Money.plTechnologie dla biznesuPrzemysłPatentyEP 2451936 T3
Wyszukiwarka patentów
  • od
  • do
Patent EP 2451936 T3


EP 2451936 T3

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.07.2010 10730960.1 (19) PL (11) PL/EP (13) (51) 2451936 T3 Int.Cl. C12M 1/00 (2006.01) C12M 3/06 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (54) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 28.08.2019 Europejski Biuletyn Patentowy 2019/35 EP 2451936 B1 C12M 1/34 (2006.01) C12M 1/36 (2006.01) C12N 5/00 (2006.01) Tytuł wynalazku: SPOSÓB HODOWLI KOMÓREK EUKARIOTYCZNYCH (30) Pierwszeństwo: 06.07.2009 US 223313 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: 16.05.2012 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2012/20 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 28.02.2020 Wiadomości Urzędu Patentowego 2020/02 (73) Uprawniony z patentu: F. Hoffmann-La Roche AG, Basel, CH PL/EP 2451936 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: DINESH BASKAR, San Mateo, US JENNY HSIUNG, Mountain View, US WOON-LAM SUSAN LEUNG, San Mateo, US INN H. YUK, Berkeley, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Małgorzata Kaczmarczyk SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.K. Skr. poczt. 6 00-956 Warszawa 10 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich). SGS-17719/VAL EP 2 451 936 B1 Opis 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ODNIESIENIE DO POWIĄZANEGO ZGŁOSZENIA [0001] Niniejsze zgłoszenie zastrzega korzyść z tymczasowego zgłoszenia US nr 61/223313, dokonanego 6 lipca 2009 r. DZIEDZINA WYNALAZKU [0002] Wynalazek dotyczy urządzenia i sposobu hodowli komórek eukariotycznych w pożywce zawierającej wodorowęglan, która umożliwia utrzymanie pH hodowli komórkowej bez dodawania zasad bezpośrednio do pożywki hodowlanej. TŁO WYNALAZKU [0003] Hodowanie komórek dla uzyskania banku komórek, do wytwarzania produktów komórkowych, takiego jak wytwarzanie rekombinowanego białka, jest utrudnione przez zmieniające się warunki w miarę wzrostu komórek. Chociaż często do wytwarzania komórek stosowane są bioreaktory ze stali nierdzewnej, coraz częściej na wszystkich etapach wytwarzania środków biologicznych stosuje się wyroby jednorazowego użytku (Rao i in., 2009). W procesie wstępnego przetwarzania jednorazowe bioreaktory mają wiele zalet w porównaniu ze swoimi odpowiednikami ze stali nierdzewnej (od zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego do oszczędności kosztów i czasu). WAVE Bioreactor? jest dobrze udokumentowanym przykładem technologii wyrobów jednorazowego użytku do procesów wstępnych stosowanej do wytwarzania rekombinowanych białek w przemyśle biofarmaceutycznym (Cronin i in., 2007; Haldankar i in., 2006; Ling i in., 2003; Ye i in., 2009). [0004] Układ WAVE Bioreactor?, opracowany przez Singha (Singh, 1999), zawiera wstępnie wysterylizowaną, elastyczną i jednorazową komorę hodowlaną (Cellbag?), sterowniki mieszania CO2- i/lub O2-powietrze oraz sterowaną pneumatycznie platformę do kołysania i ogrzewania Cellbag?. Ruch kołysania generowany przez tę platformę zapewnia mieszanie i przenikanie gazu w Cellbag?. [0005] Układ WAVE Bioreactor? można dodatkowo wyposażyć w monitorowanie online pH i rozpuszczonego tlenu (DO) oraz sterowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego w czasie rzeczywistym (Mikola i in., 2007; Tang i in., 2007). Jednak wymagane dodatkowe urządzenia, a także potrzeba specjalnie zaprojektowanych worków, aby pomieścić sondy pH i DO, zwiększają koszty operacyjne i złożoność tego układu. Ponadto dodatek zasady wymagany do podniesienia pH hodowli do określonej wartości zadanej w bioreaktorach o regulowanym pH zwiększa osmolalność hodowli. W zależności od stopnia wzrostu osmolalności w bioreaktorze, związany z tym spadek wzrostu komórek i żywotności (deZengotita i in., 2002; Zhu i in., 2005) może zrównoważyć korzyści wynikające z regulowania pH. Ponadto, jeśli sonda pH działa nieprawidłowo, wynikające z niej zaburzenia pH mogą zmieniać metabolizm komórkowy i sprzyjać śmierci komórek (Miller i in., 1988; Osman i in., 2002). [0006] Ścisłe regulowanie pH i DO może nie być konieczne w niektórych zastosowaniach dotyczących hodowli komórkowych, takich jak na przykład rutynowe pasażowanie komórek w układach hodowli na małą skalę, takich jak kolby do wytrząsania i reaktory typu spinner, w celu utrzymania i namnażania komórek. Jednak skrajne wartości pH i DO są szkodliwe dla wzrostu i żywotności komórek (Lin i in., 1993; Link i in., 2004; Miller i in., 1988; Osman i in., 2001) i mogą wpływać na jakość produktu (Restelli i in., 2006; Yoon i in., 2005). Dlatego niezwykle ważne jest utrzymanie pewnej kontroli nad takimi warunkami wzrostu komórek na wszystkich etapach wytwarzania środków biologicznych. Badacze wcześniej wykazali sukces w hodowli komórek CHO w zakresie pH 6,8?7,3 i zakresie DO 10?100% nasycenia powietrza (Link i in. 2004; Restelli i in. 2006; Trummer i in. 2006; Yoon i in. 2005). W US 6190913 B1 opisano sposób hodowli komórek z zastosowaniem mieszania typu wave. W EP 0147975 A2 opisano sposób i urządzenie do hodowli komórek zwierzęcych. W DE 3606449 A1 opisano układ sterowania fermentora. W EP 2020433 A2 opisano 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 układ bioreaktora z ciągłą perfuzją. W EP 0200226 A1 opisano sposób określania wpływu środków chemioterapeutycznych na wzrost mikroorganizmów i/lub komórek. W WO 2005/118771 A2 opisano układy jednorazowych bioreaktorów i związane z nimi sposoby. W US 3941662 A opisano urządzenie do hodowli komórek. [0007] Dodawane elementy konwencjonalnych bioreaktorów, takie jak urządzenia do monitorowania pH w czasie rzeczywistym i sterowanie na podstawie monitorowania DO, znacznie zwiększają koszty i pracochłonność dotyczące hodowli komórkowej przy wytwarzaniu środków biologicznych. Ponadto, awaria lub nieprawidłowe działanie tych elementów może powodować niedopuszczalne zmiany i potencjalną utratę hodowli komórkowej, co jest bardzo kosztowne pod względem czasu i zasobów. [0008] Istnieje zatem zapotrzebowanie na ulepszone sposoby hodowli komórek eukariotycznych bez potrzeby wprowadzania silnych zasad i bez dodatkowego monitorowania i regulowania pH i DO w czasie rzeczywistym. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0009] Wynalazek dostarcza sposób hodowli okresowej komórek eukariotycznych obejmujący: dostarczanie materiału zaszczepiającego do hodowli komórkowej zawierającego komórki eukariotyczne w cieczy hodowlanej zawierającej wodorowęglan do naczynia, przy czym wspomniane naczynie ma ściany, które otaczają wspomnianą hodowlę komórkową i przestrzeń z fazą gazową nad cieczą nad wspomnianą hodowlą komórkową, i przy czym wspomniane naczynie zawiera co najmniej jeden otwór, który zapewnia wejście i wyjście gazu do i ze wspomnianej przestrzeni nad cieczą; mieszanie zawartości wspomnianego naczynia; i dostarczanie gazu do wspomnianej przestrzeni nad cieczą przez wspomniany otwór, przy czym wspomniany gaz zawiera pewną ilość CO2 i przy czym wspomnianą ilość CO2 we wspomnianym gazie moduluje się w czasie w celu dostosowania pH wspomnianej hodowli komórkowej w celu utrzymania określonego z góry pH wspomnianej hodowli komórkowej, przy czym wspomniany CO2 dostarcza się w ilości 8% (obj./obj.) wspomnianego gazu w dniu 1, w ilości 5% (obj./obj.) wspomnianego gazu w dniu 2 i w ilości 2% (obj./obj.) wspomnianego gazu później. [0010] W jednej postaci wspomniane mieszanie polega na kołysaniu wspomnianego naczynia z szybkością kołysania 15 do 30 obr/min i kątem kołysania 5° do 15°. [0011] W jednej postaci szybkość kołysania wynosi między 19 a 25 obr/min, a kąt kołysania wynosi między 8° a 12°. [0012] W jednej postaci szybkość usuwania wspomnianego gazu wynosi między 0,002 a 0,1 objętości przestrzeni nad cieczą na minutę (hvm). [0013] W jednej postaci szybkość usuwania wspomnianego gazu wynosi między 0,007 a 0,08 hvm. [0014] W jednej postaci szybkość usuwania wspomnianego gazu wynosi między 0,007 a 0,02 hvm. [0015] W jednej postaci wspomnianymi komórkami eukariotycznymi są komórki kręgowców. [0016] W jednej postaci wspomniane komórki kręgowców są wybrane z grupy obejmującej komórki żab, komórki królików, komórki gryzoni, komórki owiec, komórki kóz, komórki psów, komórki kotów, komórki krów, komórki koni, komórki naczelnych innych niż ludzie i komórki ludzkie. [0017] W jednej postaci wspomnianym naczyniem jest sztywny pojemnik. [0018] W jednej postaci, wspomnianym naczyniem jest giętki pojemnik. [0019] W jednej postaci, wspomnianym naczyniem jest jednorazowy worek hodowlany. [0020] W jednej postaci sposób obejmuje ponadto nieciągłe monitorowanie pH hodowli komórkowej. [0021] W jednej postaci, wspomniany gaz jest dostarczany do wspomnianej przestrzeni nad cieczą tak, że w hodowli komórkowej utrzymuje się ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 na poziomie około 1 do 200 mmHg. 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [0022] W jednej postaci, wspomniany gaz jest dostarczany do wspomnianej przestrzeni nad cieczą tak, że w hodowli komórkowej utrzymuje się ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 na poziomie około 10 do 150 mmHg. [0023] W jednej postaci, wspomniany gaz jest dostarczany do wspomnianej przestrzeni nad cieczą tak, że w hodowli komórkowej utrzymuje się ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 na poziomie około 20 do 120 mmHg. [0024] W jednej postaci, wspomniany gaz jest dostarczany do wspomnianej przestrzeni nad cieczą tak, że w hodowli komórkowej utrzymuje się ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 na poziomie około 20 do 80 mmHg. STRESZCZENIE INNYCH ASPEKTÓW UJAWNIENIA [0025] Ujawnienie dostarcza urządzenie, a wynalazek dostarcza sposób utrzymywania pH w układzie hodowli komórkowej bez dodawania zasady. W pożywce do hodowli komórkowej zawierającej wodorowęglan, ilość CO2 w pożywce wpływa na pH pożywki, w oparciu o równowagę buforu kwas węglowy-wodorowęglan (Równanie 1): CO2 + HOH <===> H2CO3 <===> H+ + HCO3pH = pK - log ([CO2]/[HCO3-]) Zatem w wynalazku wykorzystuje się tę zależność do dostosowania pH pożywki do hodowli komórkowej bez potrzeby dodawania mocnych kwasów lub zasad przez zwiększenie lub zmniejszenie stężenia rozpuszczonego CO2 z użyciem dynamicznej granicy faz między fazą ciekłą a fazą gazowej układu hodowli komórkowej. Wynalazek dostarcza sposób uzyskiwania tej modulacji, a ponadto ujawnia się urządzenie do realizacji tego sposobu. [0026] Ogólnie, urządzenie według ujawnienia jest zasilane powietrzem, tlenem lub połączeniem tych gazów w celu utrzymania rozpuszczonego tlenu w hodowli komórkowej. Dostarczając mieszaninę gazów (którą można manipulować pod względem jej składu i szybkości wprowadzania) do przestrzeni nad cieczą w urządzeniu, można dodawać lub usuwać CO2 z pożywki do hodowli komórkowej w zależności od różnicowego stężenia CO2 między fazą ciekłą a gazową. Usuwanie CO2 z przestrzeni nad cieczą będzie zwiększało pH hodowli, jako że rozpuszczony CO2 w pożywce będzie ulegał dyfuzji do przestrzeni nad cieczą. I odwrotnie, gdy CO2 dodaje się do urządzenia w stężeniu wyższym niż stężenie w pożywce, CO2 rozpuści się w pożywce, a pH hodowli spadnie. Niniejszy wynalazek dostarcza sposób, który pozwala na przenikanie CO2 do i z hodowli komórkowej, aby utrzymać pH hodowli bez dodawania zasady. [0027] Zatem wynalazek dostarcza sposób hodowli komórek eukariotycznych obejmujących komórki eukariotyczne w cieczy hodowlanej zawierającej wodorowęglan w naczyniu, które to naczynie ma ściany, które otaczają hodowlę komórkową i przestrzeń z fazą gazową nad cieczą nad wspomnianą hodowlą komórkową. Naczynie zawiera również co najmniej jeden otwór, który zapewnia wejście i wyjście gazu ze wspomnianej przestrzeni nad cieczą. Zawartość naczynia jest mieszana, aby zapewnić dynamiczną granicę faz między fazą ciekłą a fazą gazową. Odczyn pH hodowli może być monitorowany, a gaz jest dostarczany do przestrzeni nad cieczą przez wspomniany otwór, przy czym gaz zawiera pewną ilość CO2 dla spowodowania spadku pH, w miarę jak więcej CO2 rozpuszcza się w hodowli komórkowej, lub nagromadzony CO2 jest usuwany z przestrzeni nad cieczą przez otwór, powodując wzrost pH hodowli komórkowej. W ten sposób pH utrzymuje się w z góry ustalonym zakresie. [0028] Ogólnie, ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 w pożywce do hodowli komórkowej utrzymuje się na poziomie od 1 do 200 mmHg. W niektórych postaciach ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 wynosi od 10 do 180 mmHg. W niektórych postaciach ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 wynosi od 20 do 150 mmHg. W niektórych postaciach ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 wynosi 100-180 mmHg. W niektórych postaciach ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 wynosi od 20 do 80 mmHg. W niektórych postaciach ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 wynosi od 30 do 60 mmHg. W niektórych 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 postaciach ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 wynosi od 35 do 50 mmHg. W niektórych postaciach ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 wynosi 40 mmHg. [0029] Usuwanie dla przestrzeni nad cieczą można prowadzić w sposób ciągły lub nieciągły. [0030] Ogólnie DO utrzymuje się powyżej 10%. W niektórych postaciach DO utrzymuje się powyżej 20%. W niektórych postaciach DO utrzymuje się powyżej 30%. W niektórych postaciach DO utrzymuje się powyżej 40%. W niektórych postaciach DO utrzymuje się powyżej 50%. W niektórych postaciach DO utrzymuje się powyżej 60%. [0031] W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 0,001 objętości przestrzeni nad cieczą na minutę (hvm). W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 0,005 hvm. W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 0,01 hvm. W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 0,02 hvm. W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 0,05 hvm. W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 0,1 hvm. W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 0,2 hvm. W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 0,5 hvm. W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 0,9 hvm. W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi 1,0 hvm. [0032] Komórkami eukariotycznymi mogą być komórki kręgowców, takie jak, lecz nie wyłącznie, komórki żab, królików, gryzoni, owiec, kóz, psów, kotów, krów, koni, świń, naczelnych innych niż ludzie lub ludzi. [0033] Sposób można prowadzić w naczyniu, które ma sztywne lub giętkie ściany, takim jak pojemnik z tworzywa sztucznego lub jednorazowy worek hodowlany. [0034] Zawartość naczynia można mieszać dowolnymi środkami, które zapewniają dynamiczną granicę faz między fazą ciekłą a fazą gazową w naczyniu. Takie mieszanie może odbywać się na przykład przez kołysanie, ruch orbitalny, ruch ósemkowy, ruch obrotowy, wytrząsanie i tym podobne. [0035] W niektórych postaciach mieszanie prowadzi się przez kołysanie. Szybkość kołysania i kąt kołysania można regulować w celu uzyskania pożądanego mieszania. W niektórych postaciach kąt kołysania wynosi 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2° lub 1°. W niektórych postaciach kąt kołysania wynosi między 6-16°. W innych postaciach kąt kołysania wynosi między 7-16°. W innych postaciach kąt kołysania wynosi między 8-12°. [0036] W niektórych postaciach szybkość kołysania wynosi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,1 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 obr/min. W niektórych postaciach szybkość kołysania wynosi między 1925 obr/min. W niektórych postaciach szybkość kołysania wynosi między 20-24 obr/min. W niektórych postaciach szybkość kołysania wynosi między 21-23 obr/min. [0037] Można prowadzić sposób, w którym naczynie zawiera pojedynczy otwór, który umożliwia wejście i wyjście gazu z przestrzeni nad cieczą hodowli. Alternatywnie, naczynie może zawierać wiele otworów. [0038] pH hodowli monitoruje się w sposób ciągły lub nieciągły, a gaz wprowadza się do przestrzeni nad cieczą tak, że zapewniony jest poziom CO2 w gazie w przestrzeni nad cieczą w celu zwiększenia lub zmniejszenia stężenia rozpuszczonego CO2 w fazie ciekłej hodowli, tak że pH fazy ciekłej doprowadza się do z góry określonej wartości. [0039] W alternatywnej postaci sposób może obejmować etap perfuzji świeżej pożywki hodowlanej do hodowli komórkowej przez otwór na pożywkę. Świeża pożywka ma pH, które zapewnia po dodaniu dostosowanie ogólnego pH hodowli komórkowej, tak że pH świeżej pożywki częściowo utrzymuje hodowlę komórkową w z góry określonym zakresie pH. Modulacja pH przy użyciu świeżej pożywki o z góry określonym pH jest pomocna w sposobie hodowli, ale nie jest wystarczająca, aby całkowicie regulować pH. [0040] Sposób można dostosować do hodowli dowolnej wielkości. W niektórych postaciach sposób prowadzi się w jednorazowych workach bioreaktorowych, które są dostępne 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 w handlu. Takie worki bioreaktorowe są dostępne w takich pojemnościach jak 500 ml, 1 l, 2 l, 10 l, 20 l, 50 l, 100 l, 200 l, 500 l i 1000 l. [0041] Różne parametry hodowli mogą być monitorowane i regulowane. Takie parametry mogą być regulowane w zautomatyzowanym procesie, gdy obliczenia są wykonywane przez komputer. Niektóre parametry, które można regulować, same lub w połączeniu, obejmują, ale nie wyłącznie, przepływ gazu, pH, stężenie rozpuszczonego CO2, temperaturę i mieszanie. [0042] Ujawnienie dostarcza również urządzenie do realizacji sposobu według wynalazku. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0043] Figura 1 przedstawia przykład urządzenia według ujawnienia, które zawiera filtr perfuzyjny. Urządzenie zawiera otwór wlotowy i otwór wylotowy dla gazu, otwór do dostarczania świeżej pożywki do hodowli, filtr perfuzyjny do usuwania zużytej pożywki, kołyszącą się platformę i podstawę. Ruch kołyszący pozwala przez mieszanie zapewnić efektywne przenikanie O2 i CO2 do i z pożywki do hodowli komórkowej. Figura 2 przedstawia badania bez komórek w celu pomiaru przenikania tlenu w WAVE Bioreactor?. (Panel A) Wpływ szybkości i kąta kołysania na kLa przy stałym natężeniu przepływu powietrza wynoszącym 0,2 l/min; (Panel B) Wpływ szybkości kołysania, kąta kołysania i natężenia przepływu powietrza na kLa; (Panel C) nieprzetworzone dane dotyczące DO dla różnych kątów kołysania, szybkości kołysania i stałego natężenia przepływu gazu wynoszącego 0,2 l/min (co określa się tu również jako LPM); (Panel D) nieprzetworzone dane dotyczące przebiegu czasowego DO dla dwóch różnych wartości zadanych kołysania z różnymi natężeniami przepływu gazu. Figura 3 pokazuje badania bez komórek w celu oceny wskaźnika odpędzania CO2 w WAVE Bioreactor?. (Panel A); nieprzetworzone dane dotyczące wzrostu pH dla różnych kątów kołysania, szybkości kołysania ze stałym natężeniem przepływu gazu wynoszącym 0,2 LPM; (Panel B) nieprzetworzone dane dotyczące przebiegu czasowego wzrostu pH dla dwóch różnych wartości zadanych kołysania z różnymi natężeniami przepływu gazu. (Panel C) obliczona szybkość zmiany pH dla różnych warunków kołysania pokazanych w panelu A; (Panel D) obliczona szybkość zmiany pH dla różnych warunków kołysania i różnych natężeń przepływu gazu pokazanych w Panelu B. Wypełnione słupki to szybkość zmiany pH przez pierwsze 5 minut, a puste słupki to obliczona szybkość zmiany pH przez następne 55 minut. Figura 4 przedstawia profile (Panel A) VCC, (Panel B) pH off-line, (Panel C) pCO2 off-line i (panel D) DO off-line dla hodowli okresowych WAVE Bioreactor?. Warunki procesu zestawiono w Tabeli 2 poniżej. Jedynie etap zaszczepiania oceniono dla (i) linii komórkowej wytwarzającej MAb B, gdzie zarówno etap zaszczepiania, jak i zwiększania skali (podczas których robocza objętość wzrosła z 6 l do 20 l) oceniono dla (ii) linii komórkowej wytwarzającej MAb C. W każdym etapie powietrze pompowane do przestrzeni nad cieczą było uzupełniane CO2 w stężeniu 8% (obj./obj.) w pierwszym dniu, 5% (obj./obj.) w drugim dniu, a później 2% (obj./obj.). Figura 5 przedstawia (Panel A) VCC, (Panel B) żywotność hodowli (panel C) pH offline i (panel D) stężenie DO dla dwóch hodowli perfuzyjnych WAVE Bioreactor? przy użyciu przebiegu dla linii komórkowej wytwarzającej MAb A w niezoptymalizowanych warunkach. Komórki hodowano w trybie okresowym przez pierwsze 6 dni, a następnie w trybie perfuzyjnym. Podczas hodowli okresowej objętość roboczą w Cellbag? najpierw zaszczepiono 6 l hodowli, a w dniu 3 tę objętość hodowli zwiększono do 25 l przez dodanie świeżej pożywki. Podczas hodowli perfuzyjnej objętość hodowli utrzymywano na poziomie 25 l przy szybkości perfuzji 1 objętość na dobę. W tym zestawie doświadczeń szybkość kołysania wynosiła 18 obr/min, a kąt kołysania wynosił 8 stopni, podczas gdy natężenie przepływu powietrza do przestrzeni nad 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 cieczą wynosiło 0,2 l/min. To powietrze było uzupełniane 5% CO2 (obj./obj.) przez cały czas trwania hodowli. Figura 6 przedstawia profil wzrostu hodowli komórkowej i profil pH dla procesu okresowego (dni 0?6)/perfuzyjnego (dni 6-14). (Panel A) łączna objętość komórek w %PCV; (Panel B) żywotność komórek; (Panel C) profil pH; (Panel D) wzrost komórek w odniesieniu do liczby żywych komórek (VCC) mierzony z użyciem ViCell? AS. Figura 7 pokazuje sprawność hodowli przy różnych szybkościach usuwania dla przestrzeni nad cieczą (hvm). (Panel A) pokazuje 2 doświadczenia z jednoetapowym wzrostem przepływu powietrza, co skutkuje wzrostem szybkości usuwania dla przestrzeni nad cieczą (0,1 hvm w ( ) i 0,02 hvm ( ). Inną strategią szybkości usuwania dla przestrzeni nad cieczą jest wzrost wieloetapowy (0,007 hvm do 0,013 hvm do 0,02 hvm) ( ) w dniach 10 i 11. (Panel B) ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 mierzone z użyciem NOVA BioProfile? 400. Figura 8 przedstawia (Panel A) VCC, (panel B) żywotność hodowli (panel C) pH offline oraz (panel D) DO dla hodowli WAVE Bioreactor? sześciu różnych linii komórkowych - z których każda wytwarza inne MAb - w zoptymalizowanym procesie. Podczas etapu zaszczepiania 6 l, hodowle kołysano przy 21 obr/min, a natężenie przepływu powietrza w przestrzeni nad cieczą wynosiło 0,2 l/min. Powietrze to było uzupełnione CO2 w stężeniu 8% (obj./obj.) pierwszego dnia, 5% (obj./obj.) drugiego dnia, a później 2% (obj./obj.). Tę strategię przepływu powietrza powtórzono dla etapu zwiększania skali do 20 l (dzień 3-6). Podczas hodowania w trybie perfuzji 20 l (od dnia 6) natężenie przepływu powietrza do przestrzeni nad cieczą utrzymywano na poziomie 0,6 l/min bez uzupełniania CO2, natomiast mieszanie O2 z powietrzem w gazie wlotowym zwiększono z 0% (obj./obj.) do 30% (obj./obj.) w dniu 8 i utrzymywano na poziomie 30% (obj./obj.) przez pozostały czas trwania hodowli. Hodowle okresowe i perfuzyjne o 20 l kołysano przy 23 obr/min. Kąt kołysania dla wszystkich hodowli był stały przy 10°. Figura 9 przedstawia (Panel A) VCC, (Panel B) żywotność, (Panel C) pH off-line i (Panel D) DO off-line dla równoległych hodowli linii komórkowej wytwarzającej MAb E w WAVE Bioreactor? (?) i bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem (?). SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0044] Specjalista w dziedzinie jest dobrze zaznajomiony z wieloma protokołami i metodami hodowli komórek eukariotycznych i może dobrać pożywki hodowlane dla nich. Takie protokoły i pożywki hodowlane są opisane w literaturze i podręcznikach, tak jak w ANIMAL CELL CULTURE, A PRACTICAL APPROACH Wyd 2., red. Rickwood, D. I Hames, B.D., Oxford University Press, Nowy Jork (1992). Ogólne metody stosowania są również dostępne w internecie, tak jak na stronie: protocol-online.org/prot/Cell_Biology/ Cell_Culture. Pożywka do hodowli komórkowej jest również dostępna w handlu z wielu dobrze znanych źródeł. Definicje [0045] Ogólne techniki i procedury hodowli komórkowej tu opisane lub przywołane są dobrze zrozumiałe i powszechnie stosowane przez specjalistów w dziedzinie z użyciem konwencjonalnej metodologii. W stosownych przypadkach procedury obejmujące stosowanie dostępnych w handlu zestawów i odczynników są na ogół prowadzone zgodnie z protokołami i/lub parametrami określonymi przez producenta, chyba że zaznaczono inaczej. [0046] Przed opisaniem niniejszych sposobów należy rozumieć, że niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do konkretnej metodologii, protokołów, linii komórkowych, gatunków lub rodzajów zwierząt, konstruktów i odczynniki opisane jako takie mogą oczywiście się różnić. Należy również rozumieć, że stosowana tu terminologia służy wyłącznie opisowi konkretnych postaci i nie ma na celu ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku, który będzie ograniczony jedynie załączonymi zastrzeżeniami. 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [0047] Należy zauważyć, że stosowane tu i w załączonych zastrzeżeniach formy w liczbie pojedynczej obejmują odniesienia do liczby mnogiej, chyba że z kontekstu wyraźnie wynika inaczej. Wszystkie liczby wspomniane w opisie i powiązanych zastrzeżeniach (np. 1?200 mm Hg itp.) należy rozumieć jako zmodyfikowane określeniem ?około?. [0048] Cytowane tu publikacje są cytowane z uwagi na ich ujawnienie przed datą dokonania niniejszego zgłoszenia. Niczego tu nie należy interpretować jako przyznania, że twórcy wynalazku nie są uprawnieni do poprzedzania publikacji na mocy wcześniejszej daty pierwszeństwa lub wcześniejszej daty wynalazku. Ponadto rzeczywiste daty publikacji mogą się różnić od pokazanych i wymagać niezależnej weryfikacji. [0049] W użytym tu znaczeniu określenie ?około? odnosi się do wartości, która jest o 10% większa lub mniejsza od podanej wartości. [0050] W użytym tu znaczeniu określenie ?mieszać? odnosi się do zaburzania tak, że faza ciekła hodowli dynamicznie oddziałuje z fazą gazową nad hodowlą. Mieszanie może odnosić się do ruchu, takiego jak wytrząsanie, mieszanie mieszadłem, kołysanie, wytrząsanie orbitalne, obracanie, wytrząsanie ruchem ósemkowym, lub dowolnych środków powodujących, że faza ciekła jest niestatyczna i zwiększa się dyfuzja gazów do i z fazy ciekłej. [0051] W użytym tu znaczeniu określenie ?gaz? odnosi się do czystego gazu lub mieszaniny gazów, które mogą obejmować azot, tlen i ditlenek węgla. Zazwyczaj azot występuje w ilości około 60 do 90% całkowitego stężenia gazu, tlen występuje w ilości około 10 do 40% całkowitego stężenia gazu, a ditlenek węgla występuje w ilości około 0 do 50% całkowitego stężenia gazu. [0052] W użytym tu znaczeniu określenie ?ciecz do hodowli komórkowej zawierająca wodorowęglan? odnosi się do odpowiedniej pożywki hodowlanej do hodowli komórek eukariotycznych, która zawiera, jako część swojego składu, buforujący układ wodorowęglanowy. Pożywka może również zawierać dodatkowe środki buforujące, takie jak HEPES lub MOPS, lub podobne, ale musi również zawierać układ oparty na wodorowęglanie. [0053] W użytym tu znaczeniu określenie ?hodowla komórkowa? odnosi się do ciekłego preparatu zawierającego komórki eukariotyczne w ciekłej pożywce zawierającej środki buforujące i składniki odżywcze wymagane do wzrostu i/lub utrzymania żywotnych komórek. [0054] W użytym tu znaczeniu określenie ?stężenie rozpuszczonego CO2? wyraża się jako względną miarę ciśnienia cząstkowego CO2 w mmHg. Dlatego ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 odzwierciedla stężenie rozpuszczonego CO2. [0055] ?DO? odnosi się do rozpuszczonego tlenu. [0056] W użytym tu znaczeniu określenie ?dynamiczna granica faz? odnosi się do zwiększonej aktywnej wymiany gazów między fazą ciekłą i fazą gazową, zapewnionej przez mieszanie hodowli komórkowej. [0057] W użytym tu znaczeniu określenie ?komórki eukariotyczne? odnosi się do komórek zwierzęcych, którymi mogą być komórki bezkręgowców lub kręgowców. [0058] W użytym tu znaczeniu określenie ?przestrzeń nad cieczą? odnosi się do fazy gazowej powyżej fazy ciekłej hodowli komórkowej w naczyniu stosowanym dla komórek hodowlanych. [0059] W użytym tu znaczeniu hvm odnosi się do objętości przestrzeni nad cieczą na minutę i wskazuje szybkość, z jaką gaz w przestrzeni nad cieczą jest usuwany. [0060] kLa odnosi się do objętościowego współczynnika przenikania tlenu. [0061] kLaCO2 odnosi się do objętościowego współczynnika przenikania ditlenku węgla. [0062] LPM odnosi się do litrów na minutę przepływu gazu. [0063] W użytym tu znaczeniu określenie ?modulować? odnosi się do powodowania wzrostu lub spadku wartości. [0064] W użytym tu znaczeniu określenie ?monitorować? odnosi się do śledzenia określonej wartości przez próbkowanie i analizę w celu ustalenia takiej wartości w sposób nieciągły lub ciągły. 8 5 10 15 20 [0065] pCO2 odnosi się do ciśnienia cząstkowego odpowiadającego stężeniu rozpuszczonego CO2. [0066] W użytym tu znaczeniu określenie ?otwór? odnosi się do punktu dostępu do poza tym zamkniętego układu. [0067] W użytym tu znaczeniu określenie ?z góry określony? odnosi się do wartości wybranej wcześniej dla określonego parametru, który jest stosowany jako wartość docelowa. [0068] W użytym tu znaczeniu określenie ?obr/min? odnosi się do liczby ruchów kołyszących na minutę. [0069] VCC odnosi się do stężenia żywotnych komórek. [0070] W użytym tu znaczeniu określenie ?naczynie? odnosi się do pojemnika. W użytym tu znaczeniu takim naczyniem może być na przykład kolba, bioreaktor, jednorazowy worek bioreaktorowy, komora hodowlana i tym podobne. [0071] W użytym tu znaczeniu określenie ?vvm? odnosi się do objętości naczynia na minutę. ASPEKTY TEORETYCZNE Przynikanie O2 w hodowli WAVE Bioreactor? [0072] Aby określić szybkość przenikania O2 w WAVE Bioreactor?, zakłada się wystarczająco szybki czas odpowiedzi sondy DO on-line, idealne mieszanie w Cellbag? i dominację oporu przenikania masy przez granicę fazy ciekłej. Zgodnie z tymi założeniami następujące równanie bilansu masy przybliżałoby szybkość przenikania O2 z fazy gazowej do fazy ciekłej: gdzie O2* oznacza stężenie nasycenia DO w pożywce i O2 oznacza stężenie DO w pożywce. Przyjmując, że O2 jest równe zero w czasie zero, równanie dałoby: 25 30 35 40 Po wykreśleniu w funkcji czasu, nachylenie linii najlepszego dopasowania dostarczyłoby kLa dla układu. [0073] Aby zwiększyć szybkość przenikania O2 w WAVE Bioreactor? (równanie 1), można zwiększać kLa dla układu lub zwiększać gradient stężenia (O2* - O2) lub zwiększać oba. Aby zwiększyć kLa dla układu WAVE Bioreactor?, można by zwiększyć szybkość kołysania, kąt kołysania lub natężenie przepływu powietrza (Mikola, 2007; Singh, 1999). Aby zwiększyć gradient stężenia (O2* - O2), który zapewnia siłę napędową dla przenikania O2 z fazy gazowej do ciekłej, można by zwiększyć zawartość procentową O2 w gazie wlotowym w celu zwiększenia O2*. Przenikanie CO2 w hodowli WAVE Bioreactor? [0074] W uproszczonym modelu, gazowy CO2 (CO2(g)) w Cellbag? jest w równowadze z rozpuszczonym CO2 (CO2(aq)) w pożywce hodowlanej: CO2(g) ? CO2(aq) (3) [0075] CO2(aq) z kolei jest w równowadze z kwasem węglowym (H2CO3), który może dysocjować do wodorowęglanu (HCO3-): H2O + CO2(aq) ? H2CO3 ? HCO3- + H+ (4) 2[0076] Dalsza dysocjacja HCO3 do węglanu (CO3 ) powinna być pomijalna w zakresie pH 4-8 (Royce i Thornhill, 1991). [0077] Etapem ograniczającym szybkość wydzielania CO2 z pożywki hodowlanej powinien być przenikanie masy gaz-ciecz (równanie 3). Zakładając, że stężenie CO2 w cieczy na granicy faz jest w równowadze ze stężeniem w całym gazie, następujące równanie bilansu masy przybliżałoby szybkość przenikania CO2 z fazy ciekłej do fazy gazowej: 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 gdzie kLaCO2 oznacza objętościowy współczynnik przenikania rozpuszczonego ditlenku węgla. [0078] Bez sondy rozpuszczonego CO2 w WAVE Bioreactor?, nie można było uzyskiwać pomiarów CO2 w czasie rzeczywistym do bezpośredniego obliczania szybkości przenikania CO2(aq). Jednak w oparciu o naszą wiedzę o układzie buforowania wodorowęglanem w naszej pożywce hodowlanej oczekuje się odpędzania CO2 w celu zwiększenia pH hodowli, ponieważ równowagi w równaniach 3 i 4 przesunęłyby się w lewo. Zakładając wystarczająco szybki czas odpowiedzi dla sondy pH online, profil pH, który generuje ona w badaniu dynamicznego przenikania CO2(aq) powinien dostarczyć pośredniego oszacowania szybkości odpędzania CO2(aq). [0079] Aby zwiększyć pH hodowli, można by zwiększyć szybkość odpędzania CO2 w WAVE Bioreactor? (równanie 5) przez zwiększenie kLaCO2 dla układu lub przez zwiększenie siły napędowej (CO2(aq) - CO2(g)) dla przenikania CO2 lub zwiększając oba. W szczególności, aby zwiększyć kLaCO2 w układzie WAVE Bioreactor? można by zwiększyć szybkość kołysania i kąt kołysania. Aby zwiększyć siłę napędową (CO2(aq) - CO2(g)), można by zmniejszyć zawartość procentową CO2 w gazie wlotowym w celu zmniejszenia CO2(g). Zgodnie z prawem Henry'ego, ciśnienie cząstkowe CO2(g) (pCO2(g)) w przestrzeni nad cieczą Cellbag? ograniczyłoby stężenie CO2(aq) w pożywce: gdzie H = stała prawa Henry'ego dla CO2. [0080] Odwrotnie, aby obniżyć pH hodowli, można by zwiększyć stężenie CO2(g) w gazie wlotowym w celu zwiększenia CO2(aq), a tym samym przesunąć równowagę w równaniu 4 w prawo. Sposób według wynalazku [0081] W sposobie według wynalazku komórki eukariotyczne hoduje się w odpowiedniej pożywce hodowlanej i temperaturze, aby zapewnić żywotność komórek. Jak wiadomo specjaliście w dziedzinie, różne typy komórek można hodować w różnych pożywkach. Specjalista w dziedzinie może łatwo wybrać, która pożywka najlepiej nadaje się do określonego rodzaju komórek i/lub określonego zastosowania. W sposobie według wynalazku pożywka musi zawierać wodorowęglanowy układ buforowy, aby umożliwić modulację pH przez CO2. Pożywka może zawierać dodatkowe środki działające jak bufor. [0082] Komórki eukariotyczne, które można stosować w sposobie według wynalazku, obejmują komórki zwierzęce, którymi mogą być komórki bezkręgowców, a także kręgowców. Komórki bezkręgowców obejmują komórki owadów (np. komórki Spodoptera frugiperda, Bombyx mori i Trichoplusia ni). Komórki kręgowców obejmują komórki ssaków i niepochodzące od ssaków. Komórki kręgowców obejmują, ale nie wyłącznie, komórki żab (np. Xenopus laevis), zajęczaków (np. królików i zajęcy), gryzoni (np. szczurów, chomików, suwaków, myszoskoczków i myszy), kotów, psów, owiec, bydła, kóz, świń, koni, naczelnych innych niż ludzie i ludzi. [0083] Komórkami stosowanymi w sposobie według wynalazku mogą być komórki rekombinowane lub nierekombinowane. Komórki rekombinowane mogą obejmować komórki modyfikowane metodami inżynieryjnymi do ekspresji określonych białek (takie jak trwale lub przejściowo transfekowane komórki) lub komórki modyfikowane metodami inżynieryjnymi do wytwarzania określonych RNA (np. siRNA, rybozymów i tym podobnych). [0084] Komórki w odpowiedniej pożywce umieszcza się w naczyniu hodowlanym, a gaz wprowadza się do przestrzeni nad cieczą. W niektórych postaciach, szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą mieści się w zakresie od około 0,002 do 0,1 hvm. W niektórych postaciach, szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą mieści się w zakresie od około 0,007 do 0,08 hvm. W niektórych postaciach, szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą mieści 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 się w zakresie od około 0,009 do 0,06 hvm. W niektórych postaciach, szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą mieści się w zakresie od około 0,01 do 0,04 hmv. W niektórych postaciach, szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą mieści się w zakresie od około 0,02 do 0,03 hvm. W jeszcze innych postaciach, szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą mieści się w zakresie od około 0,009 do 0,024 hmv. W dalszych postaciach, szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą jest w zakresie od około 0,007 do 0,02 hvm. ?Hvm? oznacza stosunek objętościowego natężenia przepływu gazu (l/min) do objętości przestrzeni nad cieczą (L). [0085] W niektórych postaciach, na przykład w 50 l worku WAVE Bioreactor? z objętością hodowli 20 l i objętością przestrzeni nad cieczą 30 l, natężenie przepływu gazu do naczynia wynosi od 0,1 l/min do 1 l/min. W niektórych postaciach natężenie przepływu gazu do worka wynosi 0,2 l/min. W niektórych postaciach natężenie przepływu wynosi 0,3 l/min. W innych postaciach natężenie przepływu gazu wynosi 0,4 l/min. W jeszcze innych postaciach natężenie przepływu gazu wynosi 0,5 l/min. W innych postaciach natężenie przepływu gazu wynosi 0,6 l/min. W innych postaciach natężenie przepływu gazu wynosi 0,7 l/min. W jeszcze innych postaciach natężenie przepływu to0,8 l/min. W innych postaciach natężenie przepływu wynosi 0,9 l/min. [0086] Ogólnie hodowlę komórkową należy utrzymywać w zakresie od około 6 do 8. W niektórych postaciach pH utrzymuje się w zakresie od około 6,6 do 7,6. W niektórych postaciach pH utrzymuje się w zakresie od około 6,9 do 7,5. W niektórych postaciach pH utrzymuje się w zakresie od około 6,8 do 7,2. W niektórych postaciach pH utrzymuje się w zakresie od około 7,0 do 7,3. Chociaż sposób według wynalazku nie wymaga monitorowania pH w celu utrzymania pH sprzyjającego wzrostowi komórek w hodowli, w niektórych postaciach sposobu według wynalazku pH hodowli można monitorować (w sposób nieciągły lub ciągły). Pomiar można wykonywać in situ lub off line. [0087] W niektórych postaciach sposobu według wynalazku DO utrzymuje się powyżej 10%. W innych postaciach DO utrzymuje się powyżej 20%. W innych postaciach DO utrzymuje się powyżej 30%. W innych postaciach DO utrzymuje się powyżej 40%. W innych postaciach DO utrzymuje się powyżej 50%. W innych postaciach DO utrzymuje się powyżej 60%. W innych postaciach DO utrzymuje się powyżej 70%. W innych postaciach DO utrzymuje się powyżej 80%. W innych postaciach DO utrzymuje się powyżej 90%. [0088] Monitorowanie stężenia CO2 w ciekłej pożywce jest dobrze znane w dziedzinie i można je osiągnąć stosując dostępną w handlu technologię. Pomiar można wykonywać in situ lub off line. [0089] W szczególnej poglądowej postaci sposobu według wynalazku stosuje się proces okresowy, w którym komórki hoduje się w sposób stopniowy. W tym sposobie stosuje się 50 l worek układu WAVE Bioreactor? z roboczą objętością hodowli 20 l, gdzie do przestrzeni nad cieczą wprowadza się gaz uzupełniony 8% CO2 (obj./obj.) w gazie podczas pierwszego dnia, 5% CO2 (obj./obj.) w gazie drugiego dnia i 2% CO2 (obj./obj.) w gazie później. WAVE Bioreactor? kołysze się przy 21 obr/min przy 10° i 0,2 l/min w przypadku zaszczepienia, a następnie 23 obr/ min, kącie kołysania 10° i 0,2 l/min w etapie zwiększania skali. W tym układzie nie jest konieczne monitorowanie pH, ponieważ pH będzie utrzymywane przez stosowane parametry. [0090] W szczególnej poglądowej postaci sposobu według wynalazku stosuje się proces perfuzyjny. W tym sposobie stosuje się 50 l worek WAVE Bioreactor? z roboczą objętością hodowli 20 l. Do worka wprowadza się gaz, który uzupełnia się 30% O2 (obj./obj.) dwa dni po rozpoczęciu perfuzji. Natężenie przepływu gazu zwiększa się stopniowo od 0,2 l/min w dniu 0, następnie zwiększa się do 0,4 l/min w dniu 3, a następnie ponownie zwiększa do 0,6 l/min w dniu 6. W tym układzie nie jest konieczne monitorowanie pH, ponieważ pH będzie utrzymywane przez stosowane parametry. [0091] W innej szczególnej poglądowej postaci sposobu według wynalazku stosuje się proces perfuzyjny. W tym sposobie stosuje się 50 l worek WAVE Bioreactor? z roboczą 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 objętością hodowli 20 l. Do worka wprowadza się gaz, który uzupełnia się 30% O2 (obj./obj.) dwa dni po rozpoczęciu perfuzji. Natężenie przepływu gazu utrzymuje się jako stałe natężenie przepływu 0,6 l/min. W tym układzie nie jest konieczne monitorowanie pH, ponieważ pH będzie utrzymywane przez stosowane parametry. [0092] W jeszcze innej szczególnej poglądowej postaci sposobu według wynalazku stosuje się proces perfuzyjny. W tym sposobie stosuje się 50 l worek WAVE Bioreactor? z roboczą objętością hodowli 20 l. Do worka wprowadza się gaz, który uzupełnia się 30% O2 (obj./obj.) dwa dni po rozpoczęciu perfuzji. Natężenie przepływu gazu utrzymuje się jako stałe natężenie przepływu 1,0 l/min. W tym układzie nie jest konieczne monitorowanie pH, ponieważ pH będzie utrzymywane przez stosowane parametry. [0093] Dla specjalisty w dziedzinie będzie oczywiste, że parametry warunków hodowli (stężenia gazu, natężenia przepływu, hmv, szybkość kołysania, kąty kołysania itp., można regulować z użyciem niniejszych wskazówek w celu osiągnięcia pH w pożądanym zakresie. Urządzenie [0094] Naczynie do pomieszczenia pożywki do hodowli komórkowej nie jest ograniczone do żadnej konkretnej wielkości. Naczynie według ujawnienia może być dostosowane do wielkości powszechnie stosowanych bioreaktorów i jednorazowych worków hodowlanych stosowanych w dziedzinie i może być dostosowane do większych lub mniejszych hodowli. [0095] Naczynie nie jest ograniczone do materiału użytego do wykonania naczynia. Naczynie może być wykonane z litego materiału, takiego jak szkło lub twarde tworzywo sztuczne, lub może być wykonane z giętkiego materiału, takiego jak miękkie tworzywo sztuczne, takie jak stosowane do wytwarzania jednorazowych worków bioreaktorowych. [0096] Naczynie może ewentualnie zawierać przegrody w celu zwiększenia burzliwości pożywki podczas mieszania. [0097] Naczynie może być wyposażone w jeden lub większą liczbę otworów umożliwiających dodawanie lub usuwanie gazu i cieczy. Gaz może być wprowadzany do przestrzeni nad cieczą i usuwany z przestrzeni nad cieczą przez jeden lub większą liczbę otworów. W jednym aspekcie istnieje pojedynczy otwór, który umożliwia zarówno wejście, jak i wyjście gazu. W innych aspektach istnieją dwa otwory: jeden do wejścia gazu i drugi do wyjścia gazu. W innych aspektach stosuje się wiele otworów, aby umożliwić wejście i wyjście gazu. [0098] W niektórych aspektach urządzenie może również zawierać przyrząd do monitorowania pH, który w sposób ciągły lub przerywany monitoruje pH pożywki do hodowli komórkowej. Przyrząd do monitorowania pH może być używany w połączeniu ze zautomatyzowanym układem do nagazowywania lub odgazowywania przestrzeni nad cieczą naczynia w celu zmiany stężenia CO2 i tym samym dostosowania pH pożywki do hodowli komórkowej. [0099] W pewnych aspektach urządzenie według ujawnienia obejmuje przyrząd do monitorowania CO2, który w sposób ciągły lub nieciągły monitoruje ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 jako wskazanie stężenia CO2 w pożywce. Przyrząd do monitorowania CO2 może być używany w połączeniu ze zautomatyzowanym układem do nagazowywania lub odgazowywania przestrzeni nad cieczą naczynia w celu zmiany stężenia rozpuszczonego CO2 tak, że faktyczne stężenie CO2 mierzone przez przyrząd do monitorowania CO2 jest modulowane w celu dostosowania stężenia do określonej z góry wartości. [0100] W pewnych aspektach urządzenie według ujawnienia obejmuje sprzęt do monitorowania temperatury, który w sposób ciągły lub nieciągły monitoruje temperaturę pożywki do hodowli komórkowej. Sprzęt do monitorowania temperatury można stosować w połączeniu ze zautomatyzowanym układem w celu zwiększenia lub zmniejszenia temperatury, tak że rzeczywista temperatura mierzona przez sprzęt monitorowania jest modulowana w celu dostosowania do z góry określonej wartości. [0101] Sprzęty do monitorowania różnych parametrów mogą być używane same lub w połączeniu i mogą być sterowane za pomocą zautomatyzowanego układu sterowanego przez komputer. Komputer można zaprogramować do wykonywania obliczeń niezbędnych do 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ustalenia ilości CO2 do wprowadzania z gazem lub odgazowania z przestrzeni nad cieczą w celu dostosowania pH pożywki do hodowli komórkowej. Komputer może również wykonywać obliczenia dotyczące temperatury, szybkości mieszania, perfuzji pożywki i innych parametrów, a także sterować środkami do dostosowania parametrów w zautomatyzowany sposób. [0102] Ewentualnie, urządzenie według ujawnienia zawiera mieszadło do mieszania w naczyniu tak, że pożywka do hodowli komórkowej nie jest statyczna, ale ma dynamiczną granicę faz z gazem w przestrzeni nad cieczą. Mieszanie ułatwia dyfuzję gazu do i z pożywki do hodowli komórkowej. Urządzenie mieszające może być dowolnej postaci znanej w dziedzinie, ale obejmuje takie niestanowiące ograniczenia przykłady jak wytrząsarki, wytrząsarki orbitalne, rotatory, wytrząsarki ósemkowe, platformy kołyszące, platformy obrotowe i tym podobne. [0103] Zautomatyzowany układ dostarczania i usuwania gazu może zawierać układ zaworów i pomp do dostarczania gazu pod ciśnieniem przez sterylne filtry z przyrządem sterującym do regulowania natężenia przepływu gazu do naczynia. Można stosować dowolne znane w dziedzinie środki dostarczania gazu i usuwania gazu. Gaz można wprowadzać w odpowiedzi na sygnał obliczony na komputerze, gdy stężenie rozpuszczonego CO2 w pożywce do hodowli komórkowej odbiega od z góry określonej wartości. Jeżeli zmierzone stężenie CO2 odbiega od z góry określonej wartości, zautomatyzowany układ oblicza ilość CO2, jaką trzeba dodać do układu lub usunąć z układu i gaz z odpowiednią ilością CO2 jest wprowadzany do przestrzeni nad cieczą, w miarę jak przebywający gaz jest usuwany przez otwór wylotowy. Komputer może wykonywać obliczenia obejmujące Równania 1, 2 i/lub 3, jak tu zdefiniowano oraz inne obliczenia do regulacji układu, które będą znane specjaliście w dziedzinie w oparciu o dostępną literaturę, dostępne w handlu układy i niniejsze wskazówki. [0104] Alternatywnie lub w połączeniu z układem odpowiedzi, w którym stosuje się monitorowane stężenie CO2, zautomatyzowany układ może również mierzyć pH pożywki hodowlanej i odpowiadać, gdy zmierzone pH odbiega od z góry określonego pH do hodowli komórkowej. Zautomatyzowany układ może reagować na odchylenie stężenia CO2 i/lub pH i wprowadzać odpowiednią ilość CO2 z gazem, podczas gdy przebywający gaz jest usuwany, aby odpowiednio modulować pH pożywki hodowlanej. [0105] Urządzenie i sposób zostaną teraz opisane w niestanowiącym ograniczenia przykładzie w odniesieniu do Fig. 1. Naczynie hodowlane (40) zawiera pożywkę do hodowli komórkowej i komórki (110), oraz przestrzeń (130) nad cieczą. Otwór wlotowy (70) dla gazu z filtrem (50) jest podłączony do naczynia (40), umożliwiając wprowadzanie gazu do przestrzeni (130) nad cieczą. Otwór wylotowy (80) dla gazu z filtrem (60) jest podłączony do naczynia (40), umożliwiając wyjście gazu z przestrzeni (130) nad cieczą. Naczynie spoczywa na platformie (30), która jest podłączona do wahacza (20) i podstawy (10) umożliwiając ruch kołyszący i mieszanie pożywki (110) do hodowli komórkowej. Mieszanie i przepływ gazu w przestrzeni (130) nad cieczą umożliwia dyfuzję O2 i CO2 do i z pożywki (110) do hodowli komórkowej. Ewentualny filtr perfuzyjny (90) do zatrzymywania komórek w naczyniu hodowlanym jest podłączony za pomocą przewodów (100) do otworu (120) dla pożywki, umożliwiając usuwanie zużytej pożywki hodowlanej z hodowli komórkowej, jeśli to konieczne. [0106] Komórki hoduje się w pożywce (110) do hodowli komórkowej w naczyniu (40). Przestrzeń (130) nad cieczą w naczyniu (40) jest wypełniona gazem. Przepływ gazu przez otwór wlotowy (70) dla gazu i przez otwór wylotowy (80) gazu umożliwia przepływ gazu przez przestrzeń (130) nad cieczą i wypływanie CO2, który dyfunduje z pożywki (110) do hodowli komórkowej do przestrzeni (130) nad cieczą, gdy hodowla jest mieszana przez ruch kołyszący platformy (30) na wahaczu (20) przymocowanym do podstawy (10). Zmniejszenie ilości rozpuszczonego CO2 w pożywce (110) do hodowli komórkowej powoduje wzrost pH pożywki (110) do hodowli komórkowej. 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [0107] Pożywka (110) do hodowli komórkowej może być ewentualnie uzupełniana świeżą pożywką dostarczaną przez przewód (140) dla pożywki przez otwór (150) dla pożywki i usuwana przez filtr perfuzyjny (90) do góry przez przewód (100) dla pożywki i na zewnątrz przez otwór wyjściowy (120) dla pożywki. W tej ewentualnej cesze sposobu według wynalazku świeża pożywka jest dostarczana w miarę wyczerpywania się składników odżywczych w pierwotnej pożywce do hodowli komórkowej i gromadzenia się zbędnych produktów komórek i spadku pH. Świeża pożywka jest dostarczana przy z góry określonym pH, które jest wystarczające do spowodowania wzrostu pH całej pożywki do hodowli komórkowej po zmieszaniu w celu doprowadzenia pożywki do hodowli komórkowej do z góry określonego optymalnego zakresu pH. PRZYKŁADY A. Zasady: [0108] Ponieważ w większości układów hodowli komórek ssaków stosuje się pożywkę do hodowli komórek zawierającą wodorowęglan, regulowanie pH w hodowli komórek ssaków prowadzi się głównie za pomocą dodawania zasady/CO2. W przypadku regulowania pH korzysta się z układu buforowego kwas węglowy-wodorowęglan. Stwierdzono, że w takim układzie, na przykład bioreaktorze z jednorazowym workiem, pH hodowli można modulować przez manipulowanie stężeniem rozpuszczonego CO2 w pożywce, które można modulować przez modulację stężenia CO2 w przestrzeni nad cieczą. W podanych tu przykładach pokazano, że możliwe jest dwukierunkowe nastawianie pH przez modulowanie stężenia CO2 w przestrzeni nad cieczą. Ten sposób wyeliminuje stosowanie zasady do zwiększania pH w układzie bioreaktora do hodowli komórkowej. Jeśli pH hodowli komórkowej w jednorazowym bioreaktorze wymaga obniżenia, stężenie CO2 w przestrzeni nad cieczą można zwiększyć, uzupełniając dopływający gaz CO2. Umożliwi to przenikanie CO2 do hodowli komórkowej. Jeżeli pH hodowli komórkowej w jednorazowym worku wymaga podwyższenia, stężenie CO2 w przestrzeni nad cieczą może zostać zmniejszone lub szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą może zostać zwiększona, aby ułatwić usuwanie CO2 z hodowli komórkowej. [0109] Ten sposób utrzymywania pH można rozszerzyć na układ bioreaktora, w którym przenikanie gazu w bioreaktorze jest ułatwione głównie dzięki dużej powierzchni utworzonej w bioreaktorze. Strategia utrzymywania pH przez dodawanie/usuwanie CO2 w procesie uzyskiwania banku komórek: [0110] Podczas początkowych etapów hodowli komórkowej, gdy występuje względnie mniejsza liczba komórek, pH hodowli komórkowej zwykle wzrasta. Aby regulować pH, CO2 zazwyczaj dodaje się do bioreaktora w celu obniżenia pH. Zazwyczaj tego dodawania dokonuje się przez przepuszczanie gazowego CO2 pęcherzykami przez hodowlę komórkową w zwykłym bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem. W jednorazowym bioreaktorze według wynalazku stężenie CO2 w przestrzeni nad cieczą zmienia się tak, że przenikanie CO2 następuje w kierunku z fazy gazowej do fazy ciekłej. Gdy stężenie komórek wzrasta w przebiegu hodowli, stężenie CO2 w hodowli komórkowej również wzrasta, a zatem pH zwykle spada. W zwykłym bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem ze zwykłym regulowaniem pH na zasadzie sprzężenia zwrotnego, w celu regulowania pH dodawana będzie zasada. Dodanie zasady zwiększa pH hodowli komórkowej. W jednorazowym bioreaktorze według wynalazku wzrost pH można osiągnąć przez odwrócenie kierunku przenikania CO2 przez zmniejszenie stężenia CO2 w przestrzeni nad cieczą, a także zwiększając szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą. Ten sposób utrzymywania pH hodowli komórkowej przez zarządzanie stężeniem CO2 w pożywkach pozwala wyeliminować stosowanie zasady. W oparciu o wymaganie (zwiększenie lub zmniejszenie pH) stężenie CO2 w przestrzeni nad cieczą można odpowiednio zmniejszać lub zwiększać. [0111] Układ jednorazowego bioreaktora można stosować jako układ bioreaktora do wytwarzania banków komórek o wysokiej gęstości komórek, takich jak między innymi 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 macierzyste banki komórek (MCB) i robocze banki komórek (WCB). Uważa się, że proces perfuzyjny hodowli komórkowej umożliwia wytwarzanie banków komórek o wysokiej gęstości komórek w jednorazowym bioreaktorze. Podejście z dodawaniem/usuwaniem CO2 proponowane jest w celu utrzymania pH podczas opracowywania sposobu hodowli komórkowej w celu wytwarzania MCB i WCB. Oprócz podejścia z przenikaniem gazu w celu utrzymania pH, perfuzja hodowli komórkowej stwarza dodatkowe możliwości utrzymywania pH. W procesie perfuzyjnym hodowli komórkowej świeże pożywki do hodowli komórkowej są w sposób ciągły dodawane do bioreaktora, podczas gdy zużyta pożywka do hodowli jest w sposób ciągły usuwana. Perfuzja pozwala na usunięcie produktów ubocznych hodowli komórkowej, które mogą potencjalnie wpłynąć na pH hodowli komórkowej. Oprócz usuwania produktów ubocznych hodowli komórkowej, pH wchodzących świeżych pożywek do hodowli komórkowej może również zmieniać pH hodowli komórkowej. Jeśli wie się, że pH hodowli komórkowej będzie się obniżać, pH wchodzących pożywek można zwiększyć, aby zrekompensować spadek pH. Alternatywnie można również zmienić szybkość perfuzji, aby zarządzać pH hodowli. Wszystkie powyższe podejścia mają wpływ na pH, ale najważniejszym czynnikiem, który wpłynie na pH, jest sposób z przenikaniem CO2. Przenikanie CO2 jest również bardziej niezawodnym podejściem, ponieważ natężeniem przepływu gazu i uzupełnianiem CO2 w jednorazowym bioreaktorze można skutecznie sterować bez wielu problemów. [0112] Podczas naszych początkowych prób hodowania komórek CHO w WAVE Bioreactor? bez regulowania pH i DO na zasadzie sprzężenia zwrotnego zidentyfikowano kilka wyzwań (Figura 5): (1) powolny wzrost podczas etapu hodowli okresowej (dni 0?6) w przybliżeniu 0,3 doby-1; (2) stopniowo spowalniający wzrost podczas etapu hodowli perfuzyjnej (od 6 dnia), malejący od około 0,5 doby-1 przez pierwsze 3 dni do mniej niż 0,3 doby-1 później; (3) początkowe pH hodowli czasami przekraczało 7,3, a kolejne pH hodowli często spadało poniżej pH 6,8; i (4) poziomy DO były często poniżej 20% nasycenia powietrza po rozpoczęciu perfuzji w dniu 6. Napotkano te same wyzwania, stosując linie komórkowe CHO wytwarzające inne MAb (danych nie pokazano). Powolny wzrost w hodowli okresowej przypisano wysokiemu początkowemu pH, a spadek szybkości wzrostu w hodowli perfuzyjnej spadkowi pH i DO. [0113] W przypadku braku regulowania pH na zasadzie sprzężenia zwrotnego w WAVE Bioreactor?, pH w tych hodowlach buforowanych wodorowęglanem powinno zależeć od zawartości CO2 w przestrzeni nad cieczą Cellbag?. Pomimo obecności buforów, wodorowęglanowego i HEPES, w pożywce, pH hodowli powinno ostatecznie spadać z czasem w wyniku gromadzenia się mleczanu. Aby utrzymać pH hodowli w naszym pożądanym zakresie 6,8?7,2, naszą strategią było manipulowanie stężeniem CO2 w Cellbag?. Można byłoby zwiększyć przenikanie CO2 do pożywki, aby obniżyć pH podczas wczesnych etapów hodowli okresowej. Odwrotnie, można byłoby odpędzić CO2 z pożywki w celu zwiększenia pH podczas późniejszych etapów hodowli okresowej lub perfuzyjnej. W przypadku braku regulowania DO na zasadzie sprzężenia zwrotnego w WAVE Bioreactor?, poziomy DO powinny spadać wraz ze wzrostem gęstości komórek. Aby utrzymać DO >20% nasycenia powietrza, można byłoby zwiększyć przenikanie O2 do hodowli przez zwiększenie objętościowego współczynnika przenikania tlenu (kLa) dla układu WAVE Bioreactor? i przez uzupełnianie gazu wlotowego O2. B. Materiały i metody: 1. Linie komórkowe CHO i pożywka hodowlana [0114] Wszystkie linie komórkowe stosowane w Przykładach pochodziły z gospodarza CHO z niedoborem reduktazy dihydrofolianowej (DHFR-) przystosowanego do wzrostu w hodowli zawiesinowej bez surowicy. Każdą linię komórkową wytwarzającą specyficzne przeciwciało monoklonalne (MAb) wytworzono przez transfekcję gospodarza DHFR- plazmidem DNA kodującym geny dla DHFR, łańcucha lekkiego (LC) MAb i łańcucha ciężkiego (HC) MAb. Stabilnie transfekowane komórki następnie utrzymywano przez pasażo- 15 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 wanie co 2-5 dni w zastrzeżonych, zdefiniowanych chemicznie, selektywnych pożywkach zawierających metotreksat. Tę samą pożywkę - zawierającą 1,0 g/l Pluronic F-68, 2,44 g/l wodorowęglanu sodu i 15 mM HEPES, oprócz zastrzeżonej mieszanki składników odżywczych - stosowano do hodowli komórek w WAVE Bioreactor? zarówno w trybie okresowym, jak i perfuzyjnym. 2. Układ WAVE Bioreactor? [0115] Układ WAVE Bioreactor? (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) - stosowany do hodowli komórek CHO w trybie okresowym lub perfuzyjnym - składał się z kołyszącej się platformy, jednostki sterującej oraz wstępnie sterylizowanego, elastycznego i jednorazowego worka z filtrami gazu wlotowego i wylotowego, i wieloma otworami do próbkowania (Singh, 1999; Tang i in., 2007). Każdy układ był wyposażony w podkładkę grzewczą i skrzynię do mieszania gazów, aby zapewnić odpowiednio regulowanie temperatury i wymagany skład gazu wlotowego (O2 i/lub CO2 zmieszane z powietrzem). Wszystkie doświadczenia z hodowlą komórkową prowadzono przy użyciu 50 l Cellbag? przy roboczej objętości 6 lub 20 l, wartości zadanej temperatury 37°C, szybkości kołysania 19-25 obr/min i kącie kołysania 8-12°. W WAVE Bioreactor? nie zainstalowano sond pH lub DO online; zamiast tego zbadano różne strategie mieszania gazów i natężenia przepływu gazu pod kątem ich zdolności do utrzymywania pH hodowli i poziomów DO w docelowym zakresie. 3. Hodowla okresowa w WAVE Bioreactor? [0116] Hodowlę okresową zapoczątkowano przy 6 l w WAVE Bioreactor? przez zaszczepienie zwykłego lub perfuzyjnego Cellbag? ~7,5 × 105 komórek/ml. Kilka dni po zaszczepieniu, gdy w hodowli nagromadziła się wystarczająca masa komórek, dodano świeżą pożywkę, aby zwiększyć roboczą objętość do 20 l. Dla każdego pasażu hodowlę utrzymywano przez 2-5 dni w trybie okresowym. 4. Hodowla perfuzyjna w WAVE Bioreactor? [0117] O ile nie podano inaczej, hodowlę perfuzyjną zainicjowano po tym, jak w hodowli nagromadziła się wystarczająca masa komórek przy 20 l roboczej objętości w perfuzyjnym Cellbag?, z szybkością kołysania 23 obr/min i kątem kołysania 10°, i szybkością perfuzji wynoszącą 1 roboczą objętość na dobę. Urządzenie do zatrzymywania komórek w perfuzyjnym Cellbag? składało się z filtra, który unosił się na powierzchni cieczy podczas procesu hodowli (Tang i in., 2007). Filtr perfuzyjny zatrzymywał komórki w Cellbag? podczas dodawania świeżej pożywki i usuwania filtratu w sposób ciągły. Stałą objętość utrzymywano w perfuzyjnym WAVE Bioreactor? przez dopasowanie szybkości dodawania świeżej pożywki do szybkości usuwania filtratu wynoszącej jedną roboczą objętość na dobę. 5. Hodowle w bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem [0118] Aby porównać sprawność między hodowlami w WAVE Bioreactor? i bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem, komórki z tej samej linii siewnej zaszczepiono zarówno w bioreaktorze WAVE Bioreactor?, jak i w 20 l bioreaktorze ze stali nierdzewnej (Applikon, Foster City, CA, USA) przy ~7,5 × 105 komórek/ml. Komórki najpierw hodowano w trybie okresowym, a następnie rozpoczęto perfuzję po nagromadzeniu wystarczającej masy komórek. Robocza objętość wynosiła 7 l w trybie okresowym i 15 l w trybie perfuzji w bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem. Temperaturę hodowli, DO i mieszanie utrzymywano na wartościach zadanych wynoszących odpowiednio 37°C, 30% nasycenia powietrza i 125 obr/min. pH hodowli utrzymywano przy 7,15, z martwą strefą 0,03, przez dodawanie 1 M węglanu sodu w celu zwiększenia pH lub przepuszczanie gazowego CO2 pęcherzykami w celu obniżenia pH. Podczas operacji perfuzji stosowano układ wirówki Centritech (Centritech AB, Norsborg, Szwecja) do oddzielania komórek od pożywki wzrostowej; komórki zatrzymywano w wirówce i zawracano do bioreaktora, podczas gdy supernatant usuwano (Johnson i in., 1996). Stałą objętość utrzymywano w bioreaktorze przez dopasowanie szybkości dodawania świeżej pożywki do szybkości usuwania supernatantu wynoszącej jedną roboczą objętość na dobę. 6. Analizy próbek off-line 16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [0119] Z hodowli pobrano próbki i analizowano je pod kątem stężenia żywych komórek (VCC) i żywotności (Vi-Cell AS, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA), a także pod kątem pH, DO, pCO2, glukozy i mleczanu (Bioprofile 400, Nova Biomedical, Waltham, MA, USA). Przykład 1: Badania bez komórek: pomiary przenikania gazu [0120] Charakterystyka przenikania gazu w Cellbag? wpływa na wydajność hodowli ze względu na jej wpływ na poziomy DO i pH. Jako pierwszy krok w kierunku utrzymania pH i DO w pożądanych zakresach, przeprowadzono badania bez komórek w Cellbag? w celu pomiaru przenikania O2 i CO2. A. Badania przenikania O2 [0121] Przenikanie O2 w 50 l Cellbag? scharakteryzowano przy użyciu symulowanej pożywki hodowlanej przez obliczenie objętościowego współczynnika przenikania O2 (kLa) przy różnych połączeniach szybkości kołysania (20, 30 i 40 obr/min), kątów kołysania (8°, 10° i 12°) i natężeń przepływu gazu (0,1, 0,2 i 0,3 l/min). Do obliczenia kLa stosowano klasyczną dynamiczną metodę odgazowywania (Dunn i Einsele, 1975). Badaną pożywkę stosowaną do tych badań zaprojektowano tak, aby symulowała zastrzeżoną pożywkę do hodowli komórkowej: składała się ona z 1,0 g/l Pluronic F-68, 2,44 g/l wodorowęglanu sodu i 15 mM HEPES. Sondę DO OxyProbe? podłączoną do nadajnika Model 40 od tego samego producenta (Broadley-James Corporation, Irvine, Kalifornia, USA) stosowano do bezpośrednich pomiarów DO. [0122] W przygotowaniu do badania przenikania O2, po napełnieniu 50 l Cellbag? 25 l symulowanej pożywki, przez otwór wlotowy dla gazu wpuszczono azot (N2). Worek kołysano, aby ułatwić przenikanie N2 do pozorującej pożywki. Przepływ N2 do przestrzeni nad cieczą zatrzymano, gdy zawartość DO w pozorującej pożywce spadła poniżej 10% nasycenia powietrza. Po tym procesie odtleniania worek ściskano w celu odprowadzenia resztkowego N2 z przestrzeni nad cieczą. Następnie do przestrzeni nad cieczą w worku dodano sprężony gaz, minimalizując jednocześnie zakłócenia na granicy faz ciecz-gaz. Gdy tylko worek został całkowicie nadmuchany, rozpoczęto badanie przenikania O2 w określonych warunkach badania dla szybkości kołysania, kąta kołysania i natężenia przepływu gazu. Wynikowy wzrost stężenia DO zarejestrowano i użyto go do określenia kLa układu. Ponadto mierzono DO off-line co minutę przez pierwsze pięć minut, a następnie co pięć minut, aby zweryfikować dokładność odczytów DO online. [0123] Przy stałym natężeniu przepływu powietrza, zwiększenie szybkości kołysania lub kąta kołysania zwiększało kLa (Fig. 2A), prawdopodobnie przez zwiększanie pola powierzchni dla przenikania tlenu. Liczby kLa, które uzyskano przy najniższej badanej szybkości kołysania (20 obr/min) są porównywalne z tym, co inni badacze podali dla układu WAVE Bioreactor? (Mikola i in., 2007; Singh, 1999). Te liczby kLa są również porównywalne z liczbami uzyskanymi dla naszych własnych bioreaktorów zbiornikowych z mieszadłem (danych nie przedstawiono). [0124] W badaniu przenikania O2 układu WAVE Bioreactor? przy stałej szybkości kołysania 20 obr/min, zwiększenie natężenia przepływu powietrza z 0,01 vvm do 0,05 vvm, zwiększyło kLa od ~2 h-1 do ~3 h-1 w skali 2 l, a zwiększenie natężenia przepływu powietrza od 0,01 vvm do 0,1 vvm zwiększyło kLa od ~0,5 h-1 do ~3 h-1 w skali 20 l (Singh, 1999). Natomiast w naszym badaniu w skali 50 l zwiększenie natężenia przepływu powietrza od 0 vvm do 0,02 vvm przy dwóch różnych połączeniach szybkości kołysania i kąta kołysania nie zwiększyło kLa (Fig. 2B). Maksymalne stosowane natężenia przepływu powietrza mogły być zbyt niskie, aby wpływać na ruchliwość cieczy na granicy faz gaz-ciecz z jakimkolwiek znaczącym wpływem na kLa. [0125] Zdolność do przenikania tlenu w 50 l jednorazowym worku oceniono przez określenie współczynnika przenikania masy, kLa. Fig. 2C przedstawia stężenie DO w czasie dla stałego natężenia przepływu gazu, a Fig. 2D przedstawia wpływ natężenia przepływu gazu na ilość rozpuszczonego tlenu. W agresywnych warunkach kołysania (większa szybkość 17 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 kołysania i kąt kołysania) współczynnik przenikania masy jest duży. Nieoczekiwanie, szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą nie ma jednak wpływu na kLa w odniesieniu do przenikania tlenu. Symulowaną pożywkę odtleniono przed rozpoczęciem doświadczenia. Stężenie tlenu w gazie było większe niż stężenie tlenu w symulowanej pożywce. W związku z tym tlen przenikał z fazy gazowej do fazy ciekłej. Przy agresywnych warunkach kołysania granica faz gaz-ciecz zwiększa się z powodu większej liczby powstających fal (określa się to tu jako obecność dynamicznej granicy faz). Ten wzrost pola powierzchni wydaje się powodować dużą szybkość przenikania tlenu. Gdy natężenie przepływu gazu zwiększa się lub zmniejsza, odpowiednio zmienia się szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą. Zmiana szybkości usuwania dla przestrzeni nad cieczą nie zmienia różnicowego stężenia tlenu między fazą gazową a ciekłą. Dlatego wydaje się, że natężenie przepływu gazu nie ma wpływu na współczynnik przenikania masy dla tlenu. Gdy stężenie tlenu w symulowanej pożywce jest równe stężeniu w przestrzeni nad cieczą, przenikanie tlenu zatrzyma się. B. Badania przenikania CO2 [0126] Po odtlenieniu symulowanej pożywki sposobem stosowanym dla badań przenikania O2, CO2 dostarczano do Cellbag? przez ten sam otwór wlotowy, który służył do dostarczania N2. Dostarczanie CO2 zatrzymano, gdy sonda pH online wskazała 7,0, a przestrzeń nad cieczą oczyszczono przy użyciu tej samej metody opisanej w badaniach przenikania O2. Kiedy worek całkowicie nadmuchano, rozpoczęto badanie przenikania CO2 w określonych warunkach badania dla szybkości kołysania, kąta kołysania i natężenia przepływu gazu. Wynikowy wzrost pH zarejestrowano za pomocą jednorazowej sondy pH online podłączonej do przetwornika pH20 dostarczonego przez tego samego producenta (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). pH rosło, ponieważ CO2 był odpędzany z symulowanej pożywki opartej na wodorowęglanie. Aby zweryfikować dokładność odczytów pH online, mierzono pH offline w symulowanej pożywce co minutę przez pierwsze pięć minut, a następnie co pięć minut. Przez wykreślenie pomiarów pH online w czasie, nachylenie linii najlepszego dopasowania dostarczyło szybkość zmiany pH, a tym samym wskazało szybkość przenikania CO2 z symulowanej pożywki do przestrzeni nad cieczą w Cellbag?. [0127] Chociaż inni badacze scharakteryzowali przenikanie O2 w WAVE Bioreactor? (Mikola i in., 2007; Singh, 1999), nie znaleziono doniesień na temat przenikania CO2 w układach hodowli komórkowej z mieszaniem typu wave. Aby scharakteryzować przenikanie CO2 w WAVE Bioreactor?, stosowano symulowaną pożywkę zawierającą wodorowęglan sodu w takim samym stężeniu (2,44 g/l) jak w naszej pożywce do hodowli komórkowej. W tym buforowanym wodorowęglanem układzie bez komórek, usuwanie CO2 z fazy ciekłej zwiększyłoby pH układu przy braku aktywnej regulacji pH. Zamiast polegać na sondach CO2 do bezpośrednich pomiarów CO2 w symulowanej pożywce, stosowano profil pH z sondy pH online w WAVE Bioreactor?, aby ocenić względną szybkość odpędzania CO2. [0128] W tym badaniu profil pH w WAVE Bioreactor? podzielił się na dwie fazy (Fig. 3A i 3B). W pierwszej fazie pH gwałtownie rosło między 0 a 5 minut o ~1-4 jednostki pH na godzinę. W drugiej fazie pH rosło bardziej stopniowo od 5 do 60 minut o <0,5 jednostki pH na godzinę. Podczas tej drugiej fazy (5-60 minut) różne szybkości kołysania i kąty kołysania miały pomijalny wpływ na szybkość wzrostu pH: przy stałym natężeniu przepływu powietrza wynoszącym 0,2 l/min, pH wzrastało o 0,2 jednostki na godzinę, niezależnie od warunków kołysania (Figura 3A). W przeciwieństwie do tego, wyższe natężenia przepływu powietrza zwiększyły szybkość zmiany pH podczas tej drugiej fazy (5-60 minut): gdy natężenie przepływu powietrza wzrosło z 0 l/min do 0,6 l/min, szybkość zmiany pH wzrosła z 00,1 jednostki na godzinę do 0,4 jednostki na godzinę (Figura 3B). Przy braku przepływu powietrza (0 l/min) minimalny wzrost pH (?0,1 jednostki na godzinę) obserwowany podczas drugiej fazy (5-60 minut) sugeruje, że wymiana CO2 między symulowaną pożywką a przestrzenią nad cieczą w Cellbag? zbliżyła się do równowagi w ciągu około 5 minut. Aby osiągnąć dodatkowy wzrost pH poza pierwsze 5 minut, można zwiększyć siłę napędową odpędzania CO2 przez zwiększenie natężenia przepływu powietrza, zwiększając szybkość 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 usuwania dla przestrzeni nad cieczą, a tym samym zminimalizować stężenie CO2 w przestrzeni nad cieczą. [0129] Fig. 3C przedstawia obliczoną szybkość zmiany pH dla danych z Fig. 3A. Fig. 3D przedstawia obliczoną szybkość zmiany pH dla danych z Fig. 3B. Profil dwufazowy może być wyjaśniony wysokimi szybkościami przenikania gazu powodowanymi zarówno przez duże pole powierzchni fal, jak i ciągłe przemiatanie przestrzeni nad cieczą przez wchodzący gaz. Duże pole powierzchni ułatwia szybkie przenikanie CO2 między fazą gazową a fazą ciekłą. Szybkie przenikanie jest wynikiem różnicy stężenia CO2 między fazą gazową a ciekłą. Ta różnica stężeń była największa na początku doświadczenia i ta różnica zmniejszała się w sposób ciągły wraz z większą przenikającą ilością CO2 z fazy ciekłej do fazy gazowej. Gdy malała różnica stężeń CO2 między fazą gazową a ciekłą, zmniejszała się również szybkość zmiany pH. Na Fig. 3A, szybkość zmiany pH była bardzo duża dla pierwszej fazy (05 minut) w porównaniu z drugą fazą (5-60 minut). Natężenie przepływu gazu utrzymywano na tym samym poziomie w przypadkach pokazanych na Fig. 3A. Po początkowym przenikaniu CO2, szybkość przenikania CO2 zależy od stężenia CO2 w przestrzeni nad cieczą. Dla tej samej szybkości usuwania dla przestrzeni nad cieczą szybkość zmiany pH po pierwszych 5 minutach była taka sama niezależnie od warunków kołysania. Obliczoną wartość szybkości zmiany pH pokazano na Fig. 3C. [0130] Gdy zmieniło się natężenie przepływu gazu, zmieniła się również szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą. Dane dotyczące wzrostu pH dla różnych natężeń przepływu gazu pokazano na Fig. 3B. W tych przypadkach zaobserwowano także profil dwufazowy. Jednak między przypadkami o takim samym natężeniu przepływu gazu a przypadkami, w których natężenie przepływu gazu było zmienne, różnica polega na tym, że szybkość zmiany pH w drugiej fazie (5-60 minut) zmieniała się w zależności od natężenia przepływu gazu w porównaniu z tym, że była podobna w przypadkach o takim samym natężeniu przepływu gazu. Ponieważ zmiana natężenia przepływu gazu zmienia szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą, CO2 w przestrzeni nad cieczą był usuwany z różną szybkością. [0131] Początkowe szybkie przenikanie gazu wynika z właściwości jednorazowego worka dotyczącej tworzenia dużego pola powierzchni. To początkowe przenikanie gazu zależy głównie od warunków kołysania (szybkość kołysania i kąt kołysania). Jednak długotrwałe usuwanie CO2 z pożywki zależy od stężenia CO2 w przestrzeni nad cieczą. Szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą zależy od natężenia przepływu gazu. Przykład 2: Badania charakterystyki wzrostu komórek A. Hodowle okresowe 1. Doświadczenie początkowe Pożywka do hodowli komórkowej: [0132] Do hodowli komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) stosowano pożywkę bez surowicy do hodowli komórkowej. Pożywkę do hodowli komórkowej uzyskano z mieszaniny 1:1 pożywek na bazie DMEM i F-12 Hama przez modyfikację pewnych składników, takich jak aminokwasy, sole, cukier i witaminy. W tej pożywce brakuje glicyny, hipoksantyny i tymidyny. Pożywka składała się z 15 mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy) i 2,44 g/l wodorowęglanu sodu. Stężenie tych soli można modyfikować. Pożywkę uzupełniono pierwiastkami śladowymi, rekombinowaną ludzką insuliną i środkiem ochronnym dla komórek, Lutrol F-68 Prill (można stosować odpowiednik). Hodowla komórek ssaków: [0133] Transfekowane komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) hodowano z banku w fiolkach 1 ml lub 10 ml przechowywanego w ciekłym azocie. Wybraną zamrożoną fiolkę rozmrożono w pożywce hodowlanej zawierającej wodorowęglan sodu w bioreaktorze typu spinner flask, kolbie do wytrząsania lub bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem. Komórki pasażowano co 2-7 dni. Hodowla ta była nazywana ?linią siewną?. Komórki z linii siewnej przeniesiono do jednorazowego worka, aby zainicjować hodowlę komórkową w jednorazowym worku. 19 5 10 15 20 25 Analiza: [0134] Analizator do gazometrii (NOVA BioProfile? 400) stosowano do analizy off-line. Odczyn pH hodowli komórkowej, ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego tlenu i CO2, stężenie glukozy, mleczanu i amoniaku mierzono za pomocą tego analizatora offline. Pomiary żywotności komórek i stężenia żywych komórek (VCC) wykonano przy użyciu ViCell? AS lub ViCell? XR z Beckman-Coulter. Oprócz pomiarów stężenia komórek mierzono również ilość biomasy, rejestrując procentową łączną objętość komórek (% PCV). Przykład 3: Szczegółowa analiza z użyciem kilku linii komórkowych CHO A. Proces okresowy: [0135] Obniżając stężenie CO2 w gazie dostarczanym do Cellbag? podczas hodowli okresowej, powinno być się w stanie obniżyć początkowe wysokie pH (>7,3) i zminimalizować późniejsze obniżenie pH w układzie WAVE Bioreactor?. Po zbadaniu różnych strategii osłony gazowej z CO2 w hodowlach okresowych WAVE Bioreactor? przy użyciu kilku linii komórkowych CHO (danych nie pokazano), zdefiniowano etapową strategię ?8-5-2? zarówno dla etapu zaszczepiania, jak i zwiększania skali: powietrze pompowane do Cellbag? było uzupełniane gazowym CO2 w stężeniu 8% (obj./obj.) w pierwszym dniu, 5% (obj./obj.) w drugim dniu, a później 2% (obj./obj.). [0136] W oparciu o wyniki badań bez komórek wybrano następującą szybkość kołysania, kąt kołysania i natężenie przepływu powietrza jako wartości zadane procesu dla naszych hodowli okresowych WAVE Bioreactor?: 21 obr/min, kąt kołysania 10° i 0,2 l/min dla zaszczepienia; 23 obr/min, kąt kołysania 10° i 0,2 l/min dla etapu zwiększania skali. Aby zbadać niezawodność tych wartości zadanych procesu, zaprojektowano doświadczenie pełnoczynnikowe (Tabela 1). Gdy warunki procesu odbiegały od punktów środkowych, obserwowano pomijalny wpływ na wzrost komórek i profile pCO2, a pH hodowli pozostawało w zakresie 6,8?7,2, zaś DO >50% dla obu badanych linii komórkowych (Fig. 4). Tabela 1. Warunki badane w hodowlach okresowych WAVE Bioreactor? dla linii komórkowych wytwarzających MAb B i MAb C (Fig. 4). Doświadczenie pełnoczynnikowe zaplanowano wokół trzech parametrów procesu - szybkości kołysania, kąta kołysania i natężenia przepływu powietrza do przestrzeni nad cieczą - zarówno dla etapu zaszczepiania, jak i zwiększania skali w hodowli okresowej. Zaszczepianie Zwiększanie skali Symbol SzybKąt Natężenie Symbol SzybKąt Natężenie kość ko- koły- przepływu pokość ko- koły- przepływu połysania sania wietrza do łysania sania wietrza do (obr (°) przestrzeni (obr (°) przestrzeni nad cieczą nad cieczą /min) /min) (l/min) (l/min) 19 8 0,1 21 8 0,1 19 12 0,1 21 12 0,1 19 8 0,3 21 8 0,3 19 12 0,3 21 12 0,3 23 8 0,1 25 8 0,1 23 12 0,1 25 12 0,1 23 8 0,3 25 8 0,3 23 12 0,3 25 12 0,3 21 10 0,2 23 10 0,2 20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 B. Hodowle perfuzyjne [0137] W naszych początkowych próbach hodowli perfuzyjnej w WAVE Bioreactor?, pH hodowli zwykle spadało poniżej 6,8, a DO często spadało poniżej 30% nasycenia powietrza po rozpoczęciu perfuzji w dniu 6 (Fig. 5). Aby zminimalizować spadek pH bez zwiększania szybkości perfuzji, zbadano wykonalność zwiększenia natężenia przepływu powietrza do Cellbag?, ponieważ badania przenikania gazu bez komórek wykazały, że zwiększone natężenie przepływu powietrza zwiększa pH (Fig. 3). Aby przezwyciężyć spadek DO, uzupełniono strumień powietrza do Cellbag? 30% O2 (obj./obj.) dwa dni po rozpoczęciu perfuzji. Wybrano ten czas, ponieważ zbiegał się on z wcześniej obserwowanym spadkiem DO (Fig. 5). Przykład 4: Proces okresowo-perfuzyjny [0138] Ten proces perfuzyjny składał się z dwóch etapów okresowych, po których następował etap perfuzji. Jednorazowy 50 l worek zaszczepiono przy objętości roboczej 6 l, przy docelowej gęstości komórek od 5 do 7,5 x 105 komórek/ml w etapie zaszczepiania. Trzy dni po zaszczepieniu dodano świeże pożywki, aby zwiększyć objętość jednorazowego worka do 20 l na etapie zwiększania skali. Etap zaszczepiania i etap zwiększania skali stanowiły etapy okresowe. Stosowano strategię stopniowego obniżania CO2 w etapach okresowych, jak opisano dla procesu okresowego. Pod koniec 3-dniowego etapu zwiększania skali rozpoczęto perfuzję. Świeżą pożywkę dodawano w sposób ciągły do jednorazowego worka, a zużytą pożywkę hodowlaną usuwano w sposób ciągły z jednorazowego worka, zatrzymując komórki. Pożywkę do hodowli komórkowej perfundowano z szybkością 20 litrów na dobę (1 objętość na dobę). Wartość zadana pH pożywki perfuzyjnej wynosiła 7,2 jednostki. Na początku perfuzji, stężenie CO2 we wchodzącym gazie ustawiono na zero. Szybkość usuwania dla przestrzeni nad cieczą zwiększono, aby ułatwić usuwanie CO2. Zwiększenie szybkości usuwania dla przestrzeni nad cieczą następowało zgodnie z jednoetapowym zwiększaniem albo wieloetapowym zwiększaniem, jak pokazano na Fig. 7. Zakres szybkości kołysania wynosił między 19 a 25 obr/min. Zakres kąta kołysania wynosił między 8 a 12 stopni. Utrzymywano temperaturę 37°C. Tlen uzupełniono 48 godzin po rozpoczęciu perfuzji, aby zaspokoić zapotrzebowanie komórek na tlen. Stężenie tlenu we wchodzącym gazie ustawiono na 30% po 48 godzinach od rozpoczęcia perfuzji. [0139] Fig. 6 przedstawia sprawność hodowli komórkowej dla procesu okresowo-perfuzyjnego (etap okresowy (dni 0?6) i etap perfuzji (dni 6-14)) (Fig. 6A). Fig. 6B przedstawia % żywotności komórek. Fig. 7A przedstawia wartości zadane szybkości usuwania dla przestrzeni nad cieczą dla trzech różnych doświadczeń. Wartości zadane szybkości usuwania dla przestrzeni nad cieczą dla etapu perfuzji były zgodne z różnymi profilami (dni 6-14): (1) dwie stałe szybkości usuwania dla przestrzeni nad cieczą: 0,02 hvm (-?-) i 0,1 hvm (?); i (2) etapowy wzrost szybkości usuwania dla przestrzeni nad cieczą: 0,007 hvm do 0,013 hvm do 0,02 hvm (-?-). Badano zarówno wzrost jednoetapowy, jak i wieloetapowy. Fig. 7B przedstawia stężenie offline rozpuszczonego CO2. Fig. 6D pokazuje wzrost komórek pod względem liczby żywych komórek (VCC). Legenda dla Fig. 6 i 7: ?, ?, ? pokazują trzy różne serie. Jak pokazano na Fig. 6C, pH można utrzymywać w pożądanym zakresie przez modulację CO2 za pomocą usuwania dla przestrzeni nad cieczą. Przykład 5: Zachowanie sześciu linii komórkowych CHO w warunkach ?8?5?2? [0140] Aby zbadać niezawodność tego sposobu z WAVE Bioreactor? w podtrzymywaniu wzrostu komórek i utrzymywaniu pH i DO w pożądanych zakresach, wybrano sześć linii komórkowych, które pokrywają zakres wzrostu komórek i zachowań metabolicznych zwykle obserwowanych dla naszych własnych linii komórkowych CHO. [0141] Dzięki zoptymalizowanym warunkom procesu wszystkie sześć linii komórkowych rosło z dużą żywotnością we wszystkich etapach hodowli okresowej i perfuzyjnej (Fig. 8). We wszystkich przypadkach pH pozostawało w pożądanym zakresie 6,8?7,2, a DO przekraczało 20% nasycenia powietrza. Przykład 6: Porównanie między sposobem ?8-5-2? z WAVE Bioreactor? a konwencjonalnymi hodowlami w bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem 21 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [0142] Aby porównać sprawność hodowli między wynalazczym sposobem z WAVE Bioreactor? a sposobem z bioreaktorem zbiornikowym z mieszadłem z regulacją pH i DO, przeprowadzono równoległe hodowle w obu układach (Fig. 9). Profile wzrostu i żywotności były podobne między dwoma układami bioreaktorów: szybkości wzrostu w WAVE Bioreactor? i w bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem były porównywalne przy ~0,5 doby-1. Pomimo braku regulowania pH i DO na zasadzie sprzężenia zwrotnego online w układzie WAVE Bioreactor?, profile pH i DO nie różniły się znacząco między dwiema hodowlami w bioreaktorze. [0143] Wynalazek dostarcza sposób sterowania procesem dla utrzymywania pH hodowli w zakresie 6,8-7,2 oraz DO >20% nasycenia powietrza w układzie WAVE Bioreactor? działającym zarówno w trybie okresowym, jak i perfuzyjnym - bez polegania na regulacji pH i DO na zasadzie sprzężenia zwrotnego. Po zidentyfikowaniu wyzwań związanych z hodowaniem komórek CHO w układzie WAVE Bioreactor? bez regulowania pH i DO, przeprowadzono badania bez komórek, aby określić wpływ szybkości kołysania, kąta kołysania i natężenia przepływu gazu na przenikanie O2 i CO2 w układzie WAVE Bioreactor?. Dostosowując te parametry procesu wraz ze stężeniem CO2 i O2 w gazie wlotowym, utrzymywano pH i DO hodowli w naszym pożądanym zakresie dla hodowli okresowych i perfuzyjnych sześciu rekombinowanych linii komórkowych CHO. Eliminując potrzebę stosowania sond pH i DO, proces ten dostarcza prostszy i bardziej opłacalny sposób hodowli komórek w układzie WAVE Bioreactor?. Dostarcza również alternatywny sposób hodowli komórek w przypadku awarii sondy pH lub DO w WAVE Bioreactors? wyposażonym w te sondy. [0144] Należy również rozumieć, że opisane tu konkretne przykłady mają jedynie charakter poglądowy i nie mają na celu ograniczenia zakresu wynalazku. Wynalazek jest ograniczony jedynie przez załączone zastrzeżenia. CYTOWANE ODNIESIENIA LITERATUROWE [0145] Cronin CN, Lim KB, Rogers J. 2007. Production of selenomethionyl-derivatized proteins in baculovirus-infected insect cells. Protein Sci 16: 2023-2029. Dunn IJ, Einsele AJ. 1975. Oxygen transfer coefficients by the dynamic model. J Appl Chem Biotechnol 25: 707-720. deZengotita VM, Schmelzer AE, Miller WM. 2002. Characterization of hybridoma cell responses to elevated pCO2 and osmolality: Intracellular pH, cell size, apoptosis, and metabolism. Biotechnol Bioeng 77: 369-380. Haldankar R, Li D, Saremi Z, Baikalov C, Deshpande R. 2006. Serum-free suspension large-scale transient transfection of CHO cells in WAVE bioreactors. Mol Biotechnol 34: 191-199. Johnson M, Lanthier S, Massie B, Lefebvre G i Kamen A. 1996. Use of the Centritech lab centrifuge for perfusion culture of hybridoma cells in protein-free medium. Biotech Prog 12: 855-864. Langheinrich C i Nienow AW. 1999. Control of pH in large-scale, free suspension animal cell bioreactors: Alkali addition and pH excursions. Biotechnol Bioeng 66: 171179. Lin A, Kimura R, Miller WM. 1993. Production of tPA in recombinant CHO cells under oxygen-limited conditions. Biotechnol Bioeng 42: 339-350. Ling WLW, Deng L, Lepore J, Cutler C, Connon-Carlson S, Wang Y, Voloch M. 2003. Improvement of monoclonal antibody production in hybridoma cells by dimethyl sulfoxide. Biotechnol Prog 19: 158-162. Link T, Bäckstrom M, Graham R, Essers R, Zörner K, Gätgens J, Burchell J, TaylorPapadimitriou J, Hansson GC, Noll T. 2004. Bioprocess development for the production of a recombinant MUC1 fusion protein expressed by CHO-K1 cells in protein-free medium. J Biotechnol 110: 51-62. 22 Miller WM, Blanch HW, Wilke CR. 1988. A kinetic analysis of hybridoma growth and metabolism in batch and continuous suspension culture: Effect of nutrient concentration, dilution rate, and pH. Biotechnol Bioeng 32: 947-965. Mikola M, Seto J, Amanullah A. 2007. Evaluation of a novel Wave Bioreactor cellbag for aerobic yeast cultivation. Bioprocess Biosyst Eng 30: 231-241. Osman JJ, Birch J, Varley J. 2001. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnol Bioeng 75: 63-73. Osman JJ, Birch J, Varley J. 2002. The response of GS-NS0 myeloma cells to single and multiple pH perturbations. Biotechnol Bioeng 79: 398-407. Rao G, Moreira A, Brorson K. 2009. Disposable bioprocessing: the future has arrived. Biotechnol Bioeng 102: 348-356. Restelli V, Wang MD, Huzel N, Ethier M, Perreault H, Butler M. 2006. The effect of dissolved oxygen on the production and glycosylation profile of recombinant human erythropoietin produced from CHO cells. Biotechnol Bioeng 94: 481-494. Royce PNC, Thornhill NF. 1991. Estimation of dissolved carbon dioxide concentrations in aerobic fermentations. AIChE J 37L 1680-1686. Singh V. 1999. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation. Cytotechnology 30: 149-158. Tang YJ, Ohashi R, Hamel JFP. 2007. Perfusion culture of hybridoma cells for hyperproduction of IgG2a monoclonal antibody in a Wave bioreactor-perfusion culture system. Biotechnol Prog 23: 255-264. 5 10 15 20 Zastrzeżenia patentowe 1. 25 30 35 2. 40 3. 4. 45 5. 6. Sposób hodowli okresowej komórek eukariotycznych obejmujący: dostarczanie materiału zaszczepiającego do hodowli komórkowej zawierającego komórki eukariotyczne w cieczy hodowlanej zawierającej wodorowęglan do naczynia, przy czym wspomniane naczynie ma ściany, które otaczają wspomnianą hodowlę komórkową i przestrzeń z fazą gazową nad cieczą nad wspomnianą hodowlą komórkową, i przy czym wspomniane naczynie zawiera co najmniej jeden otwór, który zapewnia wejście i wyjście gazu do i ze wspomnianej przestrzeni nad cieczą; mieszanie zawartości wspomnianego naczynia; i dostarczanie gazu do wspomnianej przestrzeni nad cieczą przez wspomniany otwór, przy czym wspomniany gaz zawiera pewną ilość CO2 i przy czym wspomnianą ilość CO2 we wspomnianym gazie moduluje się w czasie w celu dostosowania pH wspomnianej hodowli komórkowej w celu utrzymania określonego z góry pH wspomnianej hodowli komórkowej, przy czym wspomniany CO2 jest dostarczany w ilości 8% (obj./obj.) wspomnianego gazu w dniu 1, w ilości 5% (obj./obj.) wspomnianego gazu w dniu 2 i w ilości 2% (obj./obj.) wspomnianego gazu później. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym wspomniane mieszanie polega na kołysaniu wspomnianego naczynia przy szybkości kołysania 15 do 30 obr/min i kącie kołysania 5° do 15°. Sposób według zastrzeżenia 2, w którym szybkość kołysania wynosi między 19 a 25 obr/min, a kąt kołysania wynosi między 8° a 12°. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym szybkość usuwania wspomnianego gazu wynosi między 0,002 a 0,1 objętości przestrzeni nad cieczą na minutę (hvm). Sposób według zastrzeżenia 4, w którym szybkość usuwania wspomnianego gazu wynosi między 0,007 a 0,08 hvm. Sposób według zastrzeżenia 5, w którym szybkość usuwania wspomnianego gazu wynosi między 0,007 a 0,02 hvm. 23 7. 8. 5 9. 10. 10 11. 12. 15 13. 14. 20 15. 16. 25 Sposób według zastrzeżenia 1, w którym wspomnianymi komórkami eukariotycznymi są komórki kręgowców. Sposób według zastrzeżenia 7, w którym wspomniane komórki kręgowców są wybrane z grupy obejmującej komórki żab, komórki królików, komórki gryzoni, komórki owiec, komórki kóz, komórki psów, komórki kotów, komórki krów, komórki koni, komórki naczelnych innych niż ludzie i komórki ludzkie. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym wspomnianym naczyniem jest sztywny pojemnik. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym wspomnianym naczyniem jest giętki pojemnik. Sposób według zastrzeżenia 10, w którym wspomnianym naczyniem jest jednorazowy worek hodowlany. Sposób według zastrzeżenia 1, obejmujący ponadto nieciągłe monitorowanie pH hodowli komórkowej. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym wspomniany gaz jest dostarczany do wspomnianej przestrzeni nad cieczą tak, że w hodowli komórkowej utrzymuje się ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 na poziomie około 1 do 200 mmHg. Sposób według zastrzeżenia 13, w którym wspomniany gaz jest dostarczany do wspomnianej przestrzeni nad cieczą tak, że w hodowli komórkowej utrzymuje się ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 na poziomie około 10 do 150 mmHg. Sposób według zastrzeżenia 14, w którym wspomniany gaz jest dostarczany do wspomnianej przestrzeni nad cieczą tak, że w hodowli komórkowej utrzymuje się ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 na poziomie około 20 do 120 mmHg. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym wspomniany gaz jest dostarczany do wspomnianej przestrzeni nad cieczą tak, że w hodowli komórkowej utrzymuje się ciśnienie cząstkowe rozpuszczonego CO2 na poziomie około 20 do 80 mmHg. 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41









































Grupy dyskusyjne