykład TOS) i polifruktozy (inuliny), jak również zawierające je kompozycje odżywcze. Kompozycje odżywcze mają korzystne efekty, gdy podaje się je niemowlętom karmionym butelką lub karmionym częściowo butelką i mają również działanie poprawiające zdrowie, gdy przyjmują je dorośli mający problemy jelitowe, takie jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD) lub zespół jelita drażliwego (IBS). Tło wynalazku 10 15 20 25 30 35 40 [0002] Mikroflora ludzkiego jelita grubego (typowo podzielonego na jelito ślepe, okrężnicę i odbytnicę) odgrywa kluczową rolę zarówno w odżywianiu jak i zdrowiu człowieka. Na kompozycję bakteryjną można wpływać i modulować poprzez przyjmowanie diety. Węglowodany, które przechodzą przez żołądek i jelito cienkie są metabolizowane przez bakterie i tworzą się jako główny produkt końcowy metabolizmu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), takich jak octan, propionian, maślan i walerian, które następnie uwalniają się do krwi. Inne produkty końcowe fermentacji bakteryjnej obejmują na przykład mleczan i bursztynian. Całkowite ilości i kompozycje (względne ilości) tych produktów końcowych z kolei mają poważny wpływ na wzrost bakterii, pH, wykluczanie gatunków patogennych, itd. Sposobem dla korzystnego wpływania na florę mikrobiologiczną i ludzkie zdrowie jest podawanie prebiotyków. ?Prebiotyki? zdefiniowano jako ?składniki żywności nie ulegające trawieniu, które korzystnie wpływają na gospodarza poprzez selektywne stymulowanie wzrostu i/lub aktywności jednej lub ograniczonej liczby bakterii w okrężnicy, a zatem poprawiają zdrowie gospodarza (Gibson i Roberfroid 1995, J. Nutr. 125, 1401-1412). Kryteriami, które związek musi spełnić, aby być zaklasyfikowanym jako prebiotyk są: 1) nie może ulegać hydrolizie lub wchłanianiu w górnej części przewodu pokarmowego (żołądek, jelito cienkie), 2) musi być fermentowany selektywnie przez jedną lub większą liczbę potencjalnie korzystnych bakterii w okrężnicy, 3) musi zmieniać florę bakteryjną okrężnicy w kierunku zdrowszej kompozycji i 4) musi korzystnie indukować efekty, które są korzystne dla zdrowia osobnika. Powszechnie stosowanymi prebiotykami są tak zwane niestrawne węglowodany (lub ?rozpuszczalny błonnik pokarmowy?), które przechodzą niestrawione przez górną część przewodu pokarmowego do jelita grubego. Obejmują one na przykład fruktooligosacharydy (FOS), oligofruktozę, inulinę i transgalakto-oligosacharydy (TOS). Należy zauważyć, że w literaturze, często występuje niekonsekwencja między zastosowaniem różnych określeń, takich jak fruktooligosacharyd, inulina, oligofruktoza i inulo-oligosacharydy i to samo określenie można zastosować dla różnych związków lub kompozycji. [0003] Dobrze znanymi korzystnymi bakteriami, które stymulują pobieranie prebiotyków, są bakterie kwasu mlekowego, takie jak Lactobacilli i Bifidobacteria, i korzyści zdrowotne przypisano im ze względu na ten efekt stymulatorowy. Na przykład, opisano korzystne efekty inuliny i fruktanów typu inuliny, takich jak oligofruktoza, na funkcje jelit (Jenkins i wsp. 1999, J. Nutrition 129, 1431S-1433S) i uważa się, że efekt ten jest związany z efektem bifidogenicznym, który dotyczy efektu stymulującego selektywny wzrost wszystkich bifidobakterii, mierzony albo in vivo przez zliczenia bifidobakteryjne w kale albo in vitro (patrz np. Roberfroid, Am J Clin Nutr 2001, 73(supl.), 406S-409S). -2- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [0004] Ludzkie mleko wydaje się również mieć efekt bifidogeniczny, ponieważ przeważającymi bakteriami, które ustalają się u niemowląt karmionych piersią, są bifidobakterie. Przeciwnie, kolonizacja bakteryjna niemowląt karmionych preparatem do początkowego żywienia niemowląt nie jest zdominowana przez bifidobakterie i jest bardziej różnorodna pod względem gatunków bakterii (Harmsen i wsp. 2000, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30, 61-67). Uważa się, że oligosacharydy obecne w ludzkim mleku są odpowiedzialne za efekt bifidogeniczny lub prebiotyczny i podjęto starania, aby zmodyfikować preparat do początkowego żywienia niemowląt (ang. infant formula) w taki sposób, aby przypominał ludzkie mleko tak bardzo jak to tylko możliwe, a szczególnie, aby miał ten sam lub bardzo podobny efekt prebiotyczny jak mleko ludzkie. Dokonano tego poprzez dodanie prebiotyków do preparatu do początkowego żywienia niemowląt (Boehm i wsp. Acta Paediatr. Suppl. 2003, 441, 64-67 i Moro i wsp. 2002, J Pediatr Gastroenterol Nutr 34, 291-295). Na przykład, opisano, że suplementowanie preparatu mleka bydlęcego mieszaniną oligosacharydów zawierającą trans-galaktooligosacharydy (TOS) i inulinę HP zwiększa zliczenia bifidobakterii w kale u niemowląt karmionych butelką (Boehm i wsp. 2002, Arch Dis Child 86, F178-F181). [0005] Również opisano, że suplementacja preparatu do początkowego żywienia niemowląt TOS i inuliną ma efekt bifidogeniczny i zmniejsza pH kału (Boehm i wsp. 2003 supra; Moro i wsp. 2003, Acta Paediatr. Suppl. 441:77-79; Marini i wsp. 2003, Acta Paediatr. Suppl. 441:80-81; Boehm i wsp. 2002, Arch. Dis. Child Fetal. Neonata. Red. 86:F178-F181; Moro i wsp. 2002, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 34:291-295; Schmelzle i wsp. 2003, J Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 36:343-51). [0006] Po fermentacji prebiotyków przez bakterie kwasu mlekowego produkowane są kwasy organiczne i zostaje obniżone pH. Lactobacilli produkują albo mleczan albo mleczan i octan (krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, SCFA). Mleczan może być w postaci L lub D. Bifidobacteria, z drugiej strony, produkują L-mleczan i octan, lecz nie Dmleczan. Bifidobacteria (i inne bakterie kwasu mlekowego) zwykle nie prowadzą do produkcji gazów, takich jak H2 i CH4. Nie produkują one również innych SCFA, takich jak propionian, maślan, izomaślan, walerian i izowalerian. Obecność SCFA, takich jak izomaślan i izowalerian, wskazuje na fermentację węglowodanów przez inne gatunki bakterii, takie jak Clostridia i Bacteroides lub Enterobacteriaceae, lub wskazują na fermentację białek (której Bifidobacteria ma słabą zdolność). Również inne bakterie jelitowe, takie jak Propionibacteria, Enterococci i Pediococci, są zdolne do produkowania octanu lub mleczanu. [0007] Uprzednio donoszono, że przyjmowanie pewnych prebiotycznych węglowodanów zwiększa (względne) ilości Bifidobacteria i/lub Lactobacilli. Równocześnie zaobserwowano zwiększone tworzenie się SCFA i zmniejszenie pH. Lecz również, gdy wprowadzano prebiotyki, takie jak inulina lub GOS, do diety, zarejestrowano tworzenie gazów, które skutkują niepożądanymi objawami takimi jak wzdęcia i bóle brzucha. Ponadto, zarejestrowano nie tylko octan lecz także zwiększenie poziomu, na przykład, maślanu, co jest niepożądane. Opisano zatem szereg niepożądanych skutków wynikających ze spożywania żywności suplementowanej pewnymi prebiotykami. [0008] W okrężnicy i kale niemowląt karmionych piersią przeważająco stwierdzanym SCFA jest octan. Ponadto stwierdza się wysokie stężenia mleczanu. Te (względne) ilości są wyższe niż te obserwowane u dorosłych (gdzie stężenia mleczanu są ogólnie znikome) lub u niemowląt karmionych standardowym preparatem mleka. Następnie, stężenia propionianu, a szczególnie maślanu, są znacznie niższe w okrężnicy i kale niemowląt karmionych piersią niż u dorosłych, a nawet niższe niż u niemowląt karmionych standardowym preparatem do początkowego żywienia niemowląt. pH kału jest niższe u dzieci karmionych piersią. Jak wspomniano powyżej, pożądane jest zapewnienie kompozycji odżywczych, szczególnie kompozycji preparatu mleka, które, gdy się je -3- spożywa, skutkują mikroflorą jelitową bardzo przypominającą tą u niemowląt karmionych piersią. 5 10 [0009] Opisano wiele efektów zdrowotnych SCFA i mleczanu i niskiego pH okrężnicy. Opisano, że obniżone pH i obecność kwasów organicznych ma efekt przeciw-patogenny i zapewnia przewagę dla bakterii tolerancyjnych względem kwasu, takich jak bakterie kwasu mlekowego (w tym Bifidobacteria). Opisano również wpływ SCFA na ścianę jelita. SCFA są źródłem energii kolonocytów i poprzez to wspomagają integralność bariery jelitowej. SCFA również są zaangażowane w efekty perystaltyki, metabolizmu kwasu żółciowego, wchłaniania wody i różnicowania komórek (patrz np. EP1105002). Wiadomo, że SCFA stymulują produkcję śluzu i są zaangażowane we wchłanianie minerałów i produkcję śluzu. Szczegółowy opis wynalazku 15 20 25 30 35 40 45 50 [0010] Twórcy zaskakująco stwierdzili, że GOS (zwłaszcza TOS) i polifruktoza (inulina), gdy podaje się je razem, zapewniają liczne korzystne efekty, których nie można wyjaśnić przez wzrost liczby jelitowych bifidobakterii i które zatem nie są, ze względu na efekt bifidogeniczny, opisane dla TOS lub inuliny HP w uprzednim stanie techniki (np. w Boehm i wsp. (2002, supra). Zwłaszcza, nieoczekiwanie stwierdzono, że po podaniu mieszanin GOS i polifruktozy zwiększyły się całkowite ilości utworzonych SCFA, zmniejszyły się względne ilości octanu i mleczanu i zmniejszyło się pH kału u niemowląt, przy czym efekty te nie korelowały ze zwiększeniem (względnej) ilości Bifidobacteria. Poza korzystną ilością i profilem SCFA i zwiększoną ilością mleczanu zaobserwowano zmniejszenie tworzenia gazów. Ponadto stwierdzono, że sam mleczan ma do tej pory nieznany korzystny efekt na okrężnicę, ponieważ stwierdzono, że zwiększa wydzielanie prostaglandyny E1 i prostaglandyny E2. Efekt ten wcześniej opisywano tylko dla SCFA, szczególnie octanu (Willemsen i wsp. 2003, Gut 52, 1442-1447). Kompozycje zawierające mleczan i kompozycje zawierające prebiotyki, które stymulują produkcję mleczanu można zatem zastosować do stymulowania produkcji mucyny i wspomagania integralności bariery błony śluzowej (mukoprotekcja). Ponadto stwierdzono, że mleczan zmniejsza spontaniczne skurcze i napięcia mięśni okrężnicy skutkując ulgą w skurczu i bólu. [0011] Kompozycje prebiotyczne są zatem nowe pod tym katem, że nie zwiększają, lub nieistotnie zwiększają, liczby Bifidobacteria, podczas gdy skutkują one zwiększonymi łącznymi ilościami SCFA, korzystnymi zmianami w profilu SCFA (zwiększenie octanu, zmniejszenie maślanu i propionianu), zwiększenie kwasu mlekowego (i wynikające korzystne efekty zmniejszenia skurczów i napięcia i efekt muko-stymulatorowy), zmniejszenie pH kału, zmniejszenie tworzenia gazów i bardziej stopniowe tworzenie SCFA (w tym tworzenie w dystalnej części okrężnicy), tj. ogólnym optymalnym wzorem produktów fermentacji (więcej L-mleczanu, mniej maślanu itd.). Wszystkie te zmiany czynią środowisko okrężnicy bardziej przypominające to u dzieci karmionych piersią. W jednym przykładzie wykonania wynalazku zapewniono tu zatem zastosowanie mieszanin GOS i polifruktozy w skutecznych ilościach do otrzymywania kompozycji, które prowadzą do środowiska okrężnicy zasadniczo podobnego do tego niemowląt karmionych piersią. [0012] Stwierdzone skuteczne efekty były istotnie wyraźniejsze przy współpodawaniu niż gdy podawano sam GOS lub polifruktozę (np. TOS lub inulinę), wskazując, że GOS i polifruktoza działają synergistycznie. W uprzednim stanie techniki nie przeprowadzano żadnych badań, w których pojedyncze efekty podawania TOS i inuliny porównywano bezpośrednio do współpodawania tych dwóch typów związków i wyraźnie takich niezależnych pojedynczych badań nie można porównywać do siebie i są nieodpowiednie do identyfikowania efektów synergistycznych. [0013] To nowe oddziaływanie synergistyczne GOS i polifruktozy (np. TOS i inuliny) i efekty in vivo ich współpodawania prowadzi do nowych zastosowań kompozycji zawierających zarówno GOS jak i polifruktozę w odpowiednich (synergistycznych) -4- ilościach, takich jak leczenie lub zapobieganie alergii. Dodatkowo, kompozycję zawierającą mleczan (D-mleczan i/lub L-mleczan, korzystnie L-mleczan) można zastosować do leczenia lub zapobiegania jednemu lub większej liczbie tych objawów lub zaburzeń. 5 10 [0014] Zatem, nieoczekiwanie, fermentacja specyficznych mieszanin prebiotyków (GOS i polifruktozy) przez florę jelitową skutkuje wzmocnionym i kinetycznie korzystnym tworzeniem SCFA i mleczanu i ulepszonym wzorem metabolicznych produktów końcowych. W związku z tym skutkuje wieloma korzystnymi efektami, takimi jak wpływy na wytwarzanie śluzu, wpływy przeciwzapalne, wpływy na odczuwanie bólu i wpływy na skurcze brzucha/kolki (zarówno poprzez rozluźnienie okrężnicy, jak i zmniejszenie spontanicznych skurczów). Definicje [0015] ?Polisacharydy? odnoszą się do łańcuchów węglowodanowych jednostek monosacharydowych o długości łańcucha wynoszącej co najmniej 10 jednostek. Natomiast, ?oligosacharydy? mają długość łańcucha mniejszą niż 10 jednostek 15 20 25 30 35 40 45 [0016] ?Stopień polimeryzacji? lub ?DP? odnosi się do łącznej liczby jednostek sacharydowych w łańcuchu oligo- lub polisacharydowym. ?Średni DP? odnosi się do średniego DP łańcuchów oligosachrydowych lub polisacharydowych w kompozycji, bez brania pod uwagę możliwych mono- i disacharydów (które korzystnie usuwa się, jeśli są obecne). Średni DP kompozycji odnosi się do rozróżnienia kompozycji. Dodatkowo rozróżniający jest % jednostek sacharydowych, taki jak % glukozy i % fruktozy w kompozycji. [0017] ?Polifruktoza? lub ?polifruktan? lub ?fruktopolisacharyd? odnosi się do węglowodanu polisacharydowego zawierającego łańcuch ? połączonych jednostek fruktozy o stopniu polimeryzacji wynoszącym 10 lub więcej i obejmuje, na przykład, inulinę (np. inulinę HP), lewan i/lub ?polifruktan typu mieszanego? (patrz poniżej). [0018] ?Inulina? lub ?niehydrolizowana inulina? lub ?inulina HP? odnosi się tu do łańcuchów fruktozowych zakończonych glukozą o większości łańcuchów (co najmniej 90%, korzystnie co najmniej 95%) mających stopień polimeryzacji (DP) wynoszący 10 lub więcej. Inulinę można zatem opisać, jako GFn, przy czym G reprezentuje jednostkę glukozylową, F reprezentuje jednostkę fruktozylową, a n oznacza liczbę jednostek fruktozylowych połączonych ze sobą, przy czym n oznacza 9 lub więcej. Stosunek G/F wynosi około 0,1 do 0. Jednak mała część cząsteczek inuliny może nie mieć końcowej jednostki glukozy. Średni DP korzystnie wynosi co najmniej 15, bardziej korzystnie 20 lub więcej, tak jak 20, 21, 22, 23, 25, 20 30, 40, 60, 70, 100, 150 lub więcej. W inulinie, jednostki fruktozy łączą się wiązaniem ?(2?1). Odpowiednią inuliną jest na przykład handlowo dostępna jako Raftiline?HP (Orafti) o średnim DP > 23. [0019] ?Hydrolizowana inulina? lub ?oligofruktoza? odnosi się do mieszanin łańcuchów fruktozowych zakończonych glukozą i fruktozą o DP poniżej 10. Zatem, hydrolizowaną inulinę można opisać, jako mieszaninę łańcuchów GFn i łańcuchów Fn (przy czym G oznacza jednostkę glukozylową, F oznacza jednostkę fruktozylową i n=1-8). Hydrolizowana inulina jest produktem hydrolizy (enzymatycznej lub kwasowej) lub częściowym produktem hydrolizy inuliny, wynikającym z trawienia wiązań ?(1-2) fruktozylo-fruktozy. Określenie hydrolizowana inulina obejmuje również syntetycznie wykonaną lub wykonaną w sposób rekombinowany inulinę, która ma ten sam skład strukturalny. [0020] ?Lewan? lub ?lewulan? lub ?lewulina? lub ?lewulosan? odnosi się do polisacharydu składającego się z polifruktozy, w której jednostki fruktozy łączą się wiązaniami ?(2?6). Początkowe ugrupowanie glukozy może być obecne, lecz nie jest konieczne. Stopień polimeryzacji wynosi powyżej 10. -5- [0021] W ?polifruktanach typu mieszanego? jednostki fruktozy łączą się wiązaniami ?(2?1) i ?(2?6). Polifruktany typu mieszanego są rozgałęzione i mają DP > 10. 5 10 15 20 [0022] ?GOS? lub ?galaktooligosacharydy? lub ?trans-galaktooligosacharydy? lub ?TOS? odnosi się do oligosacharydów złożonych z jednostek galaktozy o DP wynoszącym 10 lub mniej i średnim DP wynoszącym 2, 3, 4, 5 lub 6. Jednostka glukozy może być obecna na końcu redukującym łańcucha. Korzystnie GOS zawiera co najmniej 2/3 jednostek galaktozydowych. Najbardziej korzystnie trans-galaktooligosacharydy (TOS) mają wiązania ?-(1-4)glikozydowe. Taki GOS stwierdza się na przykład w Vivinal?GOS (handlowo dostępny od Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Holandia) zawierający transgalaktooligosacharydy z wiązaniami ?-(1-4)glikozydowymi i wiązaniami ?-(16)glikozydowymi. [0023] ?SCFA? lub ?krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe? odnosi się do kwasów tłuszczowych o długościach łańcucha węglowego wynoszących do C6, wytwarzanych jako produkt końcowy bakteryjnej fermentacji jelitowej, taki jak octan (C2), propionian (C3), maślan i izomaślan (C4), walerian i izowalerian (C5) i inne. Wyrażenie ?iC4-5? odnosi się do sumy izomaślanu, walerianu i izowalerianu. [0024] ?Synergistycznie skuteczna ilość? odnosi się do ilości GOS i polifruktozy (na przykład TOS i inuliny), która, gdy współpodawana, nadaje jeden (lub większą liczbę) specyficznych efektów fizjologicznych (jak opisano w innym miejscu), poprzez co łączny efekt współpodawania jest istotnie większy niż suma efektu pojedynczego podawania GOS lub polifruktozy. Na przykład, jeśli efektem podawania samego GOS jest X i efektem podawania samej polifruktozy jest Y, to efekt współpodawania GOS i polifruktozy jest większy niż X+Y i na przykład efekt współpodawania ? stężenia GOS plus ? stężenia polifruktozy ma efekt większy niż ? X + ? Y, itd. 25 [0025] ?Współpodawanie? dwóch lub większej liczby substancji odnosi się do podawania tych substancji jednemu osobnikowi, albo w jednej kompozycji albo w oddzielnych kompozycjach (zestawach części; jako skojarzona kompozycja), które podaje się w tym samym czasie (równocześnie) lub w krótkim odstępie czasu (zastosowanie oddzielne lub sekwencyjne, np. w ciągu minut lub godzin). 30 [0026] ?Dojelitowe? odnosi się tu do dostarczania bezpośrednio do przewodu pokarmowego osobnika (np. doustnie lub przez rurkę, cewnik lub stomię). [0027] Określenie ?zawierający? należy interpretować jako określające obecność danych części, etapów lub składników, lecz nie wyklucza obecności jednej lub większej liczby dodatkowych części, etapów lub składników. 35 40 [0028] ?Niemowlę? dotyczy ludzi w wieku 0-36 miesięcy, korzystnie 0-18 miesięcy lub bardziej korzystnie 0-12 miesięcy. [0029] ?Niemowlęta karmione piersią? dotyczy niemowląt karmionych wyłącznie mlekiem kobiecym. ?Niemowlęta nie lub częściowo karmione piersią? są niemowlętami nie karmionymi wyłącznie mlekiem kobiecym. Obejmuje to niemowlęta z co najmniej jedną butelką (około 80 ml) preparatu mleka na dobę. [0030] ?Procent? lub ?średnia? dotyczy ogólnie procentów średnich wagowych, o ile nie określono inaczej lub o ile nie jest jasne, że chodzi o inną podstawę. 45 [0031] W jednym przykładzie wykonania niniejszy wynalazek zapewnia szereg nowych zastosowań kompozycji zawierających zarówno GOS, jak i polifruktozę w odpowiednich (synergicznie skutecznych) ilościach. Zastosowania i sposoby według wynalazku -6- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [0032] W różnych zastosowaniach tu opisanych, osobnikiem korzystnie jest osobnik ludzki, bardziej korzystnie niemowlę, takie jak od nowonarodzonego niemowlęcia do 12miesięcznego niemowlęcia. Szczególnie dotyczy to niemowląt karmionych butelką lub częściowo karmionych butelką. Alternatywnie, osobnik może być też dzieckiem, nastolatkiem lub dorosłym. W szczególności można zapobiegać lub leczyć problemy jelitowe, takie jak między innymi alergie wynikające z nieoptymalnego funkcjonowania jelita. [0033] Kompozycje zawierające zarówno GOS jak i polifruktozę, takie jak kompozycje zawierające TOS i inulinę, można w jednym przykładzie wykonania zastosować do indukowania produkcji SCFA w jelicie grubym osobnika i do istotnego zwiększania całkowitej ilości SCFA (jelitowych i/lub kałowych) produkowanych po podawaniu i/lub do istotnego modyfikowania względnych ilości produkowanych SCFA (jelitowych i/lub w kale), w szczególności do zwiększania względnej ilości (jelitowego i/lub w kale) octanu z całkowitych SCFA i/lub do istotnego zwiększania ilości (bezwzględnej i względnej) produkowanego mleczanu jelitowego i/lub do rozszerzenia produkcji SCFA do dystalnej części okrężnicy i/lub do istotnego zmniejszenia pH w jelicie grubym i pH w kale. Również może obniżyć się suma jelitowego i/lub kałowego maślanu, izomaślanu, walerianu i/lub izowalerianu względem całkowitych SCFA. Efekty te osiąga się po podawaniu, bez istotnego wpływu na całkowitą i/lub względną liczbę jelitowych bifidobakterii. Zapewniono tu kompozycje do leczenia lub zapobiegania jakimkolwiek chorobom lub zaburzeniom lub dyskomfortom związanym lub powodowanym przez jeden lub większą liczbę tych efektów jelitowych. [0034] Wynalazek zapewnia zastosowanie galaktooligosacharydów i polifruktozy do wytwarzania kompozycji do leczenia lub zapobiegania alergii, egzemy lub chorób atopowych. [0035] O ile nie określono inaczej, ?istotny wzrost? (na przykład SCFA, octanu lub mleczanu) odnosi się tu do wzrostu wynoszącego co najmniej 5%, korzystnie co najmniej 10%, bardziej korzystnie co najmniej 20% lub więcej, w porównaniu z produkowaną ilością, gdy podaje się sam GOS lub polifruktozę (np. inulinę). Podobnie, o ile nie określono inaczej, ?istotne zmniejszenie? (na przykład tworzenia gazów) dotyczy zmniejszenia wynoszącego co najmniej 5%, korzystnie co najmniej 10%, korzystnie co najmniej 20%, 25%, 50% lub więcej (np. 70%, 80%, 90%, 100%) w porównaniu z produkowaną ilością, gdy podaje się samą polifruktozę (np. inulinę). [0036] Wzrost całkowitej ilości produkowanych SCFA, jako produkt fermentacji kompozycji GOS i polifruktozy można również zmierzyć jako istotne zmniejszenie pH próbek kału osobników, co odzwierciedla zmniejszenie pH w jelicie grubym in vivo. U niemowląt stwierdzono, że pH kału zmniejszyło się do około pH 5,8 lub mniej, np. pH 5,6, 5,5 lub 5,4 lub 5,2 po współpodaniu TOS i polifruktozy (np. inuliny), natomiast pH niemowląt karmionych standardowym preparatem wynosiło około lub powyżej pH 6, np. około pH 5,9, 6,8 lub nawet 7,0. Istotne zmniejszenie pH dotyczy zatem zmniejszenia pH o co najmniej 15% lub 0,9 jednostki w porównaniu z niemowlętami karmionymi standardowym preparatem. [0037] Innym korzystnym efektem współpodawania GOS i polifruktozy w odpowiednich ilościach jest to, że kompozycja SCFA jest istotnie różna niż gdy podaje się GOS lub polifruktozę. Szczególnie istotnie zmniejsza się względna ilość maślanu, podczas gdy względna ilość octanu istotnie się zwiększa. Kompozycje można zatem zastosować do zmiany nie tylko całkowitych ilości SCFA, lecz także względnych proporcji SCFA. U niemowląt, którym współpodawano TOS i polifrukotzę (np. inulinę), względne poziomy SCFA przypominały bardziej poziomy stwierdzane u niemowląt karmionych piersią, ze stosunkami octan:propionian:maślan ogólnie 80-85% : 10-15% : 1-5%, natomiast u -7- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 niemowląt karmionych standardowym preparatem mleka stosunki były ogólnie około 6974% : 16-19% : 5-6% (jak przedstawiono w przykładach). Zatem, w kompozycjach według wynalazku zwiększają się szczególnie względne ilości octanu i zmniejszają się względne ilości propionianu i maślanu. Współpodawanie GOS i polifruktozy skutkuje proporcjami octan : propionian : maślan przypominającymi te u niemowląt karmionych piersią znacznie bardziej niż te u niemowląt karmionych preparatem (co daje wysokie poziomy maślanu i propionianu i względnie niskie poziomy octanu). Wpływ na względne proporcje SCFA można zmierzyć sposobami znanymi w dziedzinie, takimi jak chromatografia gazowa próbek kału w różnych punktach czasowych po podaniu, stosując albo badania in vivo albo układy fermentacji in vitro, jak np. opisano w przykładach. ?Istotnie modyfikowana kompozycja SCFA? lub ?istotnie zwiększona ilość octanu? odnosi się do ilości octanu (% całkowitych SCFA) wynoszącej co najmniej około 4%, 5%, 10%, 15% lub więcej, wyższej niż ta, gdy nie podaje się GOS lub polifruktozy lub gdy GOS lub polifruktozę podaje się pojedynczo. Korzystnie względne ilości propionianu i/lub maślanu są niższe niż gdy nie podaje się GOS lub polifruktozy lub gdy GOS lub polifruktozę podaje się pojedynczo. W jednym przykładzie wykonania, kompozycja według wynalazku jest odpowiednia do zwiększania jelitowego i/lub kałowego octanu do powyżej 85%, np. 86%, 87%, 88%, 90% lub więcej całkowitych SCFA. [0038] Jeszcze kolejnym korzystnym efektem obserwowanym, gdy współpodaje się GOS i polifruktozę, jest zmniejszenie rozgałęzionych SCFA w porównaniu z proporcją rozgałęzionych SCFA stwierdzanych, gdy podaje się tylko GOS lub tylko polifruktozę. ?Istotne zmniejszenie w rozgałęzionych SCFA?, jak tu stosowane, dotyczy zmniejszenia co najmniej 70% w porównaniu ze stężeniami stwierdzanymi u niemowląt nie karmionych prebiotykami lub skutkuje proporcją w kale wynoszącą mniej niż 1,5% całkowitych SCFA. Proporcję rozgałęzionych SCFA względem całkowitych SCFA można zmierzyć poprzez podzielenie sumy rozgałęzionych SCFA, tj. izomaślanu plus izowalerianu plus walerianu, przez sumę całkowitych SCFA, tj. octanu plus propionianu plus maślanu plus izomaślanu plus izowalerianu plus walerianu itd. Zmniejszanie proporcji rozgałęzionych SCFA jest korzystne dla zdrowia osobnika, ponieważ rozgałęzienia SCFA są uszkadzające. Wskazuje to na mniejszą degradację białek, co jest niepożądane, ponieważ fermentacja białek skutkuje zwiększeniem pH i tworzeniem czynników uszkadzających takich jak H2S. [0039] Istotne zmniejszenie maślanu odnosi się do zmniejszenia o co najmniej 50% w porównaniu ze stężeniami stwierdzanymi u niemowląt nie karmionych prebiotykami lub skutkuje proporcją w kale wynoszącą mniej niż 4% całkowitych SCFA. W jednym przykładzie wykonania, kompozycja według wynalazku jest odpowiednia do zmniejszania sumy jelitowego (i/lub kałowego) maślanu, izomaślanu, walerianu i izowalerianu i wynosi poniżej 7% całkowitych SCFA, tak jak 6,5%, 6%, 5%, 4% lub mniej całkowitych SCFA. [0040] W innym przykładzie wykonania, kompozycje zawierające GOS i polifruktozę są odpowiednie do zwiększania długości fermentacji w obrębie okrężnicy. Po współpodawaniu fermentacja bakteryjna nadal będzie aktywna zwłaszcza w najbardziej dystalnych częściach okrężnicy, na co wskazuje produkcja SCFA w dystalnej części okrężnicy. W ogóle lub bardzo niewiele SCFA produkuje się w dystalnej części okrężnicy po podaniu kompozycji zawierających tylko GOS lub tylko polifruktozę. Dodatkowo, obserwuje się szybką fermentację na początku okrężnicy po współpodawaniu, co jest szczególnie ważne dla efektów przeciwpatogennych i obserwuje się ją również u niemowląt karmionych piersią. Ogólnie, pokazuje to, że kompozycje są odpowiednie do ustanawiania i/lub utrzymywania względnie równego wzoru fermentacji w całej okrężnicy osobnika i do rozszerzania fermentacji i produkcji SCFA do dystalnego końca okrężnicy. SCFA i najprawdopodobniej również inne produkty fermentacji, szczególnie mleczan, zatem są produkowane w całej okrężnicy, na początku, w środku i na końcu okrężnicy. -8- 5 10 15 20 25 [0041] W kolejnym przykładzie wykonania, współpodawanie GOS i polifruktozy w ilościach synergistycznych można zastosować do istotnego zwiększania produkcji mleczanu, co można ponownie określić przez analizowanie próbek kału osobników badanych i osobników kontrolnych, którzy otrzymali kompozycje zawierające albo sam GOS albo samą polifruktozę lub równoważne kompozycje podstawowe bez prebiotyków. ?Istotne zwiększenie mleczanu? odnosi się do co najmniej 5%, 10%, 20% lub nawet 50% lub więcej produkowanego mleczanu u osobników, którym współpodawano kompozycje zawierające GOS i polifruktozę, w porównaniu z osobnikami, którym nie podawano GOS lub polifruktozy. Na przykład, niemowlęta karmione standardowym preparatem mleka suplementowanym mieszaninami 6 g/l TOS/inulina (90% : 10%) produkowały w 16 tygodniu około 16% mleczanu (jako % wszystkich kwasów), natomiast niemowlęta karmione standardowym preparatem produkowały około 0,6%, a niemowlęta karmione piersią produkowały około 35% mleczanu. Mimo braku dopasowania ilości mleczanu produkowanego przez niemowlęta karmione piersią, suplementowanie standardowego preparatu mleka mieszaninami TOS i inuliny prowadzi do istotnego wzrostu w produkcji mleczanu. Jak przedstawiono w Przykładach, stwierdzono, że mleczan ma nieoczekiwanie korzystne efekty. Podobnie do octanu, zwiększał on produkcję prostaglandyny E1 i prostaglandyny E2 i skutkuje wzmocnioną ekspresją mucyny nabłonkowej. Śluz jelitowy odgrywa ważną rolę w zdrowiu ludzkim, ponieważ służy jako bariera dla zakaźnych patogenów, alergenów i czynników rakotwórczych. Kompozycje, które wpływają pozytywnie na rozwój i/lub integralność błony śluzowej można zatem zastosować do wspomagania budowania zdrowej błony śluzowej u nowonarodzonych niemowląt i do wspomagania ustanawiania zdrowej błony śluzowej u niemowląt karmionych butelką lub częściowo karmionych butelką i u osobników cierpiących na objawy lub choroby wynikające z, lub związane z, nieprawidłowo funkcjonującą błoną śluzową jelita. [0042] Ponadto, spontaniczne skurcze i napięcie brzucha zmniejszyły się istotnie w sposób zależny od dawki po podaniu D- lub L-mleczanu. 30 35 40 45 [0043] Ponieważ stwierdzono, że sam mleczan ma wcześniej nieznane efekty, również przedmiotem wynalazku jest zapewnienie kompozycji zawierających mleczan w odpowiednich ilościach, które można zastosować do leczenia lub zapobiegania wyżej opisanym objawom i zaburzeniom. W jednym przykładzie wykonania kompozycje zawierają tylko mleczan w odpowiednich ilościach, natomiast w innych przykładach wykonania kompozycje GOS i polifrukotzy tu opisane ponadto zawierają mleczan, aby dalej zwiększać poziomy jelitowego mleczanu. Jedna taka kompozycja według wynalazku zawiera TOS i inulinę w synergistycznie skutecznych ilościach i ponadto zawiera mleczan w odpowiednich ilościach. W jednym przykładzie wykonania zapewniono kompozycje, które są odpowiednie do zwiększania jelitowego i/lub kałowego mleczanu do powyżej około 10 mmol/kg kału. [0044] Przez analizę próbek kału rozumie się pomiar pośredni rzeczywistego efektu in vivo. Podobnie, można przeprowadzać testy in vitro, w których populacje bakteryjne hoduje się in vitro i do hodowli dodaje się odpowiednie ilości kompozycji. Można zastosować zwłaszcza układ fermentacji in vitro opisany w Przykładach. [0045] Współpodawanie kompozycji zawierających GOS i polifruktozę można zatem zastosować do osiągnięcia jednego lub większej liczby z następujących efektów fizjologicznych: - istotnego wzrostu całkowitych SCFA - istotnego spadku pH - istotnie zmodyfikowanej kompozycji SCFA - istotnego spadku rozgałęzionych SCFA -9- - istotnego spadku produkcji gazów na mol produkowanego SCFA - dłuższej i bardziej wyrównanej fermentacji, w tym fermentacji wyrównanej w najbardziej dystalnych częściach okrężnicy i/lub - wysokiego początkowego tworzenia SCFA i/lub tworzenia kwasu mlekowego w najbardziej proksymalnej części okrężnicy - promowania produkcji SCFA na początku, w środku i na końcu okrężnicy - istotnego wzrostu kwasu mlekowego (bezwzględnego i/lub względnego) i/lub - wzrostu względnej ilości L-mleczanu jako stosunku całkowitego utworzonego kwasu mlekowego. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [0046] W korzystnym przykładzie wykonania co najmniej 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub wszystkie te efekty są istotnie zmodyfikowane, gdy stosuje się kompozycje zawierające zarówno GOS, jak i polifruktozę, w porównaniu z podawaniem kompozycji zawierających tylko GOS lub polifruktozę lub ani GOS ani polifruktozę. W szczególności, co najmniej 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub wszystkie te efekty są istotnie większe po współpodawaniu (synergistycznie skutecznej ilości) GOS i polifruktozy niż suma efektu(ów) podawania GOS i polifruktozy pojedynczo. [0047] Synergistyczne kompozycje według wynalazku, zatem, szczególnie nadają się do tworzenia i/lub utrzymania zdrowej mikroflory w jelicie grubym niemowlęcia po podawaniu synergistycznie skutecznej ilości. W korzystnym przykładzie wykonania niemowlę karmi się wyłącznie na bazie kompozycji, takiej jak preparat mleka suplementowany synergistycznie skuteczną ilością GOS i polifruktozy w pierwszych tygodniach po urodzeniu. Korzystną kompozycją, zatem, jest kompozycja dietetyczna dla niemowląt. W innym przykładzie wykonania niemowlę tylko częściowo karmi się kompozycją według wynalazku. Osobnik może w tym przypadku być dowolnym osobnikiem w zakresie od niemowlęcia, dziecka, nastolatka do dorosłego. Oczywiście podstawowe kompozycje, do których dodaje się GOS i polifruktozę w synergistycznie skutecznych ilościach różnią się w zależności od wieku osobnika, trybu podawania i głównych objawów do leczenia lub zapobiegania. Dla niemowląt, na przykład, podstawową kompozycją korzystnie jest postać ciekła lub proszku preparatu do początkowego żywienia niemowląt lub do dalszego żywienia niemowląt (ang. follow-on formula), podczas gdy dla dorosłych bardziej odpowiednia może być odżywcza kompozycja suplementacyjna (ciekła, półciekła lub stała) lub karmienie przez rurkę. [0048] W korzystnym przykładzie wykonania GOS i polifruktozę współpodaje się w synergistycznie skutecznej ilości odpowiedniej do istotnego zwiększania całkowitej ilości utworzonych jelitowych SCFA i/lub ?istotnie ulepszonej jelitowej kompozycji SCFA (szczególnie do istotnego wzrostu procentu octanu względem całkowitej ilości SCFA) i/lub do istotnego zwiększenia produkcji mleczanu i/lub do niższego jelitowego pH i/lub do istotnego zmniejszenia tworzenia gazów jelitowych. Zapewnione jest zastosowanie kompozycji zawierających synergistycznie skuteczną ilość GOS i polifruktozy do leczenia i/lub zapobiegania alergii. [0049] Poprzez te zmiany w poziomach, profilu SCFA i jelitowym pH, kompozycje są zdolne do powodowania jednego lub większej liczby z następujących późniejszych efektów: a) Zmniejszonej przepuszczalności jelitowej w miejscu produkcji SCFA. Jest to ważne dla zapobiegania chorobie i utrzymaniu zdrowia, szczególnie do zapobiegania rozwojowi alergii. Stwierdzenie, że współpodawanie GOS i polifruktozy powoduje bardziej wyrównaną fermentację i rozszerza fermentację do dystalnej części okrężnicy jest ważne pod tym względem, ponieważ przepuszczalność jelita, w tym dystalnych części okrężnicy, można równomiernie zmniejszyć i jelito można w ten sposób równomiernie utrzymywać w zdrowym stanie. - 10 - b) Wzmocnienia ruchliwości lub ruchów perystaltycznych jelita, co zmniejsza lub zapobiega zaparciom, powszechnemu problemowi obserwowanemu u niemowląt karmionych preparatem. 5 c) Zmniejszonych ilości spontanicznych skurczów i napięcia mięśni okrężnicy skutkujących mniejszą ilością skurczów i mniejszą ilością bólu brzucha. d) Zwiększonego wchłaniania jonów wapnia, co jest ważne dla mineralizacji kości i rozwoju kości osobnika, szczególnie jeśli osobnikiem jest niemowlę. e) Możliwości zmniejszenia wtórnych objawów obniżonego zdrowia, takich jak zmęczenie, depresja i wahania nastrojów. 10 15 f) Istotnego zwiększenia produkcji śluzu w jelitowej błonie śluzowej, co zapewnia ochronę przed przyłączaniem i kolonizacją patogenów. Zwłaszcza stwierdzono, że poziomy mleczanu korelowały dodatnio z produkcją śluzu. Kompozycje według wynalazku można zatem zastosować do stymulowania produkcji śluzu. g) Możliwości modyfikowania metabolizmu żółci do poziomów i/lub wzorów jakie obserwuje się u niemowląt karmionych piersią. h) Hamowanie wzrostu jelitowych mikroorganizmów patogennych wzdłuż całej okrężnicy. 20 25 [0050] Kompozycję zawierającą synergistycznie skuteczną ilość GOS i polifruktozy można zatem zastosować albo do utrzymania albo ustalenia (np. u noworodka, dziecka przedwcześnie urodzonego lub dojrzałego lub u niemowląt nie karmionych lub częściowo karmionych piersią lub innych osobników, takich jak dorośli) jednego lub większej liczby efektów fizjologicznych i utrzymania lub poprawy zdrowia osobnika poprzez zapewnienie lub ustanowienie zdrowego środowiska jelita grubego i optymalnej aktywności jelita grubego. [0051] Zwłaszcza częstość występowania, czas trwania i/lub ciężkość chorób, zaburzeń lub objawów, takich jak alergia, egzema, astma wywołana alergią i inne choroby atopowe, można zmniejszyć, znieść lub zapobiegać poprzez podawanie kompozycji według wynalazku. Kompozycje według wynalazku 30 35 40 45 [0052] Kompozycje odpowiednie do zastosowań opisanych powyżej zawierają zarówno polifruktozę jak i GOS w synergistycznie skutecznych ilościach. Kompozycje zawierają GOS/polifruktozę w stosunkach wahających się od 3/97 do 97/3, korzystnie 5/95 do 95/5, bardziej korzystnie 90/10 do 45/55. Objęto tu wszystkie pojedyncze stosunki między tymi punktami końcowymi, tak jak 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 55/45, 60/40, 70/30, 80/20, 85/15, 90/10 itd. [0053] Wymagane dawkowania i stosunek GOS / polifruktoza dla osiągnięcia (optymalnego) efektu synergistycznego mogą się różnić w zależności od typu kompozycji i sposobu i częstości podawania. Jednak kilka przykładów podano poniżej. Znawca może łatwo określić, którego dawkowania każdego składnika wymaga się do osiągnięcia najlepszego efektu fizjologicznego i który stosunek GOS / polifruktoza jest najodpowiedniejszy. Na przykład, jeśli celem jest wzmocnienie całkowitego poziomu SCFA po podaniu doustnym kompozycji zawierającej GOS i polifruktozę, znawca wykona różne kompozycje (zawierające GOS plus polifruktozę, sam GOS, samą polifruktozę) i porówna ich skuteczność w indukowaniu wysokich poziomów SCFA stosując albo testy in vivo albo in vitro znane ze stanu techniki. Rozumie się, że gdy odnosi się do ?dobowej dawki? lub ?dawkowania na dobę?; to dawka ta nie sugeruje, że dawkowanie należy podać osobnikowi w jednym czasie. - 11 - 5 10 15 20 [0054] Synergistycznie skuteczny preparat do początkowego żywienia niemowląt może, na przykład, składać się z kompozycji podstawowej (np. standardowego preparatu do początkowego żywienia niemowląt) zawierającej około 4 g/l, 5 g/l lub więcej mieszaniny GOS i polifruktozy, przy czym stosunki GOS do polifruktozy mogą różnić się, co opisano w innym miejscu (np. 90% GOS : 10% polifruktozy). [0055] Polifruktozą jest inulina. Polifruktozę do zastosowania w kompozycjach można albo ekstrahować ze źródeł naturalnych (rośliny lub bakterie) albo można wykonać poprzez syntezę de novo lub poprzez technologie rekombiowanego DNA, co wiadomo ze stanu techniki. Sposoby ekstrakcji, rozdziału pod względem wielkości i oczyszczania inuliny opisano, na przykład, w De Leenheer (1996), US6569488 i US5968365. Sposoby produkcji rekombinacyjnej opisano na przykład w US6559356. Synteza ogólnie obejmuje zastosowanie cząsteczek sacharozy i enzymów o aktywności transferazy fruktozylowej. Inulina odpowiednia do zastosowania w kompozycjach jest również już dostępna handlowo, np. Raftiline?HP, Orafti. [0056] Inuliny roślinne ogólnie mają znacznie niższy poziom polimeryzacji niż inuliny bakteryjne (do 150 w porównaniu z do 100 000 u bakterii). Źródła roślinne obejmują gatunki dwuliściennych, takie jak Compositae. Przykładami gatunków, które produkują względnie duże ilości inuliny, głównie w swoich korzeniach, cebulkach lub bulwach, są cykoria, szparagi, dalia, słonecznik bulwiasty, czosnek i inne (patrz Kaur i Gupta, J. Biosci. 2002, 27, 703-714). Ponieważ inulina korzystnie nie powinna obejmować oligofruktozy, należy unikać hydrolizy lub przed zastosowaniem należy usunąć obecną oligofruktozę i/lub monolub disacharydy. [0057] Inulina ma PD co najmniej 20, 50, 70, 100, 120, 130, 150, 200, 300, 500 lub. 25 30 35 40 45 50 [0058] GOS można uzyskać z naturalnych źródeł, takich jak rośliny (np. cykoria, soja) lub bakterie lub można wykonać syntetycznie lub poprzez technologię rekombinowanego DNA, jak wiadomo ze stanu techniki. GOS może być ?-galakto-oligosacharydem lub ?-galaktooligosacharydem lub mieszaniną obu. Zwłaszcza reszty galaktozy łączą się przez wiązania ?(1-4) i ?(1-6) glikozydowe (trans GOS lub TOS). GOS odpowiedni do zastosowania w kompozycjach jest również już dostępny handlowo, np. Vivinal?GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Holandia. GOS można uzyskać z laktozy poprzez enzymatyczne traktowanie laktozy ?-galaktozydazą lub poprzez hydrolizę z poliglukanu. W korzystnym przykładzie wykonania stosuje się TOS. W jednym przykładzie wykonania polifruktozą jest inulina HP, tak że kombinacja TOS i inuliny HP jest tu również korzystnym przykładem wykonania. [0059] Innymi zapewnionymi kompozycjami są kompozycje zawierające mleczan w odpowiednich ilościach, w szczególności do zastosowań opisanych powyżej. Odpowiednie ilości mleczanu mogą się różnić i mogą na przykład wahać się od 1 do 30 gramów na dobę. [0060] Kompozycje według wynalazku mogą być albo kompozycjami żywności, kompozycjami suplementów żywności lub kompozycjami farmaceutycznymi. Poza polifruktozą i GOS (i/lub mleczanem) mogą one zawierać dodatkowe składniki. Dla kompozycji żywności lub kompozycji suplementów żywności powinny być one jakości spożywczej i farmaceutycznie dopuszczalne. ?Żywność? dotyczy ciekłych, stałych lub półstałych kompozycji dietetycznych, szczególnie całkowitych kompozycji żywności (zamienniki żywności), które nie wymagają dodatkowego przyjmowania środków odżywczych lub kompozycji suplementów żywności. Kompozycje suplementów żywności nie zastępują całkowicie przyjmowania substancji odżywczych poprzez inne środki. Kompozycje żywności i suplementów żywności, w korzystnym przykładzie wykonania, są żywnością lub suplementami żywności dla dzieci, żywnością lub suplementami żywności dla przedwcześnie urodzonych dzieci, żywnością dla niemowląt, żywnością dla małych dzieci itd., które korzystnie podaje się dojelitowo, korzystnie doustnie kilka razy dziennie. - 12 - 5 10 15 20 25 Kompozycje żywności lub suplementów żywności szczególnie nadają się dla niemowląt nie karmionych lub częściowo karmionych piersią. Również, kompozycje można korzystnie podawać niemowlętom w ich okresie adaptacji do stałej żywności lub niemowlętom przestawianym z karmienia piersią na butelkę. Kompozycja może być również częścią suplementu wzmacniającego mleko ludzkie. [0061] W jednym przykładzie wykonania kompozycją jest preparat do początkowego żywienia niemowląt lub do dalszego żywienia niemowląt, co np. wiadomo ze stanu techniki, szczególnie jak opisano w dyrektywie Komisji Europejskiej 91/321/EEC i jej poprawkach, lecz można ją modyfikować, aby zawierała skuteczną ilość polifruktozy i GOS. Preparat do początkowego żywienia niemowląt lub do dalszego żywienia niemowląt może być na bazie mleka (mleka krowiego, mleka koziego itd.), preparatem do początkowego żywienia niemowląt (IMF) lub sojowym dla niemowląt z nietolerancją laktozy lub może zawierać aminokwasy jako źródło azotu dla niemowląt mających problemy związane z alergią lub wchłanianiem. Handlowo dostępne preparaty do początkowego żywienia niemowląt lub do dalszego żywienia niemowląt zawierają zatem bazę z białka mleka lub białka soi, tłuszcz, witaminy, strawne węglowodany i minerały w zalecanych dziennych ilościach i mogą być kompozycjami w proszku, ciekłymi, koncentratami lub gotowymi do spożycia. [0062] Podawanie modyfikowanego do początkowego żywienia niemowląt lub do dalszego żywienia niemowląt skutkuje rozbudowanym środowiskiem jelitowym, które przypomina to niemowląt karmionych piersią, co można określić poprzez analizy pH kału, kompozycji bakteryjnej, produkcji i profili SCFA, produkcji gazu, itd. Gdy kompozycją jest napój, korzystnie objętość (obejmująca dzienną skuteczną dawkę) spożywana lub podawana dziennie jest w zakresie około 100 do 1500 ml, bardziej korzystnie około 450 do 100 ml na dobę. Gdy preparatem jest substancja stała, korzystnie ilość (obejmująca dzienną skuteczną dawkę) spożywana lub podawana dziennie jest w zakresie około 15 do 220 g/dobę, korzystnie około 70 do 150 25 g/dobę proszku preparatu. [0063] Dzienna skuteczna dawka GOS i polifruktozy jest w zakresie około 1 do 30 g/dobę, korzystnie około 2 do 10 g/dobę dla niemowląt i korzystnie dla dorosłych około 5 do 20 g/dobę. 30 35 40 45 50 [0064] Kompozycje żywności i suplementów żywności według wynalazku mogą dodatkowo obejmować inne składniki aktywne, takie jak witaminy (A, B1, B2, B3, B5, B12, C, D, E, K itd.), probiotyki, (np. bifidibakterie, laktobacilli, itd.), inne prebiotyki, błonnik, laktoferynę, immunoglobuliny, nukleotydy i tym podobne. Składniki odżywcze, takie jak białka, lipidy i inne węglowodany (np. strawne węglowodany, niestrawne węglowodany, rozpuszczalne lub nierozpuszczalne węglowodany), mogą być obecne w różnych ilościach. Typowymi nierozpuszczalnymi niestrawnymi węglowodanami obecnymi w odżywkach dla niemowląt są polisacharydy sojowe, odporna skrobia, celuloza i hemiceluloza. Typowymi rozpuszczalnymi i strawnymi węglowodanami do zastosowania w odżywkach dla niemowląt są na przykład maltodekstryna, laktoza, maltoza, glukoza, fruktoza, sacharoza i inne mono- lub disacharydy lub ich mieszaniny. Kompozycja może również obejmować inne nieaktywne składniki i nośniki, takie jak glukoza, laktoza, sacharoza, mannitol, skrobia, celuloza lub pochodne celulozy, stearynian magnezu, kwas stearynowy, sacharynian sodu, talk, węglan magnezu i tym podobne. Kompozycje mogą obejmować również wodę, elektrolity, wymagane i niewymagane aminokwasy, pierwiastki śladowe, minerały, błonnik, słodziki, środki aromatyzujące, barwniki, emulgatory i stabilizatory (takie jak lecytyna sojowa, kwas cytrynowy, estry mono- lub diglicerydów), środki konserwujące, środki wiążące, środki zapachowe i tym podobne. [0065] Lipidami odpowiednimi dla kompozycji, szczególnie do żywności lub suplementów żywności dla niemowląt, są tłuszczami mleka, lipidami roślinnymi, takimi jak olej rzepakowy, olej z krokosza barwierskiego, olej słonecznikowy, olej z oliwek, oleje ze - 13 - zwierząt morskich itd. lub ich frakcje lub mieszaniny zawierające odpowiednie kwasy tłuszczowe (wielonienasycone i/lub nasycone). 5 10 15 [0066] Białka odpowiednie dla kompozycji, szczególnie do żywności lub suplementów żywności dla niemowląt, obejmują kazeinę, serwatkę, skondensowane mleko odtłuszczone, białko sojowe, wołowiny, kolagenu, kukurydzy i inne białka roślinne lub białka hydrolizowane, wolne aminokwasy itd. Korzystnie białka zawarte w żywności lub suplementach żywności dla niemowląt są w znacznym stopniu hydrolizowane i/lub częściowo hydrolizowane, aby zmniejszyć ryzyko alergii. Kompozycje żywności dla niemowląt według wynalazku korzystnie zawierają wszystkie witaminy i minerały niezbędne w dziennej lub tygodniowej diecie w ilościach istotnych odżywczo, takich jak minimalne zalecane ilości dzienne. [0067] Kompozycję żywności lub suplementu żywności można również w jednym przykładzie wykonania wykonać w oparciu o (tj. rozpoczynając od lub zawierając) bazę żywności. Może być, na przykład, na bazie lub obejmować produkt mleczny, taki jak fermentowany produkt mleczny, w tym, w sposób nieograniczający, mleko, jogurt, napój na bazie jogurtu lub maślanka. Takie kompozycje można otrzymać w sposób znany per se, np. poprzez dodanie skutecznej ilości polifruktozy i GOS lub TOS do odpowiedniej żywności lub bazy żywności. Innymi odpowiednimi bazami żywności mogą być bazy roślinne, bazy mięsne i tym podobne. 20 [0068] Kompozycję żywności lub suplementu żywności według wynalazku można zastosować albo jako leczenie i/lub profilaktycznie. Oznacza to, że można je podawać po zdiagnozowaniu u osobnika problemów lub chorób przewodu pokarmowego lub, alternatywnie, przed wystąpieniem objawów (na przykład u pacjentów wysokiego ryzyka, u których mogą wystąpić problemy przewodu pokarmowego). 25 [0069] W jednym przykładzie wykonania kompozycje podaje się profilaktycznie, aby wspierać rozwój zdrowej mikroflory i/lub zdrowego środowiska jelita grubego. ?Zdrowe środowisko jelita grubego? odnosi się do prawidłowej fizjologii i aktywności jelit, zwłaszcza prawidłowego wchłaniania substancji odżywczych, wody, odporności błony śluzowej na przyczepianie się patogenów, kolonizacji i zakażenia, itp., co można określić na podstawie analizy kału i produkcji gazów. Szczególnie chodzi tu o optymalną fizjologię i aktywność. Każde nieoptymalne funkcjonowanie jelita grubego powoduje opisane tu objawy i można je ustalić na podstawie analizy kału i/lub produkcji gazów. Uwzględniono tutaj choroby lub zaburzenia jelitowe wynikające z nieoptymalnego funkcjonowania. 30 35 40 45 [0070] Kompozycje według wynalazku mogą być w dowolnej postaci dawkowania, takiej jak ciecz, substancja stała, substancja półstała, tabletki, napoje, proszki itd., w zależności od sposobu podawania. Podawanie osobnikowi korzystnie jest doustne, chociaż dla pewnych zastosowań odpowiednie może być karmienie doodbytnicze lub przez rurkę (za pomocą rurki bezpośrednio wchodzącej do żołądka, dwunastnicy lub jelita cienkiego lub jelita grubego). [0071] Kolejnym przykładem wykonania wynalazku jest zapewnienie sposobu do wytwarzania kompozycji według wynalazku poprzez dodanie synergistycznie skutecznej ilości GOS (lub TOS) i polifruktozy do odpowiedniej bazy kompozycji, jak opisano powyżej. [0072] Poniższe nieograniczające Przykłady opisują synergistyczny efekt GOS i polifruktozy. O ile nie stwierdzono inaczej, praktyka wynalazku stosuje standardowe konwencjonalne sposoby biologii molekularnej, farmakologii, immunologii, wirusologii, mikrobiologii lub biochemii. Takie techniki opisano w Sambrook i Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wydanie Trzecie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, w Tomach 1 i 2 Ausubel i wsp. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current - 14 - Protocols, USA i Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., wyd. 17. (1985), Microbiology: A Laboratory Manual (Wydanie 6.) od James Cappuccino, Laboratory Methods in Food Microbiology (wydanie 3) od W. Harrigan (Autor) Academic Press, wszystkie włączone tu przez odniesienie. 5 Objaśnienia do Figur [0073] Figura 1 10 Tworzenie octanu, propionianu i maślanu po 48 h fermentacji in vitro TOS, Inuliny, mieszaniny TOS / Inulina 9/1 i mieszaniny oligofruktozy i inuliny 1/1 przez świeży kał uzyskany od dzieci. Figura 2 15 Względne ilości octanu, propionianu i maślanu, ze świeżego kału uzyskanego od dzieci, utworzone po 48 h fermentacji in vitro TOS, Inuliny, mieszaniny TOS/Iinulina 9/1 i mieszaniny oligofruktozy i inuliny 1/1. Sumę utworzonego octanu plus propionianu plus maślanu ustanowiono jako 100% dla każdego badanego błonnika. Figura 3 20 Tworzenie gazu, ze świeżego kału uzyskanego od dzieci, po 48 h fermentacji in vitro TOS, Inuliny, mieszaniny TOS/Inulina 9/1 i mieszaniny oligofruktozy i inuliny 1/1. Ilość utworzonego gazu (ml względem ilości całkowitych utworzonych SCFA (w mmol na g błonnika) Figura 4 Efekty mieszanin SCFA (octan/propionian/maślan w stosunku wynoszącym 90/5/5 molowo) i L-mleczanu. Figura 4A: Wpływ 0, 0,1, 0,5, 1 i 4 mM mieszaniny SCFA lub L-mleczanu na ekspresję muc-2 w ko-hodowli CCD18/T84 (n=6). Słupki błędu pokazują SEM. Wzrost przy 1 i 4 mM mieszaniny SCFA i 0,5, 1 i 4 mM L-mleczanu jest istotny statystycznie. 25 Figura 4B: Wpływ 0, 50, 100, 250 i 500 ?M mieszaniny SCFA lub Lmleczanu na spontaniczną odpowiedź PGE1 i PGE2 w komórkach CCD18 (n=7). Słupki błędu pokazują SEM. Wzrost PGE1 przy 100, 250 i 500 ?M mieszaniny SCFA i 100 ?M L-mleczanu jest istotny statystycznie. Wzrost PGE2 przy 100, 250 i 500 ?M mieszaniny SCFA i 250 ?M L-mleczanu jest istotny statystycznie (P<0,05). 30 35 Figura 5 Wpływ octanu sodu i L-mleczanu sodu na spontaniczne skurcze w dystalnej i proksymalnej części okrężnicy. Próba ślepa (ustawiona na napięcie wynoszące 1 g) wynosi 0%. Napięcie po dodaniu 40 mM KCl ustawiono na 100%. Przykłady 40 Przykład 1 Badania fermentacji in vitro pokazują synergistyczny wpływ na wzory fermentacji 1.1 Materiały i sposoby Mikroorganizmy - 15 - [0074] Mikroorganizmy uzyskano ze świeżego kału dzieci karmionych butelką. Świeży materiał kałowy od dzieci w zakresie 1 do 4 miesiąca życia zebrano razem i włożono do podłoża konserwującego na 2 h. Kompozycje/Substrat 5 [0075] Jako substrat zastosowano albo prebiotyki (TOS; mieszaninę TOS (od VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, Holandia) i inuliny (raftilinHP od Orafti, Belgia) w stosunku 9/1 (w/w); inulinę; mieszaninę oligofruktozy i inuliny w stosunku 1/1 (w/w) albo nie zastosowano żadnego (próba ślepa). Podłoża 10 [0076] Podłoże McBain & MacFarlane: Buforowana woda peptonowa 3,0 g/l, ekstrakt drożdżowy 2,5 g/l, mucyna (rąbek szczoteczkowy) 0,8 g/l, trypton 3,0 g/l, L-cysteina-HCl 0,4 g/l, sole żółciowe 0,05 g/l, K2HPO4?3H2O 2,6 g/l, NaHCO3 0,2 g/l, NaCl 4,5 g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/l, CaCl2 0,228 g/l, FeSO4?7H2O 0,005 g/l. 500 ml butelki Scott napełniono podłożem i sterylizowano przez 15 minut w 121°C. 15 [0077] Podłoże buforowane: K2HPO4?3H2O 2,6 g/l, NaHCO3 0,2 g/l, NaCl 4,5 g/l, MgSO4?7H2O, 0,5 g/l, CaCl2 0,228 g/l, FeSO4?7H2O 0,005 g/l. pH doprowadzono do 6,3 ? 0,1 za pomocą K2HPO4 lub NaHCO3. 500 ml butelki Scott napełniono podłożem i sterylizowano przez 15 minut w 121°C. 20 [0078] Podłoże konserwujące: Buforowany pepton 20,0 g/l L-cysteina-HCl 0,5 g/l, tioglikolan sodu 0,5 g/l, 1 tabletka resazuryny na litr. pH doprowadzono do 6,7 ? 0,1 za pomocą 1 M NaOH lub HCl. Pożywkę zagotowano w mikrofalówce. 30 ml butelki do surowicy napełniono 25 ml pożywki i sterylizowano przez 15 minut w 121°C. [0079] Świeży kał zmieszano z podłożem konserwującym. Świeży kał można zakonserwować w tej postaci przez kilka godzin w 4°C. 25 [0080] Zawiesina kałowa: Zakonserwowany roztwór kału wirowano przy 13 000 rpm przez 15 minut. Supernatant usunięto i kał zmieszano z podłożem McBain & Mac Farlane w stosunku wagowym wynoszącym 1:5. Fermentacja 30 35 [0081] 3,0 ml zawiesiny kałowej połączono w butelce z 85 mg glukozy lub prebiotyku lub bez dodatku (próba ślepa) i dokładnie mieszano. W t=0 pobrano próbkę (0,5 ml). 2,5 ml otrzymanej zawiesiny wprowadzono do rurki dializacyjnej w 60 ml butelce wypełnionej 60 ml buforowanej pożywki. Butelkę dobrze zamknięto i inkubowano w 37°C. Próbki pobierano z rurki dializacyjnej (0,2 ml) lub z bufory dializacyjnego (1,0 ml) za pomocą strzykawki do iniekcji podskórnych po 3, 24 i 48 godzinach i natychmiast umieszczano na lodzie, aby zatrzymać fermentację. Oznaczenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i mleczanu [0082] Patrz Przykład 2: Wartości korygowano względem próby ślepej. Oznaczenie gazu 40 45 [0083] W t=3, t=24 i t=48 zmierzono ciśnienie gazu w przestrzeni szyjki 60 ml butelki za pomocą miernika ciśnienia gazu (Druckmessumformer, Econtronic, Niemcy) poprzez wkłucie 6 ml strzykawki do iniekcji podskórnych przez gumowy korek butelki i wyciągnięcie gazu z przestrzeni szyjki za pomocą tej strzykawki dopóki ciśnienie gazu nie wynosiło 0 barów. Objętość w strzykawce oznaczało objętość utworzonego gazu. Wartości korygowano względem próby ślepej. 1.2 Wyniki - 16 - [0084] Fermentację in vitro przeprowadzono stosując następujące próbki: 1.) 85 mg TOS (od VivinalGOS, Borculo Domo Ingredients, Holandia) 2.) 85 mg inuliny (RaftilinHP, od Orafti, Belgia) 3.) 85 mg TOS/inulina o stosunku TOS/inulina wynoszącym 9/1 (w/w) i 5 4.) 85 mg OF (raftiloseP95, od Orafti, Belgia)/inulina (raftilinHP) w stosunku OF/inulina wynoszącym 1/1 (w/w). Całkowita ilość produkowanego SCFA 10 [0085] Wyniki przedstawiono na Figurze 1. Figura 1 pokazuje, że mieszanina TOS/inulina skutkuje istotnie większą ilością SCFA na g błonnika niż pojedyncze składniki, lecz także większą niż mieszanina oligofruktozy (OF) i inuliny. Badano również 85 mg TOS/inulina w stosunku wynoszącym 1/1 (nieprzedstawione dane), co również zapewnia efekt synergistyczny. Produkcja L- i D-mleczanu 15 [0086] L- i D-mleczan można było oznaczyć tylko w t=3. Tabela 1 przedstawia metaboliczne produkty końcowe utworzone w tym punkcie czasowym. Tabela 1 - metaboliczne produkty końcowe (mmol/g błonnika) utworzone po 3 godzinach fermentacji in vitro Octan Propionian Maślan L-mleczan D-mleczan 20 TOS 0,23 0 0 0,14 0,03 Inulina 0 0 0 0,00 0,00 TOS/Inulina 0,40 0 0 0,17 0,04 OF/Inulina 0 0 0,04 0,02 0,30 [0087] Ponownie synergistycznie wyższe tworzenie mleczanu obserwuje się dla mieszaniny TOS/inulina w porównaniu z pojedynczymi składnikami TOS i Inuliną. W porównaniu z mieszaniną z OF i Inuliną procent mleczanu (w oparciu o wszystkie kwasy) i stosunek L/D-mleczanu jest wyższy niż w mieszaninie TOS/Inulina. Względne ilości SCFA 25 [0088] Figura 2 przedstawia wzór produktów fermentacji po 48 h. Mieszanina TOS/inulina pokazuje istotnie wyższy procent octanu niż pojedyncze składniki, co jest również wyższe niż dla mieszaniny oligofruktozy (OF) i inuliny. Kał dzieci karmionych piersią wykazuje wysoki procent octanu, tak że mieszanina TOS/inulina skutkuje wzorem produktów fermentacji, który najbardziej przypomina ten dzieci karmionych piersią. Tworzenie gazu 30 [0089] Wyniki przedstawiono na Figurze 3. Pod względem tworzenia gazu, TOS i mieszanina TOS/Inulina tworzą najniższą ilość gazu na mmol utworzonych SCFA. Inulina i mieszanina OF/inulina wykazują znacznie większą ilość tworzonego gazu. Na mmol utworzonych SCFA, ilość gazu jest najniższa w mieszaninie TOS/inulina. Kinetyka tworzenia SCFA 35 [0090] Tabela 2 przedstawia kinetykę tworzenia SCFA. Kombinacja TOS/inulina nadal przedstawia wysokie tworzenie SCFA między 24 i 48 h, wskazując, że w dystalnej części okrężnicy nadal tworzą się SCFA i mają korzystny wpływ na przepuszczalność okrężnicy, tworzenie śluzu i efekty przeciw-patogenne itd. Również w pierwszych 3 h tworzy się najwyższa ilość SCFA, jak w przypadku oligosacharydów ludzkiego mleka (dane - 17 - nieprzedstawione). Szybka fermentacja na początku okrężnicy jest ważna ze względu na efekty przeciwpatogenne. Tabela 2: kinetyka tworzenia SCFA (mmol) SCFA (korygowana próba ślepa) Interwał czasowy (godziny) Prebiotyki 0-3 h 3-24 h 24-48 h TOS 0,23 3,85 0,13 TOS/inulina HP 0,40 4,49 0,24 Inulina HP 0,00 3,05 0,05 OF/Inulina HP 0,11 4,26 0,00 OF = oligofruktoza Przykład 2 5 Badania kliniczne TOS/Inuliny: Względny wzrost octanu i względny spadek maślanu 5 nie korelują ze zwiększeniem liczby bifidobakterii. TOS i Inulina mają efekt synergistyczny. 2.1 Materiały i sposoby 10 15 20 25 30 [0091] 63 ciężarne kobiety, które zdecydowały się na karmienie piersią i 57, które zdecydowały się nie karmić, rekrutowano podczas ich ostatniego trymestru ciąży. Niemowlęta o prawidłowej masie urodzeniowej, bez wrodzonych nieprawidłowości, chorób wrodzonych lub choroby przewodu pokarmowego włączono w ciągu 3 dni po porodzie. Badanie zatwierdziła komisja etyczna w Medical Center, St. Radboud, Nijmegen, Holandia. Pisemne świadome zgody uzyskano od rodziców przed włączeniem do badania. [0092] Niemowlęta matek, które zdecydowały się nie karmić piersią, losowo i w sposób podwójnie zaślepiony przydzielono do jednej z dwóch grup preparatu (OSF, SF). Grupa standardowego preparatu (SF; n=19) otrzymywała regularne niesuplementowany preparat do początkowego żywienia niemowląt (Nutrilon I, Nutricia, Holandia). Główne dane kompozycji standardowego preparatu w standardowym rozcieńczeniu wynoszącym 131 g/l podano w Tabeli 3. Grupa preparatu prebiotycznego (OSF; n=19) otrzymywała ten sam standardowy preparat do początkowego żywienia niemowląt suplementowany mieszaniną 6 g/l transgalakto-oligosacharydów (TOS; Vivinal GOS, Borculo Domo Ingredients, Zwolle, Holandia) i inuliny (PF; RaftilineHP, składnik aktywny żywności Orafti, Tienen, Belgia). Mieszanina zawierała 90% TOA i 10% inuliny (polifruktozy). Badane preparaty podawano do woli podczas okresu badania. Matki, które zdecydowały się karmić piersią, stymulowano do kontynuowania karmienia piersią podczas przebiegu badania i w razie potrzeby wspierał je konsultant laktacyjny. Na zakończenie karmienia piersią ich niemowlęta otrzymywały jeden z dwóch preparatów. Przestrzeganie zaleceń oceniano poprzez zliczanie liczy niewykorzystanych puszek preparatów podczas każdej wizyty i porównywanie ilości spożytego preparatu z zapisywanym przyjmowaniem żywności. Tabela 3: Kompozycja standardowego preparatu na litr Energia kcal 670 Białko g Stosunek kazeina/serwatka 14 40/60 Tłuszcz g 35 Wszystkie węglowodany g 75 Laktoza g 75 - 18 - Energia kcal 670 Minerały Wapń mg 540 Fosfor mg 270 Magnez mg 50 Sód mg 190 Potas mg 680 Chlorek mg 430 Żelazo mg 5 Cynk mg 5 Kwestionariusze 5 [0093] Dane demograficzne, kliniczne i antropometryczne matki zebrano przed porodem. Informacje dotyczące porodu uzyskano od matek 5 dnia po porodzie. Informacje o przyjmowaniu żywności, tolerancji na preparat, cechach stolca, zdrowiu i danych antropometrycznych niemowląt uzyskano z kwestionariuszy po narodzinach dnia 5, 10, 28 i 10 potem raz na 4 tygodnie aż do zakończenia badania. Próbki kału 10 [0094] Poproszono rodziców o pobieranie próbek kału od ich niemowląt, 5, 10, 28 dnia i potem raz na 4 tygodnie po porodzie. Próbki pobierano z pieluchy tak szybko jak to możliwe po defekacji, zbierano do pojemników na kał (Greiner Labortechnik, Holandia) i rodzice przechowywali natychmiast w -20°C, a badacze transportowali w przenośnej zamrażarce do laboratorium. Otrzymywania próbek kału: 15 20 [0095] Dla oznaczenia SCFA, 1 gram próbek rozmrożono w lodowatej wodzie, rozcieńczono 10x w MilliQ i homogenizowano przez 10 minut stosując stomacher (IUL Instruments, Barcelona, Hiszpania). 350 ?l homogenizowanego kału zmieszano z 200 ?l 5% (v/v) kwasu mrówkowego, 100 ?l 1,25 g/l kwasu 2-etylomasłowego (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Holandia) i 350 ?l MilliQ. Próbki wirowano przez 5 minut przy 14 000 rpm, aby usunąć duże cząstki i supernatant przechowywano w -20°C. Do analizy FISH i pomiarów kwasu mlekowego, próbki rozmrożono w lodowatej wodzie, rozcieńczono 10x (w/v) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, pH 7,4 (PBS) i homogenizowano przez 10 minut stosując stomacher. Homogenizowany kał przechowywano w -20°C. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ 25 30 35 [0096] Analizę FISH przeprowadzono jak opisano (Langendijk i wsp., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:3069-3075.) z pewnymi delikatnymi modyfikacjami. Próbki utrwalone paraformaldehydem naniesiono na pokryte żelatyną szkiełka mikroskopowe (powlekane PTFE 8-dołkowe szkiełka podstawowe, CBN labsuppliers, Drachten, Holandia) i suszono na powietrzu. Suche próbki odwadniano w 96% etanolu przez 10 minut. Bufor do hybrydyzacji (20 mm Tris-HCl, 0,9 M NaCl, 0,1% SDS [pH 7,1[) z 10 ng/l specyficznej względem Bifidobacterium sondy znakowanej Cy3 Bif164mod (5'-CAT CCG GYA TTA CCA CCC) wstępnie ogrzano i dodano do suchych próbek. Bif 164 mod jest modyfikowaną wersją sondy S-G-Bif-a-0164-a-A-18 ((Langendijk i wsp., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61:3069-3075.). Szkiełka inkubowano przez noc w ciemnej wilgotnej komorze w 50°C. Po hybrydyzacji szkiełka płukano przez 30 minut w 50 ml wstępnie ogrzanego buforu (20 mM Tris-HCl, 0,9 M NaCl [pH 7,2]) i dokładnie spłukano w MilliQ. Dla barwienia wszystkich - 19 - 5 10 bakterii, próbki inkubowano z 0,25 ng/l 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po barwieniu DAPI szkiełka dokładnie spłukano w MilliQ, suszono i umocowano za pomocą Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) i przykryto szkiełkiem nakrywkowym Szkiełka automatycznie analizowano stosując mikroskop epifluorescencyjny Olympus AX70 z oprogramowaniem do automatycznej analizy obrazu (Analysis 3.2, Soft Imaging Systems GmbH, Münster, Niemcy). Procent bifidobakterii na próbkę oznaczono poprzez analizowanie 25 losowo wybranych pozycji mikroskopowych. W każdej pozycji procent bifidobakterii oznaczano przez zliczanie wszystkich komórek za pomocą zestawu filtrów DAPI SP 100, Chroma Technology Corp., Brattleboro, USA) i zliczanie wszystkich bifidobakterii stosując zestaw filtrów Cy3 (41007, Chroma Technology, Brattleboro, USA). Analiza krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych 15 20 [0097] Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SFCA) kwasy octowy, propionowy, nmasłowy, izo-masłowy i n-walerianowy oznaczano ilościowo poprzez chromatografię gazową (GC) Varian 3800 (Varian Inc., Walnut Creek, USA) wyposażoną w detektor płomieniowo-jonizacyjny. 0,5 ?l próbki wstrzyknięto w 80°C na kolumnę (Stabilwax, 15 x 0,53 mm, grubość filmu 1,00 ?m, Restek Co., USA) stosując hel jako gaz nośny (3,0 psi). Po wstrzyknięciu próbki piec nagrzano do 160°C z szybkością wynoszącą 16°C/min, po czym następuje grzanie do 220°C z szybkością wynoszącą 20°C/min i ostatecznie utrzymanie temperatury na 220°C przez 1,5 minuty. Temperatura iniektora i detektora wynosiła 200°C. Jako wewnętrzny standard zastosowano kwas 2-etylomasłowy. Analiza mleczanu 25 [0098] Homogenizowany kał rozmrożono na lodzie i wirowano przez 5 minut przy 14 000 rpm. 100 ?l supernatantu ogrzewano przez 10 minut w 100°C, aby inaktywować wszystkie enzymy. Mleczan oznaczano enzymatycznie stosując zestaw do wykrywania kwasu Lmlekowego za pomocą dehydrogenazy D- i L-mleczanowej (Boehringer Mannheim, 15 Mannheim, Niemcy). Mleczan oznaczono tylko w tych próbkach kału, które były wystarczająco duże. Analiza pH 30 [0099] Po przechowywaniu w -20°C próbki kału rozmrożono i pH zmierzono bezpośrednio w kale w temperaturze pokojowej stosując pH-metr Handylab (Scott Glas, Mainz, Niemcy) wyposażony w elektrodę pH Inlab 423 (Mettler-Toledo, Columbo, USA). Analiza danych 35 40 45 [0100] Przed badaniem, obliczenia wykazały, że aby wykryć różnicę w procentach bifidobakterii między grupą preparatu interwencyjnego i grupą preparatu standardowego wynoszącą 30% z SD wynoszącym 25%, powinno się włączyć 13 niemowląt na grupę. Ze względu na spodziewane wycofanie wynoszące 30% w grupach preparatu, do badania włączono więcej niemowląt niż obliczono. Pakiet statystyczny SPSS (wersja 11/0) zastosowano do analizy statystycznej wyników. Wszystkie wartości sprawdzono pod względem normalności poprzez sprawdzenie wzrokowe normalnych wykresów prawdopodobieństwa. Różnice w procencie bifidobakterii, pH, względnych ilościach SFCA i mleczanu między grupami zbadano pod względem istotności stosując analizę wariancji. W przypadku istotnej różnicy (p<0,05), grupy porównano poprzez zastosowanie testu post hoc Bonferroniego. Ponieważ nie jest możliwe, aby podwójnie zaślepić przypisanie do karmienia piersią i butelką i zapewnić odpowiednią randomizację, nie przeprowadzono analizy statystycznej, aby porównać grupy karmione piersią z którąkolwiek z grup karmionych preparatem. Dane z grupy karmionej piersią podano tylko, gdy niemowlę karmiono tylko mlekiem kobiecym w danym punkcie czasowym. - 20 - 2.2 Wyniki 5 10 [0101] Łącznie włączono 120 niemowląt na grupę. 57 niemowląt rozpoczęło karmienie preparatem bezpośrednio po narodzinach i równomiernie podzielono je między grupy preparatu. Z 63 niemowląt, które karmiono mlekiem kobiecym bezpośrednio po narodzinach, 24 przestawiono na karmienie preparatem przed wiekiem 16 tygodni i 5 niemowląt wycofano. Cechy badanych osobników przedstawiono w Tabeli 4. W grupach preparatu, 9 niemowląt wycofano z badania w ciągu pierwszych 16 tygodni po narodzinach (4 w grupie SF, 5 w OSF). Powody wycofania obejmowały: kolkę, podejrzenie alergii na mleko krowie, zaparcia i problemy praktyczne. Tabela 4 - Cechy badanych osobników Płeć Miejsce urodzenia Tryb porodu Standardowy preparat, SF N=19 Mleko Prebiotyczny preparat, OSF kobiece, N=19 BF N=63 Męska 5 12 33 Żeńska 14 7 30 W domu 7 8 40 W szpitalu 12 11 23 Pochwowy 14 16 59 Cesarski 5 3 4 3600?501 3318?602 3651?601 Waga urodzeniowa Bifidobakterie kałowe 15 20 [0102] Procent bifidobakterii w kale w wieku 5 dni, 10 dni, 4, 8, 12 i 16 tygodni grup karmienia przedstawiono w Tabeli 5 i ilości w Tabeli 5. Grupa OSF ma tendencję do wyższego % bifidobakterii niż grupa SF z całkowitego zliczenia bakteryjnego w każdym wieku, lecz różnice nie były statystycznie różne. Nieoczekiwanie, procent Bifidobacteria u dzieci karmionych piersią był również względnie niski i był zgodny z grupami karmionymi preparatem. [0103] Wstępne dane również pokazują wzrost Lactobacilli w grupie BF i OSF, lecz ilości Lactobacilli we florze kałowej były co najmniej jeden rząd wielkości niższe niż Bifidobacteria, ogólny wzór niewiele się zmienia. Wyniki pH 25 [0104] Wartości pH zmierzone w kale niemowląt karmionych preparatem przedstawiono w Tabeli 6. Najniższe pH stwierdzono u niemowląt karmionych mlekiem kobiecym. Kałowe pH kału niemowląt karmionych preparatem OSF było niższe niż grupy SF (p <0,045 w każdym wieku poza dniem 5). Wyniki SCFA [0105] Całkowitą ilość SCFA w kale przedstawiono w Tabeli 5 poniżej. 30 [0106] Procent różnych SCFA z całkowitego SCFA przedstawiono w Tabeli 6. Nie ma statystycznie istotnych różnic stwierdzanych w stężeniu całkowitych SCFA między grupami preparatu. Również ilość SCFA jest porównywalna do tych z innych grup karmienia. Jednak, już po 10 dniach, różnice w profilach SCFA można zauważyć między niemowlętami karmionymi OSF lub mlekiem kobiecym w porównaniu z niemowlętami karmionymi standardowym preparatem. Niemowlęta karmione preparatem zawierającym GOS i - 21 - polifruktozę i karmione mlekiem kobiecym mają wyższe procenty octanu i niższe procenty propionianu, maślanu, iC4-6 SCFA w porównaniu z niemowlętami karmionymi standardowym preparatem. Wyniki mleczanu 5 10 [0107] Stężenia mleczanu (mmol/kg kału) wszystkich grup przedstawiono w Tabeli 5. Już od 5 dnia życia preparat OS (nieistotna) i grupy mleka kobiecego mają wyższe ilości mleczanu w porównaniu z grupą standardowego preparatu. Względna ilość mleczanu (jako procent sumy SCFA i mleczanu) jest wyższa u dzieci karmionych piersią i niższa u dzieci karmionych standardowym preparatem. Dzieci karmione preparatem zawierającym TOS/inulinę mają pośrednie względne ilości octanu. Procent mleczanu u dzieci karmionych OSF w 16 tygodniu (względem wszystkich kwasów) istotnie różni się od tego u dzieci SF. Tabela 5 - Stężenie mleczanu i całkowitych SCFA (mmol/kg kału) i Bifidobacteria (*1,1013/kg kału) pH między urodzeniem i a wiekiem 16 tygodni. Średnia ? SEM. Poza pH, nie stwierdzono żadnych statystycznych różnic. 5 dni 10 dni 4 tygodni 8 tygodni 12 tygodni 16 tygodni 15 Mleczan SCFA pH Bifidobacteria SF 13,5?7,7 54,7?12,6 5,93?0,15 0,58?0,49 OSF 10,7?4,3 56,5?7,7 5,49?0,15 1,20?2,24 BF 13,3?2,8 48,7?4,4 5,27?0,07 0,47?0,39 SF 4,6?3,0 62,0?7,9 6,88?0,15 0,96?0,83 OSF 9,7?3,6 62,3+7,2 5,95?0,20 1,10?0,99 BF 15,1?3,2 54,7?4,9 5,35?0,07 0,48?0,61 SF 2,6?1,4 68,3?10,3 6,77?0,21 0,97?0,96 OSF 9,9?3,4 83,1?8,8 5,88+0,18* 1,20?0,55 BF 22,8?4,4 59,8?4,8 5,45?0,12 0,56?0,64 SF 7,6?6,8 76,5?13,2 6,80+0,20 0,89?0,56 OSF 24,4?5,3 76,0+8,4 5,68?0,18* 1,00?0,52 BF 30,9?5,3 62,8?5,4 5,27?0,15 0,58?0,59 SF 14,1?9,4 73,9?11,9 6,88?0,20 0,91?0,80 OSF 18,4?7,0 76,1?12,1 5,60+0,18* 1,30?0,99 BF 42,1?7,1 60,4?4,9 5,29?0,17 1,40+1,38 SF 1,7?1,2 68,6?14,0 7,09?0,15 1,00?0,80 OSF 18,5?5,7 67,7?11,7 5,60?0,20* 1,30?0,76 BF 45,1?9,0 59,2?6,9 5,68?0,24 0,89?0,78 Tabela 6 - względne ilości SCFA (% całkowitych SCFA), mleczanu (% całkowitych kwasów), % Bifidobacteria między urodzeniem a wiekiem 16 tygodni. Dzień/ tydzień 5 d. Octan Propionian Maślan Suma iC4-C5 % Bifidobacteria Mleczan 84,3?3,4 12,9?3,2 1,7?0,5 1,1?0,4 45?3,6 13,8?18,5 OSF 85,8+5,1 12,0?4,7 0,5?0,5 1,7?0,7 50?8,6 8,7?13,3 SF - 22 - 10 d. BF 89,5?1,8 7,0?1,5 1,6?0,4 2,0?0,4 54?4,1 12,5?14,0 SF 70,9?2,0 21,3?2,6 4,6?1,1 3,2?0,5 65?6,0 4,3?10,8 1,4?0,4* 1,1?0,4 61?6,3 8,2?9,8 OSF 84?2,4* 4 tydz. 8 tyg. 12 tyg. 16 tyg. 13,5?2,3 BF 89,3?1,9 5,8?1,3 2,3?0,3 2,6?0,4 42?4,1 13,4?13,8 SF 71,8?2,8 17,8?3,3 5,0?1,1 5,5?2,6 52?5,4 6,9?16,4 OSF 77,7?2,2 15,4?2,0 5,8?2,2 1,1?0,3 71?4,5 8,4?10,7 BF 91,0?1,8 4,3?1,2 2,6?0,6 2,1?0,4 47?5,4 19,6?17,0 SF 74,6?2,9 16,4?2,0 6,1?1,2 2,9?0,7 50?6,3 3,5?9,9 OSF 83,5?2,7 11,4?2,1 3,7?1,2 1,4?0,4 64?4,1 17,7?15,2 BF 91,2?1,6 5,4?1,4 1,9?0,5 1,6?0,3 41?4,5 21,7?13,4 SF 73,9?2,9 17,8?3,3 5,0?1,1 3,2?0,5 56?5,4 5,4?11,9 OSF 86,5?2,1 11,2?1,8 1,2?0,3* 1,0?0,4 60?5,0 13,6?13,2 BF 86,1?3,3 7,5?2,2 3,0?0,7 3,5?0,8 59?4,5 30,2?16,3 SF 69,9?3,9 19,6?2,7 5,6?0,9 4,9?0,8 52?6,3 0,6?0,9 OSF 82,2?5,3 14,3?4,9 2,1?0,5* 1,5?0,4* 69?7,7 BF 1,6?0,4 89,7?2,7 6,4?2,1 2,2?0,5 47?6,3 16,4?12,0* 35,6?20,4 P<0,05 w porównaniu z SF; SF = karmione standardowym preparatem, OSF = SF suplementowany GOS+inuliną; BF = karmione piersią. [0108] Powyższe pokazuje, że w kale niemowląt karmionych tą kombinacją GOS i polifruktozy pH jest obniżone, że tworzy się więcej mleczanu i że tworzy się wzór kwasów (octan i mleczan), który jest bardziej podobny do tego dzieci karmionych piersią i że efektu tego nie można przypisać ilościowemu wzrostowi Bifidobacteria. 5 Przykład 3 - Korzystny wpływ mieszaniny mleczanu i SCFA na Muc-2. Ekspresja PGE1 i PGE2. 3.1 Materiały i Sposoby 10 [0109] Wpływ mieszaniny mleczanu i SCFA analizowano jak opisano w Willemsen, LEM, Koetsier MA, van Deventer SJH, van Tol EAF (2003), Gut 52:1442-1447, z następującymi modyfikacjami: Badano mleczan i mieszaninę octan/propionian/maślan 90/5/5. Dla doświadczeń produkcji śluzu zastosowano ko-hodowlę komórek CCD18 i T84, natomiast dla doświadczeń produkcji PGE1 i PGE2 zastosowano monohodowlę komórek CCD18. 3.2 Wyniki 15 [0110] SCFA, w mieszaninie 90/5/5 (octan/propionian/maślan) i L-mleczan w sposób zależny od dawki indukuje ekspresję MUC-2 w ko-hodowli komórek CCD18 i T84, co można zobaczyć na Figurze 4A. Również stężenie PGE1 i PGE2 rośnie w komórkach CCD18, co można zobaczyć na Figurze 4B. W wyższych stężeniach dodawanych kwasów organicznych wzrosty osiągają istotność statystyczną. Przykład 4: Wpływ mleczanu na skurcze okrężnicy 20 4.1 Materiały i Sposoby [0111] Samce szczurów Wistar (CKP/Harlan, Wageningen/Horst, Holandia) hodowano w warunkach kontrolowanej temperatury i cyklu światła i zapewniono im wolny dostęp do granulek żywności i wody. Zwierzęta znieczulono za pomocą mieszaniny N2O, O2 i - 23 - izofluranu, otwarto brzuch i natychmiast usunięto okrężnicę. Tkankę umieszczono w buforze Krebs-Henseleit pH 7,4 (kompozycja w mM: 118,0 NaCl, 4,75 KCl, 1,18 MgSO4, 2,5 CaCl2, 10 glukozy, 1,17 KH2PO4 i 24,9 NaHCO3). 5 10 15 20 25 [0112] Okrężnicę przecięto na część dystalną i proksymalną i przepłukano buforem KrebsHenseleit delikatnie wyciskając zawartość kałową. Aby przybliżyć warunki in vivo tak bardzo jak to możliwe, 1 cm zupełnie nienaruszonych segmentów przyłączono wzdłuż do izometrycznego przetwornika siły (F30 typ 372, HSE, Niemcy) w 20 ml łaźni narządowej z płaszczem wodnym (37°C) (Schuler, HSE, Niemcy) zawierającym bufor Krebs-Henseleit z gazem wprowadzanym w sposób ciągły za pomocą 95% O2-5% CO2. Segmenty stopniowo rozciągano do napięcia spoczynkowego wynoszącego 1 g i pozostawiono do osiągnięcia równowagi przez 45 minut z przerywanym przemywaniem. Napięcia segmentów w spoczynku i w odpowiedzi na różne bodźce amplifikowano za pomocą modułu amplifikującego przetwornika (HSE, Niemcy) i rejestrowano na rejestratorze typu multi-pen (Rikadenki, HSE, Niemcy). [0113] Segmenty inkubowano z 40 mM KCl przez 5 minut i zmierzono odpowiedzi skurczowe. KCl wymyto za pomocą trzech kolejnych płukań w 5 minutowych odstępach. Segmenty inkubowano następnie z wzrastającymi stężeniami do 100 mM octanu lub Lmleczanu sodu. Roztwory kwasowe otrzymano na świeżo w wodzie destylowanej. NaOH dodano do octanu, aby uzyskać neutralne pH. Na zakończenie inkubacji z kwasem tłuszczowym, dodano 40 mM KCl, aby określić, czy na odpowiedź skurczową na KCl wpływa kwas tłuszczowy. Przed nową inkubacją segmenty pozostawiono do zrównoważenia przez 45 minut w świeżym buforze Krebs-Henseleit z przerywanym przemywaniem. [0114] Protokół doświadczalny składa się z dwóch proksymalnych i dwóch dystalnych odcinków okrężnicy. Dla analizy danych (n=3) poziom skurczów indukowany przez bodziec zdefiniowano jako napięcie w g po 5 minutach inkubacji. Dane uzyskane z identycznych segmentów (proksymalnego lub dystalnego) zastosowano do obliczenia średniej wartości i każdy segment służył jako swoja własna próbka kontrolna. 4.2 Wyniki 30 35 [0115] Co można zauważyć na Figurze 5, octan sodu, a szczególnie L-mleczan sodu zmniejszają napięcie skurczów tonicznych. Efekty rozluźnienia są wyższe w dystalnej części okrężnicy niż w proksymalnej części okrężnicy. [0116] Również liczba spontanicznych skurczów, skurcze fazowe zmniejszają się w proksymalnej części okrężnicy po dodaniu octanu sodu i L-mleczanu sodu, natomiast nie zaobserwowano żadnych efektów w dystalnej części okrężnicy. [0117] W proksymalnej części okrężnicy skurcze toniczne, jako odpowiedź na KCl, jednak, są porównywalne w obecności lub przy braku 25 mM octanu sodu lub L-mleczanu sodu. W wyższych stężeniach obserwuje się istotne rozluźnienie nawet po dodaniu KCl. Zastrzeżenia patentowe 40 1. Kompozycja do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu alergii, egzemy lub chorób atopowych zawierająca galakto-oligosacharydy i polifruktozę, przy czym polifruktoza jest inuliną o średnim stopniu polimeryzacji powyżej 20, kompozycja jest kompozycją żywności, która zawiera białko, lipidy i węglowodany inne niż galakto-oligosacharydy i polifruktoza i przy czym białko jest częściowo lub w znacznym stopniu zhydrolizowane. - 24 - 2. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 1, w której ilość galakto-oligosacharydów : inuliny ma stosunek 5:95 do 95:5, korzystnie 90:10 do 45:55. 3. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 1 albo 2, przy czym galakto-oligosacharyd jest transgalakto-oligosacharydem. 5 4. Kompozycja do zastosowania według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, przy czym kompozycja jest odżywką dla niemowląt. 5. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 4, przy czym kompozycja jest preparatem do początkowego żywienia niemowląt lub preparatem do dalszego żywienia niemowląt. 10 6. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 5, przy czym kompozycja zawiera co najmniej 4 g/l mieszaniny galakto-oligosacharydów i polifruktozy. - 25 - - 26 - - 27 - - 28 - - 29 - - 30 -






























Grupy dyskusyjne